Name: Bestimmung von Gesamtlipid und Lipidklassen in marinen Proben (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-12-11T13:00:00.000+00:00
Duration: 14 min 59 s
Description: Lernen Sie die Extraktion und Analyse von marinen Lipiden aus Meerwasser und biologischen Proben mit TLC-FID. Diese Methode ermöglicht die schnelle Quantifizierung von Lipidklassen für ökologische und biogeochemische Forschung.

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Diese Forschung wurde von der Fördernummer des Natural Sciences and Engineering Research Council of Canada (NSERC) 105379 an C.C. Parrish finanziert. Das Core Research Equipment & Instrument Training (CREAIT) Network der Memorial University half bei der Finanzierung dieser Publikation.

HINWEIS: Um Glaswaren, Instrumente und Filter für Lipidanalysen zu reinigen, waschen Sie sie 3 Mal mit Methanol, gefolgt von 3 Wäschen mit Chloroform, oder erhitzen Sie sie mindestens 8 Stunden lang auf 450 ° C.
1. Filtrationsverfahren für gelöstes Meerwasser und partikuläre Lipide
HINWEIS: Der jeweilige Zinsanteil wird operativ durch das Filtrationsverfahren definiert. In diesem Fall beträgt die Porengröße 1,2 μm.
<ol><li>Stellen Sie den Filterverteiler ohne Filter auf und spülen Sie den Aufbau mit gefiltertem Meerwasser ab.</li>
	<li>Legen Sie mit einer sauberen Pinzette einen 47 mm Glasfaserfilter (GF/C), der gewaschen wurde, in das saubere Filtersystem.</li>
	<li>Nehmen Sie die Probe und schwenken Sie vorsichtig, um material, das sich möglicherweise auf dem Boden des Auffangbehälters abgesetzt hat, wieder aufzunehmen. Messen Sie ein bekanntes Volumen, in diesem Fall 1 L, genau ab und filtern Sie es durch den Filter. HINWEIS: Das Volumen hängt von der Menge an Partikelmaterial in der Probe ab: in der Regel zwischen 250 ml und 5 l, abhängig von Saison und Standort.</li>
	<li>Wenn die Probe abgemessen wurde, befeuchten Sie den Filter vorsichtig mit gefiltertem Meerwasser. Geben Sie die gesamte Probe langsam in das Filtersystem und spülen Sie den Messzylinder mit gefiltertem Meerwasser ab, um sicherzustellen, dass alle Partikel dem Filter zugeführt werden. Spülen Sie das Setup mit gefiltertem Meerwasser an den Seiten ab, um sicherzustellen, dass alle Partikel auf den Filter gespült werden.<ol>
<li>Lassen Sie das gesamte Meerwasser durch den Filter passieren, aber lassen Sie den Filter nicht vollständig austrocknen, da dies die Zellen auf dem Filter stören kann. Brechen Sie die Absaugung, wenn das letzte Wasser verschwindet.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Falten Sie den Filter mit einer sauberen Pinzette und einer sauberen Pipette in zwei Hälften, dann in Dritteln und dann in halber Länge, um den Filter in ein Rohr zu rollen. Legen Sie es in eine saubere, beschriftete 10 ml Glasfläschchen.</li>
	<li>Decken Sie den Filter mit 2 ml Chloroform ab. Füllen Sie den Kopfraum mit Stickstoff und versiegeln Sie ihn mit PTFE-Klebeband. In einem Gestell in einem -20 °C Gefrierschrank aufbewahren. Die Proben werden bei dieser Temperatur bis zu einem Jahr stabil sein. HINWEIS: Um die Lipidkonzentrationen mit den Gesamtmassenkonzentrationen in Beziehung zu setzen, ist auch eine Trockengewichtsmessung erforderlich. Dazu wird ein 24 mm vorgewägter Filter in einen Trockengewichtsfiltrationsaufbau gegeben, die Probe gerührt und eine kleine Teilprobe entnommen, die auf den kleinen Filter filtriert wird. Wenn der Filter fast trocken ist, werden dem Filter etwa 10 ml 3,5% iges Ammoniumformiat zugesetzt. Der Filter wird in zwei Hälften gefaltet, in eine beschriftete Petrischale zurückgeführt und in einen Gefrierschrank gelegt.</li>
</ol>2. Flüssig-Flüssig-Extraktion von Meerwasser oder flüssigen Proben
<ol><li>
Vorbereiten der Probe
	<ol>
<li>Messen Sie ein bekanntes Filtratvolumen in einen Lipid-Reinglas-Messzylinder. Legen Sie diese Probe in einen sauberen 1 L Trenntrichter. Dann 20 ml Chloroform in die Probe geben und 2 min schütteln, wobei häufig entlüftet wird.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Entfernung des ersten Extrakts und Zugabe von Säure nach erster Trennung
	<ol>
<li>Wickeln Sie den Trichter in Aluminiumfolie und warten Sie 5 bis 10 Minuten, bis die Trennung erfolgt. Ziehen Sie den Boden der Folie zurück, um die beiden Schichten zu sehen. Sammeln Sie die untere, organische Schicht durch den Absperrhahn in einem sauberen Kolben mit rundem Boden und achten Sie darauf, dass keine der oberen Schichten enthalten ist. Den Rundkolben unter Stickstoff verschließen und in den Gefrierschrank stellen.</li>
		<li>0,25 ml konzentriertesH2SO4 für jeden Liter Probe in die Probe im Scheidetrichter geben und den Trichter vorsichtig schütteln.</li>
		<li>Fügen Sie 10 ml Chloroform hinzu und schütteln Sie 2 Minuten lang kräftig, während Sie häufig entlüften. Lass die Trennung stattfinden.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Zweite und dritte Trennung
	<ol>
<li>Warten Sie auf die Trennung, und geben Sie die unterste Schicht in den Rundkolben.</li>
		<li>Fügen Sie ein drittel 10 ml Chloroform hinzu und schütteln Sie für 2 Minuten, wieder häufig entlüften. Nach dem Trennen die unterste Schicht in den Rundkolben geben.</li>
		<li>Den Extrakt im Rundkolben in einen Rotationsverdampfer geben, verdampfen und in eine 2-ml-Durchstechflasche überführen.</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. Extraktionsprotokoll für Feststoffe (modifizierte Folch et al.3 Extraktion)
<ol><li>
Einrichtung HINWEIS: Der Extraktionsaufbau erfordert einen isolierten Behälter, der mit Eis gefüllt ist. Zu den Lösungsmitteln gehören Methanol, Chloroform extrahiertes Wasser und 2: 1 Chloroform: Methanol. Alle Lösungsmittel sollten auf Eis gelegt werden, so dass sie zum Zeitpunkt des Beginns der Extraktionen kalt sind. Die Proben gehen auch auf Eis, so dass alles kalt bleibt.<ol>
<li>Spülen Sie alle Röhrchen und PTFE-ausgekleideten Kappen 3 mal mit Methanol und dann 3 mal mit Chloroform ab. Für jede Extraktion wird ein Zentrifugenröhrchen und eine 15-ml-Durchstechflasche mit Kappe benötigt.</li>
		<li>Die Probe wird in ein Zentrifugenröhrchen mit 2 ml Chloroform gegeben. Die Größe der Probe hängt von der Menge des vorhandenen Lipids ab, etwa 5 bis 10 mg Lipid bevorzugt.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Mahlen und Extrahieren
	<ol>
<li>Fügen Sie etwa 1 ml eiskaltes Methanol hinzu und mahlen Sie die Probe mit einem sauberen Homogenisator oder PTFE / Metall-Endstab schnell zu einem Zellstoff.</li>
		<li>Waschen Sie den Stab zurück in das Röhrchen mit ca. 1 ml eiskaltem 2:1 Chloroform: Methanol und dann mit 1/2 mL eiskaltem Chloroform-extrahiertem Wasser. Verwenden Sie bei Bedarf eine saubere Pinzette, um die Partikel vor dem Waschen zurück in die Durchstechflasche zu drücken. Kappen Sie das Röhrchen und beschallen Sie die Mischung für 4 Minuten in einem Ultraschallbad (35 - 42 kHz).</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Doppelte Pipettung:Zentrifugieren Sie die Probe für 2 min bei 1800 × g. Sammeln Sie die gesamte organische Schicht (untere Schicht) mit der Doppeltpipettiertechnik, bei der eine 5 3/4 "Pipette mit der Glühbirne locker durch die beiden Schichten gedrückt wird, während die Glühbirne zusammengedrückt wird, wodurch Blasen herauskommen.<ol>
<li>Wenn der Boden der zweiten Schicht erreicht ist, verwenden Sie den Daumen, um die Glühbirne zu entfernen, ohne die organische Schicht in die Pipette zu ziehen. Legen Sie eine 9"-Pipette in die 5 3/4"-Pipette und entfernen Sie die untere Schicht durch die 5 3/4"-Pipette.</li>
		<li>Geben Sie den Extrakt in eine saubere Durchstechflasche. Entfernen Sie die untere Ebene, bis alles entfernt ist.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Waschpipetten:Spülen Sie die 9"-Pipette in die Durchstechflasche, die die organische Schicht enthält, mit 1,5 ml eiskaltem Chloroform, um die Außenseite der Pipette abzuwaschen, und 1,5 ml, um die Innenseite abzuwaschen. Drehen Sie diese Pipette vorsichtig während des Waschens und stellen Sie sicher, dass das gesamte Chloroform die Pipette hinunter in die Durchstechflasche läuft.<ol>
<li>Spülen Sie die 5 3/4 "Pipette auf die gleiche Weise in das Röhrchen, das die wässrige Schicht enthält.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Beschallen und zentrifugieren Sie die Proben und verdoppeln Sie die Pipette, wenn sie getrennt werden, wobei jedes Mal neue Pipetten verwendet werden. Wiederholen Sie dies mindestens dreimal und bündeln Sie alle organischen Schichten. Nachdem Sie die organische Schicht zum dritten Mal entfernt haben, waschen Sie beide Pipetten in die Durchstechflasche, die die organische Schicht enthält.</li>
	<li>Mit einem sanften Stickstoffstrom auf Volumen konzentrieren, dann mit PTFE-Klebeband verschließen und in einem Gefrierschrank aufbewahren.</li>
</ol>4. Entwicklung von Systemen und Schritten zur Stäbchen-TLC-Trennung mariner Lipidklassen
<ol><li>
Vorbereiten der Ruten für TLC
	<ol>
<li>Blanko-Scan der Stäbchen im automatischen FID-Scanner dreimal</li>
		<li>
Erkennen einer Probe:Tragen Sie Proben und Standards mit einer Spritze auf die Stäbchen am oder direkt unter dem Ursprung auf. Geben Sie 0,5 μL ab und berühren Sie den Tropfen zum Stab. Trocknen lassen, bevor sie den nächsten Tropfen auf die gleiche Stelle geben. Erkennen Sie alle Proben in einer Linie auf Stäben.</li>
		<li>
Fokussierung in Aceton: FokussierenSie die Proben zweimal (dreimal, wenn die Proben sehr konzentriert sind) in 70 ml Aceton. Beobachten Sie die Lösungsmittelfront, während sie auf die Stange klettert, bis die Unterseite der Stelle mit der Oberseite verschmilzt. Entfernen Sie die Stäbchen, trocknen Sie sie für etwa 5 s und wiederholen Sie dann den Vorgang, um ein schmales Band aus Lipidmaterial in der Nähe des Bodens des Stäbchens zu erzeugen.</li>
		<li>Trocknen und konditionieren Sie die Stäbchen in einer Kammer mit konstanter Luftfeuchtigkeit für 5 min. Eine Kammer mit konstanter Luftfeuchtigkeit ist ein Exsikkator mit einer gesättigten Lösung von Calciumchlorid unter der Platte.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Sequenz, die zum ersten Chromatogramm führt (Kohlenwasserstoff zu Keton)
	<ol>
<li>
Erstes Entwicklungssystem: Das erste Entwicklungssystem ist Hexan:Diethylether:Ameisensäure, 98.95:1:0.05. Verwenden Sie eine Spritze, um die Ameisensäure hinzuzufügen, aber spülen Sie zuerst die Spritze 3× mit Ameisensäure. Spülen Sie die Ameisensäure unmittelbar danach mit Chloroform aus der Spritze. Verwenden Sie 30 ml der Mischung, um das Papier zu benetzen und den Tank abzuspülen. Entsorgen Sie die Spüllösung und geben Sie die restlichen 70 ml in den Tank.<ol>
<li>Nehmen Sie die Racks und senken Sie sie vorsichtig in den Tank. Beobachten Sie, bis die Lösungsmittelfront die Probenstellen erreicht, und starten Sie dann den Timer. Nach 25 min die Stäbe aus der Entwicklungskammer entfernen, 5 min in der Kammer mit konstanter Luftfeuchtigkeit trocknen und in derselben Lösung weitere 20 min neu entwickeln.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Trocknen Sie die Stäbchen für 5 Minuten im automatischen FID-Scanner und scannen Sie dann mit einem PPS-Scan von 25 bis zum tiefsten Punkt hinter dem Keton-Peak.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Sequenz, die zum zweiten Chromatogramm führt (Triacylglycerin zu Diacylglycerin):
	<ol>
<li>Konditionieren Sie die Stäbe für 5 min in der Kammer mit konstanter Luftfeuchtigkeit.</li>
		<li>
Zweites Entwicklungssystem:Das zweite Entwicklungssystem ist Hexan:Diethylether:Ameisensäure, 79:20:1. Fügen Sie dem Entwicklungstank ~ 30 ml hinzu, um das Papier zu benetzen, und spülen Sie den Tank ab. Dann entsorgen und entwickeln Sie die Stäbchen für 40 min in den verbleibenden 70 ml. Für die beste Trennung zwischen den TAG -Peaks (gesättigt) und den TAG-Peaks (mehrfach ungesättigt) verwenden Sie eine Mischung aus 79,9:20:0,1, aber für die Trennung der ST- und DAG-Peaks verwenden Sie eine Mischung aus 79:20:1.</li>
		<li>Trocknen und scannen Sie in einem zweiten Teilscan mit einem PPS-Scan 11 bis zum tiefsten Punkt hinter dem Diacylglycerin-Peak.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Sequenz, die zum dritten Chromatogramm führt (Aceton-mobiles polares Lipid und Phospholipid)
	<ol>
<li>Konditionieren Sie die Stäbe für 5 Minuten in der Kammer mit konstanter Luftfeuchtigkeit.</li>
		<li>Entwickeln Sie die Stäbchen zweimal für 15 Minuten in 70 ml Aceton. Zwischen den Entwicklungen trocknen die Stäbe etwa 30 Sekunden an der Luft.</li>
		<li>Konditionieren Sie die Stäbe für 5 Minuten in der Kammer mit konstanter Luftfeuchtigkeit.</li>
		<li>
Drittes Entwicklungssystem:Das dritte Entwicklungssystem ist eine Mischung aus Chloroform, Methanol und Chloroform-extrahiertem Wasser, 50:40:10. Entwickeln Sie die Stäbchen zweimal für 10 Minuten in 70 ml der Mischung. Zwischen den Entwicklungen trocknen Sie die Stäbe etwa 30 Sekunden an der Luft.</li>
		<li>Trocknen und scannen Sie die gesamte Länge der Stäbchen.</li>
	</ol>
</li>
</ol>5. FAME-Derivatisierung mitH2SO4 in MeOH
<ol><li>
Herstellung des Hilditch-Reagenzes
	<ol>
<li>
Vorbereitung des Methanols:100 ml MeOH in einen sauberen Messkolben geben und dann vorsichtig mit wasserfreiem NaSO4 bestreuen, bis der Boden des Kolbens bedeckt ist. Einmal abgedeckt, zweimal invertieren, so dass das Wasser im Methanol vom NaSO4absorbiert wird. Nach dem Umkehren und Schütteln mindestens 5 Minuten ruhen lassen.</li>
		<li>
Zugabe der Säure:Das Methanol langsam in ein Glasgefäß dekantieren (inzwischen ist dasNaSO4 ein harter Klumpen im Boden des Kolbens) und dasH2SO4 wird zugegeben. Langsam 1,5 ml Schwefelsäure mit einer Pipette in das Methanol geben. Fügen Sie ein paar Tropfen auf einmal hinzu und sobald die gesamte Säure hinzugefügt wurde, schließen Sie sie ab und rühren Sie vorsichtig um, um zu mischen. Die Lösung ist jetzt bereit, für Derivate verwendet zu werden, aber sie muss wöchentlich nachgeholt werden.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Herstellung der Derivate
	<ol>
<li>Etwa 200 μg Lipide aus einer Extraktfläschchen, bei der das Volumen auf eine bekannte Menge gebracht wurde, in eine saubere, 15 ml durchführbare Durchstechflasche geben und unter Stickstoff zur Trockenheit verdampfen. Die entnommene Menge wird durch die Konzentration der Probe aus TLC/FID bestimmt. Verwenden Sie eine saubere Pipette, um die Probe zu entfernen.</li>
		<li>Wenn die Probe getrocknet ist, fügen Sie 1,5 ml Dichlormethan und 3 ml des neu hergestellten Hilditch-Reagenz hinzu.</li>
		<li>Wirbeln Sie die Probe und beschallen Sie sie in einem Ultraschallbad für 4 min, um Lipide zu entfernen, die an der Glasfläschchen haften geblieben sind. Füllen Sie die Durchstechflasche mit Stickstoff, verschließen Sie sie mit PTFE-Klebeband und erhitzen Sie sie 1 Stunde lang bei 100 ° C.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Stoppen der Reaktion
	<ol>
<li>Lassen Sie die Proben nach dem Entfernen aus dem Ofen 10 minuten lang vollständig auf Raumtemperatur abkühlen und öffnen Sie dann die Durchstechflaschen vorsichtig.</li>
		<li>Langsam etwa 0,5 ml gesättigte Natriumbicarbonatlösung (9 g/100 ml Chloroform-extrahiertes Wasser) und dann 1,5 ml Hexan zugeben. Schütteln oder wirbeln Sie die Durchstechflasche und lassen Sie sie dann stehen, so dass sie sich in 2 Schichten trennt.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Sammeln der FAME's
	<ol>
<li>
Entfernen der obersten Schicht:Sobald die Derivatisierung gestoppt wurde und eine klare Trennung vorliegt, entfernen Sie die obere, organische Phase und legen Sie sie in eine lipidreinigte 2 ml Durchstechflasche.</li>
		<li>Verdampfen Sie das Lösungsmittel in der 2-ml-Durchstechflasche auf Trockenheit und füllen Sie es mit Hexan auf ca. 0,5 ml auf.</li>
		<li>Füllen Sie den Kopfraum der Durchstechflasche mit Stickstoff, verschließen und verschließen Sie die Durchstechflasche mit PTFE-Klebeband, beschallen Sie für weitere 4 Minuten, um die Fettsäuren wieder zu suspendieren, und dann ist es bereit, zum GC zu gehen. HINWEIS: Wenn Fettsäurekonzentrationen erforderlich sind, muss die wässrige Schicht dreimal mit Hexan gewaschen und alle organischen Schichten in der 2-ml-Durchstechflasche zusammengefasst werden. Dies beinhaltet die Zugabe von 2 ml Hexan, das Wirbeln der Probe, das Zentrifugieren und Entfernen der organischen Schicht, die alle 3 Mal wiederholt werden.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

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<li>Goutx, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Short+term+summer+to+autumn+variability+of+dissolved+lipid+classes+in+the+Ligurian+Sea+%28NW+Mediterranean%29%5BTitle%5D)+AND+%22Biogeosciences%22%5BJournal%5D)">Short term summer to autumn variability of dissolved lipid classes in the Ligurian Sea (NW Mediterranean).</a> Biogeosciences. 6, 1229-1246 (2009).</li>
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</ol>

Die Autoren haben keine konkurrierenden finanziellen Interessen.

Die Geschwindigkeit, mit der das TLC-FID-System synoptische Lipidklasseninformationen aus kleinen Proben liefert, macht TLC-FID zu einem fähigen Werkzeug für das Screening von Meeresproben, bevor komplexere Analyseverfahren durchgeführt werden. Solche Analysen erfordern in der Regel die Freisetzung von Komponentenverbindungen aus Lipidextrakten und die Derivatisierung, um die Flüchtigkeit im Falle der Gaschromatographie zu erhöhen. TLC-FID in Kombination mit GC-FID hat sich als leistungsstarke Kombination für Extrakte au...

Die hier beschriebenen Methoden betreffen Stoffe, die operativ als marine Lipide definiert sind. Diese Definition basiert auf ihrer Zugänglichkeit zur Flüssig-Flüssig-Extraktion in unpolaren organischen Lösungsmitteln und bietet eine bequeme Methode für ihre Trennung von anderen Substanzen in einer aquatischen Matrix. Ihre hydrophobe Natur erleichtert ihre Isolierung von Meerwasser oder biologischen Proben sowie deren Anreicherung und die Entfernung von Salzen und Proteinen.
Die Messung des Lipidgehalts und seiner Zusammensetzung in Meeresorganismen ist seit Jahrzehnten in der Nahrungsnetzökologie, der Aquakulturernährung und der Lebensmittelwissenschaft von großem Interesse. Lipide sind universelle Komponenten in lebenden Organismen, die als essentielle Moleküle in Zellmembranen fungieren, als Hauptquellen bioverfügbarer Energie, für Wärmeisolierung und Auftrieb sorgen und als Signalmoleküle dienen. Obwohl Verfahren zur Lipidbestimmung in anderen Bereichen gut beschrieben wurden, erfordert ihre Verwendung mit marinen Proben häufig Modifikationen, um sich an die Feldbedingungen sowie an den Probentyp1anzupassen.
Bei Meerwasserproben erfordert der erste Schritt in der Regel eine Trennung in die operativ definierten "gelösten" und "partikulären" Fraktionen, normalerweise durch Filtration (Protokoll schritt 1). Die Partikelfraktion ist das, was vom Filter zurückgehalten wird, und die Größe der Poren ist wichtig für die Definition des Cut-offs2. Wenn wir Feinstaubproben nehmen, möchten wir häufig die Lipidkonzentrationen mit den Gesamtmassenkonzentrationen in Beziehung setzen, in diesem Fall muss zu diesem Zweck eine separate, kleinere Probe (z. B. 10 ml) entnommen werden (Protokoll Schritt 1, Anmerkung). Um eine genaue Massenbestimmung zu erhalten, ist es wichtig, am Ende der Filtration Ammoniumformiat (35 g/L) hinzuzufügen.
Das Meerwasserfiltrat aus der größeren Probe sollte je nach Probentyp zwischen 250 mL und 1 L betragen und wird in einem Scheidetrichter einer Flüssig-Flüssig-Extraktion unterzogen (Protokollschritt 2). Die hydrophobe Natur von Lipiden bedeutet, dass sie durch Extraktion in einem unpolaren Lösungsmittel wie Chloroform von anderen Verbindungen getrennt werden können. Es entsteht ein zweischichtiges System, bei dem sich Lipide in die organische Schicht aufteilen, während wasserlösliche Komponenten in der wässrigen Schicht verbleiben.
Partikuläre Proben auf einem Filter oder biologische Proben werden mit einer modifizierten Folch et al. Extraktion3, ebenfalls unter Einbeziehung von Chloroform , extrahiert (Protokoll schritt 3). Auch hier entsteht ein organisch-wässriges System, in dem sich Lipide in die organische Phase aufteilen, während wasserlösliche Moleküle in der wässrigen Phase verbleiben und Proteine ausgefällt werden. Tatsächlich verwenden die meisten Laboratorien für Feststoffe eine Variation des Extraktionsverfahrens von Folch et al.mit Chloroform und Methanol. Für Filter besteht der erste Schritt darin, in 2 ml Chloroform und 1 ml Methanol zu homogenisieren.
Während der Extraktion sollte darauf geachtet werden, Lipide vor chemischer oder enzymatischer Veränderung zu schützen, indem Proben und Lösungsmittel auf Eis aufbewahrt werden, um die Esterbindungshydrolyse oder die Kohlenstoff-Kohlenstoff-Doppelbindungsoxidation zu reduzieren. Gewebe und Zelllipide sind durch natürliche Antioxidantien und durch Kompartimentierung recht gut geschützt4; Nach der Homogenisierung der Proben werden jedoch Zellinhalte kombiniert, wodurch Lipide chemisch oder enzymatisch stärker zur Veränderung neigen. Einige Lipide, wie die meisten Sterole, sind sehr stabil, während andere, wie solche, die mehrfach ungesättigte Fettsäuren enthalten, anfälliger für chemische Oxidation sind. Andere, wie Sterole mit konjugierten Doppelbindungen, sind anfällig für Oxidation, die durch Licht katalysiert wird5. Nach Extraktionen sind Lipide viel anfälliger für chemische Oxidation, und Proben sollten unter einem Inertgas wie Stickstoff gelagert werden. Ein sanfter Stickstoffstrom würde auch verwendet, um Extrakte zu konzentrieren.
Nach der Konzentration würden Lipide dann normalerweise in großen Mengen quantifiziert, da sie ein wichtiger Bestandteil mariner Ökosysteme sind und eine hohe Energiekonzentration liefern, mehr als das Doppelte des kJ / g von Kohlenhydraten und Proteinen. Ausnahmslos würden sie als nächstes als einzelne Komponenten quantifiziert werden: Die umfassende Analyse von Lipiden beinhaltet in der Regel eine Trennung in einfachere Kategorien, je nach ihrer chemischen Natur. Eine vollständige Analyse beinhaltet also die Messung von Gesamtlipiden, Lipidklassen und einzelnen Verbindungen.
Das Gesamtlipid kann bestimmt werden, indem man die Summe der einzeln gemessenen Lipidklassen nimmt, die durch Chromatographie getrennt werden6. Ein mariner Lipidextrakt kann mehr als ein Dutzend Klassen aus biogenen und anthropogenen Quellen enthalten. Die große Vielfalt der Lipidstrukturen bedeutet, dass viele Informationen durch die Bestimmung einzelner Gruppierungen von Strukturen gewonnen werden können. Lipidklassen einzeln oder in bestimmten Gruppen wurden verwendet, um das Vorhandensein bestimmter Arten von Organismen sowie deren physiologischen Status und Aktivitätzu signalisieren 2. Sie wurden auch als Indikator für die Herkunft von organischem Material verwendet, einschließlich gelöster organischer Substanz (DOM) sowie hydrophober Verunreinigungen.
Triacylglycerole, Phospholipide und Sterole gehören zu den wichtigeren biogenen Lipidklassen. Die ersten beiden sind biochemisch verwandt, da sie ein Glycerin-Rückgrat besitzen, an dem zwei oder drei Fettsäuren verestert sind (Abbildung 1). Triacylglycerole sind zusammen mit Wachsestern sehr wichtige Speicherstoffe, während andere fettsäurehaltige Lipidklassen wie Diacylglycerole, freie Fettsäuren und Monoacylglycerole im Allgemeinen nebensächliche Bestandteile sind. Freie Fettsäuren sind in geringeren Konzentrationen in lebenden Organismen vorhanden, da die ungesättigten giftig sein können7. Sterole (sowohl in ihrer freien als auch in ihrer veresterten Form) und Fettalkohole gehören ebenfalls zu den weniger polaren Lipiden, während Glykolipide und Phospholipide polare Lipide sind. Polare Lipide haben eine hydrophile Gruppe, die die Bildung von Lipiddoppelschichten in Zellmembranen ermöglicht. Freie Sterole sind auch Membranstrukturkomponenten, und wenn sie im Verhältnis zu Triacylglycerinen eingenommen werden, liefern sie einen Zustand oder Nährwertindex (TAG: ST), der weit verbreitet ist8. Wenn sie im Verhältnis zu Phospholipiden (ST : PL) eingenommen werden, können sie verwendet werden, um die Empfindlichkeit der Pflanze gegenüber Salz anzuzeigen: Höhere Werte erhalten die strukturelle Integrität und verringern die Membranpermeabilität9. Die Umkehrung dieses Verhältnisses (PL : ST) wurde in Muschelgewebe während der Temperaturanpassunguntersucht 10.
Marine Lipidklassen können durch Dünnschichtchromatographie (TLC) auf Kieselgel-beschichteten Stäbchen getrennt werden (Protokollschritt 4) und dann durch Flammenionisationsdetektion (FID) in einem automatischen FID-Scanner detektiert und quantifiziert werden. TLC/FID wird routinemäßig für marine Proben verwendet, da es schnell synoptische Lipidklassendaten aus kleinen Proben liefert und durch die Summe aller Klassen einen Wert für die Gesamtlipide nimmt. TLC/FID wurde einer Qualitätssicherungsbewertung (QS) unterzogen und es wurde festgestellt, dass sie die Standards erfüllt, die für eine konsistente externe Kalibrierung, niedrige Leerwerte und eine präzise Replikatanalyse erforderlich sind11. Variationskoeffizienten (CV) oder relative Standardabweichungen liegen bei etwa 10%, und die Gesamtlipiddaten des FID-Scanners betragen normalerweise etwa 90% derjenigen, die mit gravimetrischen und anderen Methoden erhalten werden2. Die Gravimetrie ergibt wahrscheinlich höhere Gesamtlipide, da der FID-Scanner nur nichtflüchtige Verbindungen misst und auch aufgrund einer möglichen Einbeziehung von nicht-lipidischem Material in gravimetrische Messungen.
Die Informationen, die durch die Lipidklassenanalyse geliefert werden, sind besonders nützlich, wenn sie mit Bestimmungen von Fettsäuren als Individuen oder Sterole oder den beiden in Kombination kombiniert werden. Der erste Schritt zu diesen Analysen beinhaltet die Freisetzung aller Komponentenfettsäuren zusammen mit Sterolen in den Lipidextrakten (Protokollschritt 5). Die große Vielfalt an Lipidstrukturen und -funktionen bedeutet, dass sie in ökologischen und biogeochemischen Studien zur Bewertung der Ökosystemgesundheit und des Ausmaßes, in dem sie durch anthropogene und terrestrische Inputs beeinflusst wurden, breite Anwendung gefunden haben. Sie wurden verwendet, um die Biosynthese von Substanzen zu messen, die für die Meeresfauna von diätetischem Wert sind, sowie um die Qualität von Wasserproben anzuzeigen. Die Messung von Lipiden in Sedimentkernproben hilft, die Empfindlichkeit von Sedimenten gegenüber Veränderungen der menschlichen Landnutzung in der Nähe des Land-Meer-Randes zu zeigen.
Das primäre Werkzeug zur Identifizierung und Quantifizierung einzelner Lipidverbindungen war traditionell die Gaschromatographie (GC) mit FID. Vor der Analyse werden diese Verbindungen jedoch durch Derivatisierung flüchtiger gemacht. Fettsäuren werden in Gegenwart eines sauren Katalysators(H2SO4)aus Acyllipidklassen freigesetzt (Abbildung 1). In der organischen Chemie leitet sich die Acylgruppe (R-C=O) üblicherweise von einer Carbonsäure (R-COOH) ab. Sie werden dann zu Fettsäuremethylestern (FAME) verestert, was zu besseren Trennungen auf GC-Säulen führt (Protokollschritt 5).

<table><tbody><tr><td>15 ml Fläschchen</td><td>VWR</td><td>66009-560</td><td></td></tr><tr><td>1-Hexadecanol</td><td>Sigma</td><td>258741-1G</td><td></td></tr><tr><td>1-Monopalmitoyl-rac-glycerol</td><td>Sigma</td><td>M1640-1g</td><td></td></tr><tr><td>2 ml Fläschchen</td><td>VWR</td><td>46610-722</td><td></td></tr><tr><td>25 mm Glasfaserfilter</td><td>Fisher</td><td>09 874 32A</td><td></td></tr><tr><td>2ml Pipettenkolben</td><td>VWR</td><td>82024-554</td><td></td></tr><tr><td>47 mm Glasfaserfilter</td><td>Fisher</td><td>09 874 32</td><td></td></tr><tr><td>5 3/4" Pipetten</td><td>Fisher</td><td>1367820A</td><td></td></tr><tr><td>9" Pipetten</td><td>Fisher</td><td>1367820C</td><td></td></tr><tr><td>Aceton</td><td>VWR</td><td>CAAX0116-1</td><td></td></tr><tr><td>Agilent GC-FID 6890</td><td>Agilent</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Calciumchlorid ANHS 500gm</td><td>VWR</td><td>CACX0160-1</td><td></td></tr><tr><td>Kappen für 2 ml Fläschchen</td><td>VWR</td><td>46610-712</td><td></td></tr><tr><td>Chloroform</td><td>VWR</td><td>CACX1054-1</td><td></td></tr><tr><td>Cholesterylpalmitat</td><td>Sigma</td><td>C6072-1G</td><td></td></tr><tr><td>Chromarod S5</td><td>Shell USA</td><td>3252</td><td></td></tr><tr><td>Dichlormethan</td><td>VWR</td><td>CADX0831-1</td><td></td></tr><tr><td>DL-a-Phosphatidylcholin, Dipalmotoyl</td><td>Sigma</td><td>P5911-1g</td><td></td></tr><tr><td>Ethylether, ACS-Qualität anhydr 4L</td><td>VWR</td><td>CAEX0190-4</td><td></td></tr><tr><td>Glyceryltripalmitat</td><td>Sigma</td><td>T5888-100MG</td><td></td></tr><tr><td>Hamilton Spritze 702SNR 25&micro; l</td><td>Sigma</td><td>58381</td><td></td></tr><tr><td>Helium</td><td>Air Liquide</td><td>A0492781</td><td></td></tr><tr><td>Hexan</td><td>VWR</td><td>CAHX0296-1</td><td></td></tr><tr><td>Wasserstoffregler</td><td>VWR</td><td>55850-484</td><td></td></tr><tr><td>Iatroscan MK6</td><td>Shell USA</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Kimwipes</td><td>Fisher</td><td>066662</td><td></td></tr><tr><td>Medical Air</td><td>Air Liquide</td><td>A0464563</td><td></td></tr><tr><td>Handschuhe aus mittlerem Nitril</td><td>Fisher</td><td>191301597C</td><td></td></tr><tr><td>Handschuhe aus Nitril L</td><td>VWR</td><td>CA82013-782</td><td></td></tr><tr><td>Nitrogen</td><td>Air Liquide</td><td>A0464775</td><td></td></tr><tr><td>Nitrogen Regulator</td><td>VWR</td><td>55850-474</td><td></td></tr><tr><td>Nonadecane</td><td>Sigma</td><td>74158-1G</td><td></td></tr><tr><td>Palmitinsäure</td><td>Sigma</td><td>P0500-10G</td><td></td></tr><tr><td>Repeating-Dispenser</td><td>Sigma</td><td>20943</td><td></td></tr><tr><td>Natriumbicarbonat 1kg</td><td>VWR</td><td>CA97062-460</td><td></td></tr><tr><td>Natriumsulfat Anhy ACS 500gr</td><td>VWR</td><td>CA71008-804</td><td></td></tr><tr><td>Schwefelsäure</td><td>VWR</td><td>CASX1244-5</td><td></td></tr><tr><td>Teflonband</td><td>Fisher</td><td>14610120</td><td></td></tr><tr><td>Tissue Master 125 115V w/7mm Homogenator</td><td>OMNI Deutschland</td><td>TM125-115</td><td></td></tr><tr><td>TLC Entwicklungstank</td><td>Shell USA</td><td>3201</td><td></td></tr><tr><td>UHP Wasserstoff</td><td>Air Liquide</td><td>A0492788</td><td></td></tr><tr><td>VWR Lösungsmittel Repippetter</td><td>VWR</td><td>82017-766</td><td></td></tr><tr><td>VWR Timer Blinkende LED 2 Kanal</td><td>VWR</td><td>89140-196</td><td></td></tr><tr><td>Zebron ZB-Wax GC Säule</td><td>Phenomenex</td><td>7HM-G013-11</td><td></td></tr></tbody></table>

bestimmung von gesamtlipid und lipidklassen in marinen proben

Determination of Total Lipid and Lipid Classes in Marine Samples

Lipide bestehen größtenteils aus Kohlenstoff und Wasserstoff und liefern daher eine größere spezifische Energie als andere organische Makromoleküle im Meer. Da sie kohlenstoff- und wasserstoffreich sind, sind sie auch hydrophob und können als Lösungsmittel und Absorptionsträger für organische Schadstoffe fungieren und somit Treiber der Schadstoffbioakkumulation in marinen Ökosystemen sein. Ihre hydrophobe Natur erleichtert ihre Isolierung von Meerwasser oder biologischen Proben: Die marine Lipidanalyse beginnt mit der Probenahme und dann der Extraktion in unpolaren organischen Lösungsmitteln und bietet eine bequeme Methode für ihre Trennung von anderen Substanzen in einer aquatischen Matrix.
Wenn Meerwasser beprobt wurde, besteht der erste Schritt in der Regel darin, durch Filtration in operativ definierte "gelöste" und "partikuläre" Fraktionen zu trennen. Proben werden entnommen und Lipide aus der Probenmatrix isoliert, typischerweise mit Chloroform für wirklich gelöste Stoffe und Kolloide und mit Mischungen aus Chloroform und Methanol für Feststoffe und biologische Proben. Solche Extrakte können mehrere Klassen aus biogenen und anthropogenen Quellen enthalten. Zu diesem Zeitpunkt können Gesamtlipide und Lipidklassen bestimmt werden. Das Gesamtlipid kann gemessen werden, indem individuell bestimmte Lipidklassen summiert werden, die üblicherweise chromatographisch getrennt wurden. Die Dünnschichtchromatographie (TLC) mit Flammenionisationsdetektion (FID) wird regelmäßig zur quantitativen Analyse von Lipiden aus marinen Proben eingesetzt. TLC-FID liefert synoptische Lipidklasseninformationen und durch Summieren von Klassen eine Gesamtlipidmessung.
Informationen zur Lipidklasse sind besonders nützlich, wenn sie mit Messungen einzelner Komponenten, z. B. Fettsäuren und/oder Sterole, nach ihrer Freisetzung aus Lipidextrakten kombiniert werden. Die große Vielfalt an Lipidstrukturen und -funktionen bedeutet, dass sie in der ökologischen und biogeochemischen Forschung umfassend eingesetzt werden, um die Gesundheit des Ökosystems und den Grad des Einflusses durch anthropogene Auswirkungen zu bewerten. Sie wurden verwendet, um Substanzen von diätetischem Wert für die Meeresfauna (z. B. Aquafeeds und / oder Beute) und als Indikator für die Wasserqualität (z. B. Kohlenwasserstoffe) zu messen.

Als der am schnellsten wachsende Lebensmittelproduktionssektor entwickelt sich die Aquakultur in Bezug auf technologische Innovationen und Anpassungen an sich ändernde Anforderungen weiter. Eine davon besteht darin, die Abhängigkeit von Fischmehl und Fischöl aus wilden Quellen zu verringern, die Futterzutaten für viele Aquakulturarten liefern. Terrestrische Pflanzenöle werden als nachhaltiger und wirtschaftlicher Ersatz für Fischöl in Aquafeeds untersucht, und die Leber ist ein Zielgewebe für die Analyse, da sie der prim...

Dieses Protokoll dient zur Bestimmung von Lipiden in Meerwasser und biologischen Proben. Lipide in Filtraten werden mit Chloroform oder Mischungen von Chloroform und Methanol im Falle von Feststoffen extrahiert. Lipidklassen werden durch Stäbchendünnschichtchromatographie mit Flammenionisationsdetektion gemessen und ihre Summe ergibt den Gesamtlipidgehalt.

Bestimmung von Gesamtlipid und Lipidklassen in marinen Proben

Lipids are largely composed of carbon and hydrogen and, therefore, provide a greater specific energy than other organic macromolecules in the sea. Being ...

Die hier beschriebenen Verfahren betreffen Verbindungen, die operativ als marine Lipide definiert werden können. Die Grundlage dieser Definition ist ihre Zugänglichkeit zur Flüssig-Flüssig-Extraktion in unpolaren organischen Lösungsmitteln, die eine bequeme Möglichkeit bietet, sie von anderen Verbindungen in einer wässrigen Matrix zu trennen. Ihre hydrophobe Natur erleichtert ihre Isolierung von Meerwasser oder biologischen Proben sowie deren Anreicherung und Entfernung von Salzen und Proteinen.Bei Meerwasserproben besteht der erste Schritt in der Regel in die Trennung in operativ definierte gelöste und partikuläre Fraktionen, meist durch Filtration. Der Partikelanteil ist derjenige, der von Filtern zurückgehalten wird, und die Porengröße ist wichtig für die Definition des Grenzwerts. Platzieren Sie mit einer lipidsauberen Pinzette einen 47-Millimeter-Glasfaserfilter, der auf einem lipidsauberen Filtersystem eingefärbt wurde.Nehmen Sie die Probe und schwenken Sie sie vorsichtig, um alle Partikel, die sich möglicherweise abgesetzt haben, wieder zu versenken. Messen Sie ein bekanntes Volumen. Das Volumen hängt von der Menge an Partikelmaterial in der Probe ab.Wenn das Volumen gemessen ist, saugen Sie das Filtersystem an und befeuchten Sie den Filter vorsichtig mit gefiltertem Meerwasser. Die gesamte Probe langsam in den Filtertrichter geben und den Messzylinder mit Meerwasser abspülen, um sicherzustellen, dass alle Partikel dem Filter zugesetzt werden. Spülen Sie den Trichter der Apparatur ab, um sicherzustellen, dass alle Partikel auf den Filter gespült werden.Ziehen Sie die gesamte Flüssigkeit durch den Filter, aber lassen Sie den Filter nicht austrocknen, da er Zellen zerreißen kann, die sich auf dem Filter befinden. Nehmen Sie die lipid-saubere Pinzette, falten Sie den Filter in zwei Hälften, dann falten Sie ihn noch einmal in Drittel und dann in der Hälfte der Länge. Der Filter wird dann in eine lipidreinigte Durchstechflasche gegeben.Den Filter mit zwei ml Chloroform abdecken, unter Stickstoff verschließen und mit Teflonband verschließen. Zu diesem Zeitpunkt wird die Probe bis zu einem Jahr bei minus 20 Grad Celsius gelagert. Vorbereitung der Probe.Messen Sie ein bekanntes Volumen des Filtrats in einen lipidreinigten Glaszylinder. Geben Sie die Probe in einen lipidsauberen Scheidetrichter und geben Sie etwa 20 ml Chloroform hinzu. Schütteln Sie diese Mischung für mindestens zwei Minuten und entlüften Sie sie häufig.Nach der ersten Trennung, Entfernung des ersten Extrakts und Zugabe von Säure. Nachdem Sie die Lösung zwei Minuten lang geschüttelt haben, wickeln Sie den Trichter in Aluminiumfolie und warten Sie, bis die Trennung stattgefunden hat, ungefähr fünf Minuten. Nachdem Sie auf die Trennung gewartet haben, ziehen Sie den Boden der Aluminiumfolie zurück, um die beiden Schichten zu sehen.Sammeln Sie die untere Schicht in einem lipidsauberen Rundkolben, wobei Sie darauf achten, dass keine der oberen Schichten enthalten ist. Den Rundkolben unter Stickstoff verschließen und in einen Gefrierschrank stellen. Holen Sie den Scheidetrichter zurück und fügen Sie der Flüssigkeit Schwefelsäure hinzu.Fügen Sie 0,25 ml für jeden Liter Meerwasser hinzu. Sobald die Schwefelsäure hinzugefügt wurde, schütteln Sie das Meerwasser vorsichtig, fügen Sie dann weitere 10 ml Chloroform hinzu und schütteln Sie kräftig, während Sie weitere zwei Minuten entlüften. Dann erlauben Sie die Trennung.Zweite und dritte Trennung. Fügen Sie die untere Schicht wieder in den runden Bodenkolben hinzu, ohne Wasser einzuschließen. Fügen Sie eine dritte Menge von 10 ml Chloroform hinzu und schütteln Sie für weitere zwei Minuten mit Entlüftung.Nach der Trennung wird der letzte Teil chloroform in denselben Kolben gegeben, und die kombinierten Extrakte können durch einen Rotationsverdampfer verdampft und in eine Zwei-ml-Durchstechflasche überführt werden. Einrichtung. Für den Extraktionsaufbau benötigen Sie einen isolierten Behälter, der mit Eis gefüllt ist. Zu den Lösungsmitteln gehören Chloroform, Chloroform-extrahiertes Wasser und 2: 1 Chloroform-Methanol.Von dieser Lösung benötigen Sie ungefähr ein ml pro Probe, also machen Sie es entsprechend. Alle diese Lösungsmittel sollten auf Eis gelegt werden, damit sie zum Zeitpunkt des Beginns der Extraktion kalt sind. Die Proben gehen auch auf Eis, so dass alles kalt bleibt.Mahlen und Extrahieren. Die Proben wurden in zwei ml Chloroform eingefroren gelagert, also fügen Sie einen ml eiskaltes Methanol oder ein halbes Pipett hinzu. Achten Sie beim Hinzufügen des Methanols darauf, die Durchstechflasche nicht mit dem Pipett zu berühren.Reinigen und homogenisieren Sie dreimal mit Methanol und dreimal mit Chloroform. Achten Sie beim Mahlen darauf, die Extraktionsfläschchen nicht in der Hand zu schneiden, falls Sie die Durchstechflasche zerbrechen, und vermeiden Sie eine Erwärmung der Probe. Schnell schleifen.Sobald die Probe vollständig gemahlen ist, legen Sie sie in Eis und waschen Sie alle verbleibenden Partikel aus der Mühle mit einem ml 2:1 Chloroform-Methanol zurück in die Durchstechflasche. Verwenden Sie bei Bedarf eine lipidreinigte Pinzette, um die Partikel vor dem Waschen zurück in die Durchstechflasche zu drücken. Achten Sie darauf, das Pipett nicht mit der Mühle oder die Mühle mit der Durchstechflasche zu berühren.Dann fügen Sie 0,5 ml oder ein Viertelpipet chloroform-extrahiertes Wasser hinzu, ohne die Mühle oder die Mühle zu berühren, in die Durchstechflasche. Wenn die Mühle gewaschen wurde, berühren Sie den Tropfen, der von der Mühle an der Durchstechflasche hängt. Verschließen und im Eis aufbewahren, bis es zum Beschallen bereit ist.Doppeltes Pipettieren. Nach dem Zentrifugieren befinden sich zwei Schichten in der Durchstechflasche: die organische und die wässrige Schicht. Um die organische Schicht zu erhalten, wird die doppelte Pipettiertechnik verwendet.Dazu wird ein kurzes fünf Zentimeter langes Pipett mit locker angezogener Glühbirne zwischen Zeigefinger und Mittelfinger gegriffen. Drücken Sie das Pipett vorsichtig durch die beiden Schichten nach unten, während Sie die Glühbirne zusammendrücken, wodurch Blasen bis zum Ende herauskommen. Wenn der Boden der zweiten Schicht erreicht ist, verwenden Sie Ihren Daumen, um die Glühbirne abzunehmen, ohne die organische Schicht in das Pipett zu zeichnen.Mit einem neun Zentimeter langen Pipett die Glühbirne komplett zusammendrücken. Setzen Sie das lange Ende des Pipetts in das fünf Zentimeter lange Pipett und entfernen Sie die untere Schicht durch das fünf Zentimeter lange Pipett. Dieser Extrakt wird dann in eine lipidreinigte Durchstechflasche gegeben.Entfernen Sie die untere Ebene, bis alles entfernt ist. Alle Schichten sind in der lipidrichten Durchstechflasche gepoolt. Waschen von Pipetten.Entfernen Sie die Glühbirne aus dem neun Zentimeter langen Pipett. Legen Sie es mit dem Extrakt in die Durchstechflasche. Nehmen Sie ein Pipett voll sauberes Chloroform und spritzen Sie das Chloroform um das Innere des Pipetts, ohne das Zu waschende Pipett zu berühren.Drehen Sie das Pipett vorsichtig während des Waschens. Nehmen Sie ein zweites Pipett Chloroform und machen Sie dasselbe mit der Außenseite des Pipetts. Stellen Sie sicher, dass das gesamte Chloroform das Pipett hinunter und in die Extraktionsflasche läuft.Wenn Sie mit dem langen Pipett fertig sind, nehmen Sie das kurze und wiederholen Sie es, aber waschen Sie es mit der Probe in die Durchstechflasche. Erkennen einer Probe. Reinigen Sie eine Spritze mit Chloroform.Nehmen Sie eine Probe mit bekanntem Volumen und spülen Sie die Spritze in der Probe aus. Ziehen Sie die Probe über die Menge hinaus, die Sie erkennen möchten. Bringen Sie dann den Kolben auf die gewünschte Menge, um sicherzustellen, dass keine Luftblasen entstehen.Verwenden Sie die Taste, um 0,5 Mikroliter abzugeben und berühren Sie den Tropfen zum Stab. Trocknen lassen, bevor sie den nächsten Tropfen auf die gleiche Stelle geben. Erkennen Sie alle Proben in einer Linie auf Stäben, die über das Ende einer warmen Heizplatte gehalten werden.Fokussierung in Aceton. Die Fokussierung der Probe erfolgt in 100%Aceton. Fügen Sie ungefähr 70 ml Aceton auf den Boden des Entwicklungstanks hinzu.Nehmen Sie die beiden Racks und senken Sie sie vorsichtig in den Entwicklungstank. Beobachten Sie die Lösungsmittelfront, während sie auf den Stab klettert, bis die Unterseite des Spots mit der Oberseite des Spots verschmilzt. Entfernen Sie die Stangen.Trocknen Sie sie für etwa fünf Sekunden und wiederholen Sie dann den Vorgang. Wenn die Proben sehr konzentriert sind, kann diese Fokussierung ein drittes Mal durchgeführt werden. Erstes Entwicklungssystem.Das erste Entwicklungssystem besteht aus Hexan, Ethylether und Ameisensäure bei 98,5 bis eins bis 0,5. Beginnen Sie damit, einen Messzylinder dreimal mit Hexan zu spülen und zu verwerfen. Füllen Sie den Messzylinder etwas mehr als 85 ml mit Hexan.Verwenden Sie dann ein Pipett und die Flasche Hexan, um den Messzylinder auf 90 ml zu füllen. Dann bringen Sie den Boden des Meniskus unter Verwendung von Ethylether in die 91-ml-Linie, wodurch ein ml Ethylether entsteht. 0,5 ml Ameisensäure mit der Hamilton-Spritze zugeben.Aber spülen Sie zuerst die Hamilton-Spritze dreimal mit der Ameisensäure ab, um sicherzustellen, dass kein Chloroform übrig bleibt, das zum Ausspülen der Probe aus der Spritze verwendet wurde. Fügen Sie zwei komplette Spritzen oder 25 Mikroliter gleichzeitig hinzu, um insgesamt 50 Mikroliter zu erhalten. Es ist wichtig, dass die Ameisensäure sofort mit Chloroform aus der Spritze gespült wird, um eine Korrodierung des Metalls in der Spritze zu vermeiden.Sobald die Hamilton-Spritze sauber ist, machen Sie die Lösung mit Hexan und einem Pipett auf genau 100 ml. Dann kappen und invertieren Sie drei- oder viermal. Gießen Sie ca. 30 ml in den Entwicklungstank.Verwenden Sie diese 30 ml, um das Papier zu benetzen und den Tank abzuspülen. Verwerfen Sie die Spüllösung. Die restlichen 70 ml in den Entwicklungstank geben.Hinzufügen von Racks zum Entwicklungssystem. Das Hinzufügen von Stäben zum Entwicklungssystem ist für jede Entwicklung gleich. Stellen Sie sicher, dass der Timer für die Zeit eingestellt ist, in der die Stangen entwickelt werden sollen.Und dann nehmen Sie die Racks und senken Sie sie vorsichtig in den Tank. Beobachten Sie, bis die Lösungsmittelfront die Probenstellen erreicht, und starten Sie dann den Timer. Zweites Entwicklungssystem.Das zweite Entwicklungssystem ist Hexan, Ethylen und Ameisensäure, 79 bis 20 zu eins. Spülen Sie also wie zuvor den Messzylinder dreimal mit Hexan ab. Fügen Sie genau 20 ml Ether und dann einen ml Ameisensäure hinzu, wodurch das Volumen auf 21 ml steigt.Dann bringen Sie das Volumen auf 100 mls mit Hexan. Fügen Sie mit den Flaschenpumpen etwa 75 ml Hexan hinzu. Und für den Teil verwenden Sie ein Pipett.Kappen und invertieren Sie mehrmals. Geben Sie ca. 30 ml in den Entwicklungstank, um das Papier zu benetzen, und spülen Sie den Tank ab. Entsorgen Sie die 30 ml.Fügen Sie die restlichen 70 hinzu und es ist bereit für den Satz von Ruten. Drittes Entwicklungssystem. Das dritte Entwicklungssystem ist eine Mischung aus Chloroform, Methanol und Chloroform-extrahiertem Wasser, 50, 40 bis 10.Spülen Sie den Messzylinder dreimal mit Chloroform ab. Fügen Sie etwa 45 ml Chloroform hinzu. Bringen Sie mit einem Pipett den Boden des Meniskus auf die 50-ml-Marke.Fügen Sie etwa 38 ml Methanol hinzu. Bringen Sie die Unterseite des Meniskus auf die 90-ml-Linie. Füllen Sie dann die letzten 10 ml mit Chloroform-extrahiertem Wasser.Wie bei den anderen Entwicklungssystemen kehren Sie dies drei- oder viermal um und gießen Sie dann 30 ml in den Tank, um das Papier zu benetzen. Entsorgen Sie diese 30 ml und geben Sie die letzten 70 ml in den Tank. Vorbereitung des Methanols.Um die für die Derivatisierung verwendete Hilditch-Lösung herzustellen, füllen Sie einen lipidsauberen, sauberen Messkolben, der ebenfalls entweder getrocknet oder dreimal zusätzlich mit Methanol gespült wurde, um Chloroform zu entfernen. Fügen Sie Methanol hinzu, bis sich der Boden des Meniskus an der zu enthaltenden Linie befindet. Nach der Messung des Methanols fügen Sie Natriumsulfat hinzu, das mindestens 24 Stunden bei 60 Grad Celsius getrocknet wurde.Fügen Sie genug Natriumsulfat hinzu, so dass es den Boden des Volumenmetrischen Kolbens bedeckt. Einmal abgedeckt, zweimal invertieren, so dass jedes Wasser, das sich im Methanol befindet, vom Natriumsulfat absorbiert wird. Nach dem Invertieren und Schütteln mindestens fünf Minuten ruhen lassen.Hinzufügen der Säure. Nachdem sich das Methanol fünf Minuten abgesetzt hat, dekantieren Sie es langsam in die endgültige Glasflasche, um sicherzustellen, dass das gesamte Natriumsulfat im Boden des Messkolbens verbleibt. Das Natriumsulfat bleibt normalerweise am Boden, so dass das gesamte Methanol abfließen sollte.Lassen Sie das Volumetrie mit dem Natriumsulfat in der Rückseite des Abzugs trocknen. Fügen Sie dem Methanol mit einem PIPETMAN langsam Schwefelsäure hinzu. Fügen Sie ein paar Tropfen auf einmal hinzu, damit das Methanol nicht spuckt.Sobald die gesamte Säure hinzugefügt wurde, kappen und vorsichtig umrühren, um zu mischen. Die Lösung ist jetzt bereit, für Derivate verwendet zu werden, aber sie muss wöchentlich nachgeholt werden. Herstellung der Derivate.Aus einer Extraktfläschchen, bei der das Volumen auf eine bekannte Menge gebracht wurde, schwenken Sie und entfernen Sie dann einen Teil des Extrakts in eine lipidrichte, markierte 15-ml-Durchstechflasche. Die Menge, die Sie entfernen, wird durch die Konzentration der Probe aus dem Iatrosker bestimmt. Verwenden Sie ein lipidreinigtes Drummond-Pipett, um die Probe zu entfernen.Sobald die Probe entnommen wurde, legen Sie die 15-ml-Durchstechflasche unter Stickstoff, um das Chloroform vollständig zu verdampfen. Die Originalprobe kann aufbewahrt und in den Gefrierschrank zurückgebracht werden. Wenn die Probe getrocknet ist, fügen Sie 1,5 ml Dichlormethan oder ein Pipett und drei ml der Hilditch-Lösung, die früher an diesem Tag hergestellt wurde, oder zwei Pipetten hinzu.Diese Lösung wird dann unter Stickstoff gehalten, verwirbelt und vier Minuten lang in den Ultraschallgerät gegeben, bevor sie für eine Stunde in einen Ofen bei 100 Grad Celsius gestellt wird. Stoppen der Reaktion. Nach dem Erhitzen bei 100 Grad Celsius für eine Stunde und dem Abkühlen langsam 0,5 ml gesättigte Natriumbicarbonatlösung hinzufügen.Blasen werden erzeugt, wenn die Säure neutralisiert wird. Dann fügen Sie 1,5 ml Hexan hinzu. Rekapitulieren und kräftig schütteln.Lassen Sie es stehen, so dass es sich in zwei Schichten aufteilt. Verarbeiten Sie alle Proben. Wenn sie alle fertig sind, wird der erste für den nächsten Schritt bereit sein.Entfernen der obersten Schicht. Sobald die Derivatisierung gestoppt wurde und eine klare Trennung in der 15-ml-Durchstechflasche vorliegt, entfernen Sie die oberste Schicht und legen Sie sie in eine lipidreinigte Zwei-ml-Durchstechflasche. Es ist besser, einen Teil der oberen Schicht zu belassen, als eine der unteren Schichten in die Zwei-ml-Durchstechflasche zu bekommen.Sobald der Großteil der obersten Schicht entfernt wurde, kann der Rest der Lösung verworfen werden. Der Extrakt, der sich in den zwei ml befindet, sollte vollständig unter einem sanften Stickstoffstrom verdampft werden. Sobald die Durchstechflasche vollständig trocken ist, kann Hexan wieder hinzugefügt werden, und dann sollte die Probe beschallt, unter Stickstoff gehalten werden, und dann ist sie bereit, zum GC zu gehen. Repräsentative Ergebnisse.Diese Abbildung zeigt rohe TLC-FIC-Chromatogramme unseres Standards, einer Diät, die mit Rapsöl und Lebergewebe von einem Lachs zubereitet wird, der mit dieser Diät gefüttert wird. Die Aquakultur, der am schnellsten wachsende Sektor der Nahrungsmittelproduktion, muss ihre Abhängigkeit von Fischmehl und Fischöl aus wilden Quellen verringern. Pflanzenöle werden als Ersatz für Fischöl in Aquafeeds untersucht.Und Leber, der primäre Ort für den Fettstoffwechsel, ist für die Analyse vorgesehen. Wir können die Prävalenz von Triacylglycerolen in der Ernährung in der Leber und auch die Bedeutung von Membranphospholipiden in der Leber sehen. Diese Abbildung zeigt Chromatogramme eines Standards.Lipide und absetzende Partikel, die sich hier vor der Küste angesammelt haben, und Lipide im Mysid, die sich in der Nähe der gleichen Tiefe angesammelt haben. Hier wurden Chromatogramme durch Plotting-Software verarbeitet. Als kohlenstoffreich mit einem sehr hohen Energiewert sind Lipide ein wichtiger Bestandteil der Produktivität von Regalflächen, die für den Kohlenstoffkreislauf besonders wichtig sind.Mehr Oberflächenprimärproduktion erreicht den Meeresboden in flacherem Wasser. Wir fanden heraus, dass kleine Mysiden die höchste Lipidkonzentration in unseren Proben hatten. Hier werden Wachs und sterile Ester kombiniert.Und es gibt eine Spitzenspaltung aufgrund des Vorhandenseins eines hohen Gehalts an mehrfach ungesättigten Fettsäuren. Die Schnelligkeit, mit der das Chromarod Iatroscan TLC-FID-System synoptische Lipidklassendaten aus kleinen Proben liefert, macht es zu einem leistungsstarken Werkzeug für das Screening mariner Proben vor der Durchführung detaillierterer chromatographischer Analysen. Solche Analysen erfordern in der Regel die Freisetzung von Komponentenverbindungen aus Lipidextrakten und die Derivatisierung, um die Flüchtigkeit zu erhöhen.

determination-of-total-lipid-and-lipid-classes-in-marine-samples

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Forschung

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Umwelt

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