Bestimmung von Gesamtlipid und Lipidklassen in marinen Proben

Die hier beschriebenen Verfahren betreffen Verbindungen, die operativ als marine Lipide definiert werden können. Die Grundlage dieser Definition ist ihre Zugänglichkeit zur Flüssig-Flüssig-Extraktion in unpolaren organischen Lösungsmitteln, die eine bequeme Möglichkeit bietet, sie von anderen Verbindungen in einer wässrigen Matrix zu trennen. Ihre hydrophobe Natur erleichtert ihre Isolierung von Meerwasser oder biologischen Proben sowie deren Anreicherung und Entfernung von Salzen und Proteinen.

Bei Meerwasserproben besteht der erste Schritt in der Regel in die Trennung in operativ definierte gelöste und partikuläre Fraktionen, meist durch Filtration. Der Partikelanteil ist derjenige, der von Filtern zurückgehalten wird, und die Porengröße ist wichtig für die Definition des Grenzwerts. Platzieren Sie mit einer lipidsauberen Pinzette einen 47-Millimeter-Glasfaserfilter, der auf einem lipidsauberen Filtersystem eingefärbt wurde.

Nehmen Sie die Probe und schwenken Sie sie vorsichtig, um alle Partikel, die sich möglicherweise abgesetzt haben, wieder zu versenken. Messen Sie ein bekanntes Volumen. Das Volumen hängt von der Menge an Partikelmaterial in der Probe ab.

Wenn das Volumen gemessen ist, saugen Sie das Filtersystem an und befeuchten Sie den Filter vorsichtig mit gefiltertem Meerwasser. Die gesamte Probe langsam in den Filtertrichter geben und den Messzylinder mit Meerwasser abspülen, um sicherzustellen, dass alle Partikel dem Filter zugesetzt werden. Spülen Sie den Trichter der Apparatur ab, um sicherzustellen, dass alle Partikel auf den Filter gespült werden.

Ziehen Sie die gesamte Flüssigkeit durch den Filter, aber lassen Sie den Filter nicht austrocknen, da er Zellen zerreißen kann, die sich auf dem Filter befinden. Nehmen Sie die lipid-saubere Pinzette, falten Sie den Filter in zwei Hälften, dann falten Sie ihn noch einmal in Drittel und dann in der Hälfte der Länge. Der Filter wird dann in eine lipidreinigte Durchstechflasche gegeben.

Den Filter mit zwei ml Chloroform abdecken, unter Stickstoff verschließen und mit Teflonband verschließen. Zu diesem Zeitpunkt wird die Probe bis zu einem Jahr bei minus 20 Grad Celsius gelagert. Vorbereitung der Probe.

Messen Sie ein bekanntes Volumen des Filtrats in einen lipidreinigten Glaszylinder. Geben Sie die Probe in einen lipidsauberen Scheidetrichter und geben Sie etwa 20 ml Chloroform hinzu. Schütteln Sie diese Mischung für mindestens zwei Minuten und entlüften Sie sie häufig.

Nach der ersten Trennung, Entfernung des ersten Extrakts und Zugabe von Säure. Nachdem Sie die Lösung zwei Minuten lang geschüttelt haben, wickeln Sie den Trichter in Aluminiumfolie und warten Sie, bis die Trennung stattgefunden hat, ungefähr fünf Minuten. Nachdem Sie auf die Trennung gewartet haben, ziehen Sie den Boden der Aluminiumfolie zurück, um die beiden Schichten zu sehen.

Sammeln Sie die untere Schicht in einem lipidsauberen Rundkolben, wobei Sie darauf achten, dass keine der oberen Schichten enthalten ist. Den Rundkolben unter Stickstoff verschließen und in einen Gefrierschrank stellen. Holen Sie den Scheidetrichter zurück und fügen Sie der Flüssigkeit Schwefelsäure hinzu.

Fügen Sie 0,25 ml für jeden Liter Meerwasser hinzu. Sobald die Schwefelsäure hinzugefügt wurde, schütteln Sie das Meerwasser vorsichtig, fügen Sie dann weitere 10 ml Chloroform hinzu und schütteln Sie kräftig, während Sie weitere zwei Minuten entlüften. Dann erlauben Sie die Trennung.

Zweite und dritte Trennung. Fügen Sie die untere Schicht wieder in den runden Bodenkolben hinzu, ohne Wasser einzuschließen. Fügen Sie eine dritte Menge von 10 ml Chloroform hinzu und schütteln Sie für weitere zwei Minuten mit Entlüftung.

Nach der Trennung wird der letzte Teil chloroform in denselben Kolben gegeben, und die kombinierten Extrakte können durch einen Rotationsverdampfer verdampft und in eine Zwei-ml-Durchstechflasche überführt werden. Einrichtung. Für den Extraktionsaufbau benötigen Sie einen isolierten Behälter, der mit Eis gefüllt ist. Zu den Lösungsmitteln gehören Chloroform, Chloroform-extrahiertes Wasser und 2: 1 Chloroform-Methanol.

Von dieser Lösung benötigen Sie ungefähr ein ml pro Probe, also machen Sie es entsprechend. Alle diese Lösungsmittel sollten auf Eis gelegt werden, damit sie zum Zeitpunkt des Beginns der Extraktion kalt sind. Die Proben gehen auch auf Eis, so dass alles kalt bleibt.

Mahlen und Extrahieren. Die Proben wurden in zwei ml Chloroform eingefroren gelagert, also fügen Sie einen ml eiskaltes Methanol oder ein halbes Pipett hinzu. Achten Sie beim Hinzufügen des Methanols darauf, die Durchstechflasche nicht mit dem Pipett zu berühren.

Reinigen und homogenisieren Sie dreimal mit Methanol und dreimal mit Chloroform. Achten Sie beim Mahlen darauf, die Extraktionsfläschchen nicht in der Hand zu schneiden, falls Sie die Durchstechflasche zerbrechen, und vermeiden Sie eine Erwärmung der Probe. Schnell schleifen.

Sobald die Probe vollständig gemahlen ist, legen Sie sie in Eis und waschen Sie alle verbleibenden Partikel aus der Mühle mit einem ml 2:1 Chloroform-Methanol zurück in die Durchstechflasche. Verwenden Sie bei Bedarf eine lipidreinigte Pinzette, um die Partikel vor dem Waschen zurück in die Durchstechflasche zu drücken. Achten Sie darauf, das Pipett nicht mit der Mühle oder die Mühle mit der Durchstechflasche zu berühren.

Dann fügen Sie 0,5 ml oder ein Viertelpipet chloroform-extrahiertes Wasser hinzu, ohne die Mühle oder die Mühle zu berühren, in die Durchstechflasche. Wenn die Mühle gewaschen wurde, berühren Sie den Tropfen, der von der Mühle an der Durchstechflasche hängt. Verschließen und im Eis aufbewahren, bis es zum Beschallen bereit ist.

Doppeltes Pipettieren. Nach dem Zentrifugieren befinden sich zwei Schichten in der Durchstechflasche: die organische und die wässrige Schicht. Um die organische Schicht zu erhalten, wird die doppelte Pipettiertechnik verwendet.

Dazu wird ein kurzes fünf Zentimeter langes Pipett mit locker angezogener Glühbirne zwischen Zeigefinger und Mittelfinger gegriffen. Drücken Sie das Pipett vorsichtig durch die beiden Schichten nach unten, während Sie die Glühbirne zusammendrücken, wodurch Blasen bis zum Ende herauskommen. Wenn der Boden der zweiten Schicht erreicht ist, verwenden Sie Ihren Daumen, um die Glühbirne abzunehmen, ohne die organische Schicht in das Pipett zu zeichnen.

Mit einem neun Zentimeter langen Pipett die Glühbirne komplett zusammendrücken. Setzen Sie das lange Ende des Pipetts in das fünf Zentimeter lange Pipett und entfernen Sie die untere Schicht durch das fünf Zentimeter lange Pipett. Dieser Extrakt wird dann in eine lipidreinigte Durchstechflasche gegeben.

Entfernen Sie die untere Ebene, bis alles entfernt ist. Alle Schichten sind in der lipidrichten Durchstechflasche gepoolt. Waschen von Pipetten.

Entfernen Sie die Glühbirne aus dem neun Zentimeter langen Pipett. Legen Sie es mit dem Extrakt in die Durchstechflasche. Nehmen Sie ein Pipett voll sauberes Chloroform und spritzen Sie das Chloroform um das Innere des Pipetts, ohne das Zu waschende Pipett zu berühren.

Drehen Sie das Pipett vorsichtig während des Waschens. Nehmen Sie ein zweites Pipett Chloroform und machen Sie dasselbe mit der Außenseite des Pipetts. Stellen Sie sicher, dass das gesamte Chloroform das Pipett hinunter und in die Extraktionsflasche läuft.

Wenn Sie mit dem langen Pipett fertig sind, nehmen Sie das kurze und wiederholen Sie es, aber waschen Sie es mit der Probe in die Durchstechflasche. Erkennen einer Probe. Reinigen Sie eine Spritze mit Chloroform.

Nehmen Sie eine Probe mit bekanntem Volumen und spülen Sie die Spritze in der Probe aus. Ziehen Sie die Probe über die Menge hinaus, die Sie erkennen möchten. Bringen Sie dann den Kolben auf die gewünschte Menge, um sicherzustellen, dass keine Luftblasen entstehen.

Verwenden Sie die Taste, um 0,5 Mikroliter abzugeben und berühren Sie den Tropfen zum Stab. Trocknen lassen, bevor sie den nächsten Tropfen auf die gleiche Stelle geben. Erkennen Sie alle Proben in einer Linie auf Stäben, die über das Ende einer warmen Heizplatte gehalten werden.

Fokussierung in Aceton. Die Fokussierung der Probe erfolgt in 100%Aceton. Fügen Sie ungefähr 70 ml Aceton auf den Boden des Entwicklungstanks hinzu.

Nehmen Sie die beiden Racks und senken Sie sie vorsichtig in den Entwicklungstank. Beobachten Sie die Lösungsmittelfront, während sie auf den Stab klettert, bis die Unterseite des Spots mit der Oberseite des Spots verschmilzt. Entfernen Sie die Stangen.

Trocknen Sie sie für etwa fünf Sekunden und wiederholen Sie dann den Vorgang. Wenn die Proben sehr konzentriert sind, kann diese Fokussierung ein drittes Mal durchgeführt werden. Erstes Entwicklungssystem.

Das erste Entwicklungssystem besteht aus Hexan, Ethylether und Ameisensäure bei 98,5 bis eins bis 0,5. Beginnen Sie damit, einen Messzylinder dreimal mit Hexan zu spülen und zu verwerfen. Füllen Sie den Messzylinder etwas mehr als 85 ml mit Hexan.

Verwenden Sie dann ein Pipett und die Flasche Hexan, um den Messzylinder auf 90 ml zu füllen. Dann bringen Sie den Boden des Meniskus unter Verwendung von Ethylether in die 91-ml-Linie, wodurch ein ml Ethylether entsteht. 0,5 ml Ameisensäure mit der Hamilton-Spritze zugeben.

Aber spülen Sie zuerst die Hamilton-Spritze dreimal mit der Ameisensäure ab, um sicherzustellen, dass kein Chloroform übrig bleibt, das zum Ausspülen der Probe aus der Spritze verwendet wurde. Fügen Sie zwei komplette Spritzen oder 25 Mikroliter gleichzeitig hinzu, um insgesamt 50 Mikroliter zu erhalten. Es ist wichtig, dass die Ameisensäure sofort mit Chloroform aus der Spritze gespült wird, um eine Korrodierung des Metalls in der Spritze zu vermeiden.

Sobald die Hamilton-Spritze sauber ist, machen Sie die Lösung mit Hexan und einem Pipett auf genau 100 ml. Dann kappen und invertieren Sie drei- oder viermal. Gießen Sie ca. 30 ml in den Entwicklungstank.

Verwenden Sie diese 30 ml, um das Papier zu benetzen und den Tank abzuspülen. Verwerfen Sie die Spüllösung. Die restlichen 70 ml in den Entwicklungstank geben.

Hinzufügen von Racks zum Entwicklungssystem. Das Hinzufügen von Stäben zum Entwicklungssystem ist für jede Entwicklung gleich. Stellen Sie sicher, dass der Timer für die Zeit eingestellt ist, in der die Stangen entwickelt werden sollen.

Und dann nehmen Sie die Racks und senken Sie sie vorsichtig in den Tank. Beobachten Sie, bis die Lösungsmittelfront die Probenstellen erreicht, und starten Sie dann den Timer. Zweites Entwicklungssystem.

Das zweite Entwicklungssystem ist Hexan, Ethylen und Ameisensäure, 79 bis 20 zu eins. Spülen Sie also wie zuvor den Messzylinder dreimal mit Hexan ab. Fügen Sie genau 20 ml Ether und dann einen ml Ameisensäure hinzu, wodurch das Volumen auf 21 ml steigt.

Dann bringen Sie das Volumen auf 100 mls mit Hexan. Fügen Sie mit den Flaschenpumpen etwa 75 ml Hexan hinzu. Und für den Teil verwenden Sie ein Pipett.

Kappen und invertieren Sie mehrmals. Geben Sie ca. 30 ml in den Entwicklungstank, um das Papier zu benetzen, und spülen Sie den Tank ab. Entsorgen Sie die 30 ml.

Fügen Sie die restlichen 70 hinzu und es ist bereit für den Satz von Ruten. Drittes Entwicklungssystem. Das dritte Entwicklungssystem ist eine Mischung aus Chloroform, Methanol und Chloroform-extrahiertem Wasser, 50, 40 bis 10.

Spülen Sie den Messzylinder dreimal mit Chloroform ab. Fügen Sie etwa 45 ml Chloroform hinzu. Bringen Sie mit einem Pipett den Boden des Meniskus auf die 50-ml-Marke.

Fügen Sie etwa 38 ml Methanol hinzu. Bringen Sie die Unterseite des Meniskus auf die 90-ml-Linie. Füllen Sie dann die letzten 10 ml mit Chloroform-extrahiertem Wasser.

Wie bei den anderen Entwicklungssystemen kehren Sie dies drei- oder viermal um und gießen Sie dann 30 ml in den Tank, um das Papier zu benetzen. Entsorgen Sie diese 30 ml und geben Sie die letzten 70 ml in den Tank. Vorbereitung des Methanols.

Um die für die Derivatisierung verwendete Hilditch-Lösung herzustellen, füllen Sie einen lipidsauberen, sauberen Messkolben, der ebenfalls entweder getrocknet oder dreimal zusätzlich mit Methanol gespült wurde, um Chloroform zu entfernen. Fügen Sie Methanol hinzu, bis sich der Boden des Meniskus an der zu enthaltenden Linie befindet. Nach der Messung des Methanols fügen Sie Natriumsulfat hinzu, das mindestens 24 Stunden bei 60 Grad Celsius getrocknet wurde.

Fügen Sie genug Natriumsulfat hinzu, so dass es den Boden des Volumenmetrischen Kolbens bedeckt. Einmal abgedeckt, zweimal invertieren, so dass jedes Wasser, das sich im Methanol befindet, vom Natriumsulfat absorbiert wird. Nach dem Invertieren und Schütteln mindestens fünf Minuten ruhen lassen.

Hinzufügen der Säure. Nachdem sich das Methanol fünf Minuten abgesetzt hat, dekantieren Sie es langsam in die endgültige Glasflasche, um sicherzustellen, dass das gesamte Natriumsulfat im Boden des Messkolbens verbleibt. Das Natriumsulfat bleibt normalerweise am Boden, so dass das gesamte Methanol abfließen sollte.

Lassen Sie das Volumetrie mit dem Natriumsulfat in der Rückseite des Abzugs trocknen. Fügen Sie dem Methanol mit einem PIPETMAN langsam Schwefelsäure hinzu. Fügen Sie ein paar Tropfen auf einmal hinzu, damit das Methanol nicht spuckt.

Sobald die gesamte Säure hinzugefügt wurde, kappen und vorsichtig umrühren, um zu mischen. Die Lösung ist jetzt bereit, für Derivate verwendet zu werden, aber sie muss wöchentlich nachgeholt werden. Herstellung der Derivate.

Aus einer Extraktfläschchen, bei der das Volumen auf eine bekannte Menge gebracht wurde, schwenken Sie und entfernen Sie dann einen Teil des Extrakts in eine lipidrichte, markierte 15-ml-Durchstechflasche. Die Menge, die Sie entfernen, wird durch die Konzentration der Probe aus dem Iatrosker bestimmt. Verwenden Sie ein lipidreinigtes Drummond-Pipett, um die Probe zu entfernen.

Sobald die Probe entnommen wurde, legen Sie die 15-ml-Durchstechflasche unter Stickstoff, um das Chloroform vollständig zu verdampfen. Die Originalprobe kann aufbewahrt und in den Gefrierschrank zurückgebracht werden. Wenn die Probe getrocknet ist, fügen Sie 1,5 ml Dichlormethan oder ein Pipett und drei ml der Hilditch-Lösung, die früher an diesem Tag hergestellt wurde, oder zwei Pipetten hinzu.

Diese Lösung wird dann unter Stickstoff gehalten, verwirbelt und vier Minuten lang in den Ultraschallgerät gegeben, bevor sie für eine Stunde in einen Ofen bei 100 Grad Celsius gestellt wird. Stoppen der Reaktion. Nach dem Erhitzen bei 100 Grad Celsius für eine Stunde und dem Abkühlen langsam 0,5 ml gesättigte Natriumbicarbonatlösung hinzufügen.

Blasen werden erzeugt, wenn die Säure neutralisiert wird. Dann fügen Sie 1,5 ml Hexan hinzu. Rekapitulieren und kräftig schütteln.

Lassen Sie es stehen, so dass es sich in zwei Schichten aufteilt. Verarbeiten Sie alle Proben. Wenn sie alle fertig sind, wird der erste für den nächsten Schritt bereit sein.

Entfernen der obersten Schicht. Sobald die Derivatisierung gestoppt wurde und eine klare Trennung in der 15-ml-Durchstechflasche vorliegt, entfernen Sie die oberste Schicht und legen Sie sie in eine lipidreinigte Zwei-ml-Durchstechflasche. Es ist besser, einen Teil der oberen Schicht zu belassen, als eine der unteren Schichten in die Zwei-ml-Durchstechflasche zu bekommen.

Sobald der Großteil der obersten Schicht entfernt wurde, kann der Rest der Lösung verworfen werden. Der Extrakt, der sich in den zwei ml befindet, sollte vollständig unter einem sanften Stickstoffstrom verdampft werden. Sobald die Durchstechflasche vollständig trocken ist, kann Hexan wieder hinzugefügt werden, und dann sollte die Probe beschallt, unter Stickstoff gehalten werden, und dann ist sie bereit, zum GC zu gehen. Repräsentative Ergebnisse.

Diese Abbildung zeigt rohe TLC-FIC-Chromatogramme unseres Standards, einer Diät, die mit Rapsöl und Lebergewebe von einem Lachs zubereitet wird, der mit dieser Diät gefüttert wird. Die Aquakultur, der am schnellsten wachsende Sektor der Nahrungsmittelproduktion, muss ihre Abhängigkeit von Fischmehl und Fischöl aus wilden Quellen verringern. Pflanzenöle werden als Ersatz für Fischöl in Aquafeeds untersucht.

Und Leber, der primäre Ort für den Fettstoffwechsel, ist für die Analyse vorgesehen. Wir können die Prävalenz von Triacylglycerolen in der Ernährung in der Leber und auch die Bedeutung von Membranphospholipiden in der Leber sehen. Diese Abbildung zeigt Chromatogramme eines Standards.

Lipide und absetzende Partikel, die sich hier vor der Küste angesammelt haben, und Lipide im Mysid, die sich in der Nähe der gleichen Tiefe angesammelt haben. Hier wurden Chromatogramme durch Plotting-Software verarbeitet. Als kohlenstoffreich mit einem sehr hohen Energiewert sind Lipide ein wichtiger Bestandteil der Produktivität von Regalflächen, die für den Kohlenstoffkreislauf besonders wichtig sind.

Mehr Oberflächenprimärproduktion erreicht den Meeresboden in flacherem Wasser. Wir fanden heraus, dass kleine Mysiden die höchste Lipidkonzentration in unseren Proben hatten. Hier werden Wachs und sterile Ester kombiniert.

Und es gibt eine Spitzenspaltung aufgrund des Vorhandenseins eines hohen Gehalts an mehrfach ungesättigten Fettsäuren. Die Schnelligkeit, mit der das Chromarod Iatroscan TLC-FID-System synoptische Lipidklassendaten aus kleinen Proben liefert, macht es zu einem leistungsstarken Werkzeug für das Screening mariner Proben vor der Durchführung detaillierterer chromatographischer Analysen. Solche Analysen erfordern in der Regel die Freisetzung von Komponentenverbindungen aus Lipidextrakten und die Derivatisierung, um die Flüchtigkeit zu erhöhen.