Name: Bewertung des agrochemischen Risikos für gepaarte Honigbienenköniginnen (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-03-03T14:30:00.000+00:00
Duration: 8 min 49 s
Description: Erfahren Sie eine Laborprotokoll zur Bewertung agrochemischer Risiken für Honigbienenköniginnen mittels Queen Monitoring Cages. Diese Methode ermöglicht kontrollierte Exposition und Überwachung der Eiablagerate.

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Vielen Dank an Dr. Amy Cash-Ahmed, Nathanael J. Beach und Alison L. Sankey für ihre Unterstützung bei der Durchführung dieser Arbeit. Die Erwähnung von Handelsnamen oder kommerziellen Produkten in dieser Veröffentlichung dient ausschließlich der Bereitstellung spezifischer Informationen und impliziert keine Empfehlung oder Billigung durch das US-Landwirtschaftsministerium. USDA ist ein Anbieter von Chancengleichheit und Arbeitgeber. Diese Forschung wurde durch ein Stipendium der Defense Advanced Research Projects Agency # HR0011-16-2-0019 an Gene E. Robinson und Huimin Zhao, das USDA-Projekt 2030-21000-001-00-D und die Phänotypic Plasticity Research Experience für Community College-Studenten an der University of Illinois in Urbana Champaign unterstützt.

1. QMC-Montage
<ol><li>Montieren Sie QMCs aus Teilen (Abbildung 1A) mit einer einzigen Eiablageplatte (ELP), die wie in Abbildung 1Bgezeigt eingefügt wird. Fügen Sie feeder Tubes erst hinzu, nachdem die Arbeiter in den Käfig gegeben wurden. Bedecken Sie die 4 Einzugslöcher vorübergehend mit Klebeband in Laborqualität.</li>
	<li>Führen Sie den Königinnenausschluss und die Tür der Futterkammer über die Futterkammer ein, um zu verhindern, dass die Königin die Fütterungskammer betritt und die behandelte Diät kontaktiert. Siehe Fine et al.32 für weitere Montagedetails.</li>
	<li>Sammeln Sie die Wachswabenrahmen, die die gekappte Arbeiterbrut aus Honigbienenvölkern enthalten, 24 h vor der Erwachsenenexlosion und legen Sie sie in einen Inkubator (34,5 ° C) in einer Brutbox. 24 Stunden später bürsten Sie die verdorbenen Bienen von den Rahmen in einen offenen Behälter, der mit einer Insektenbarrierefarbe (z. B. Fluon) ausgekleidet wurde, um zu verhindern, dass die Bienen herauskriechen.</li>
	<li>Mindestens 50 Bienen nach Gewicht (5 g ≈ 50 Bienen44,45) in die Eiablagekammer jedes QMC geben. Um sicherzustellen, dass ein vielfältiger genetischer Pool von Arbeitern im Experiment vertreten ist, erhalten Sie eine ungefähr gleiche Anzahl von Arbeitsbienen aus mindestens drei Kolonien und mischen Sie sie, bevor Sie sie zu den QMCs hinzufügen. HINWEIS: Neu entlassene Arbeitsbienen, die weniger als 1 Tag alt sind, können aufgrund ihrer unterentwickelten Flugmuskulatur und der ungehärteten Kutikula nicht fliegen oder stechen. Wenn sie in diesem Alter hinzugefügt werden, besteht keine Notwendigkeit, sie vor der Handhabung zu betäuben. Sie können gewogen werden, indem Bienen mit einem kleinen 1/4 Tassen Volumenmessbecher vorsichtig aus dem Behälter geschöpft und in einen zweiten Behälter (ausgekleidet mit Insektenschutzfarbe, z. B. Fluon) gelegt werden, der auf einer Waage geteert wurde. Die Fläche der Rahmen, die von einer gekappten Brut bedeckt sind, sollte ungefähr gleich sein, um sicherzustellen, dass die Quellkolonien in den QMC-Arbeiterpopulationen gleichermaßen vertreten sind. Die Homogenisierung von Arbeitsbienen kann erreicht werden, indem neu emittierte Bienen aus Rahmen, die aus allen Kolonien entnommen wurden, in denselben Behälter gebürstet werden und sie 5 Minuten lang mischen können, bevor sie zu QMCs hinzugefügt werden.</li>
	<li>Fügen Sie die Feeder hinzu, die Saccharoselösung, Wasser und Pollenzusatz enthalten (siehe Abschnitt 2).</li>
	<li>Setzen Sie die einzelnen gepaarten Königinnen CO2-Gas aus, um die Eiablage46 zu stimulieren und die Übertragung in QMC zu erleichtern.<ol>
<li>Verwenden Sie Königinnen, die von einem kommerziellen Züchter gekauft wurden, innerhalb von 48 Stunden nach Erhalt. Während sich die Königin noch im Versandkäfig befindet, legen Sie sie in eine durchsichtige Plastiktüte. Legen Sie ein Ende eines Kunststoffrohrs, das miteinem CO 2-Gasbehälter verbunden ist, in den Beutel und öffnen Sie vorsichtig das Kanisterventil, damit das CO2-Gas fließen kann.</li>
		<li>Wenn der Beutel mit Gas aufgeblasen wurde, schließen Sie gleichzeitig das Kanisterventil und halten Sie den Beutel geschlossen, um das Gas im Inneren einzufangen. Halten Sie den Beutel 30 Sekunden lang geschlossen oder bis sich die Königin nicht mehr bewegt. Entfernen Sie die Königin und öffnen Sie den Versandkäfig, sobald beobachtet wird, dass sie bewusstlos ist.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Öffnen Sie teilweise die Tür zur Eierlegekammer, legen Sie die bewusstlose Königin vorsichtig hinein und schließen Sie den Deckel, wobei Sie darauf achten, die Königin oder die Arbeiterinnen nicht darin zu zerquetschen. Fügen Sie die zweite Eierlegeplatte zu jedem QMC hinzu, wie in Abbildung 1C gezeigt. Legen Sie ein Stück Laborband über die Oberseite der beiden ELPs, um zu verhindern, dass sie sich vom QMC-Rahmen trennen und verhindern, dass die Arbeiter den Käfig verlassen.</li>
	<li>Stellen Sie die Käfige in einen dunklen Inkubator mit stabilen Umgebungsbedingungen von 34 ± 0,5 ° C und 60% ± 10% relativer Luftfeuchtigkeit, wie die Bedingungen in einer normalen Kolonie.</li>
</ol><img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62316/62316fig01.jpg"> Abbildung 1. A: Zerlegte QMC. B: Teilweise montiertes QMC mit 1 ELP eingesetzt. C: Komplett montiertes QMC mit 2 ELPs. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62316/62316fig01large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.</a>
2. Zubereitung und Verabreichung von Diäten, die mit Agrochemikalien versetzt sind
<ol><li>Um 1000 g 50% (g/g) Saccharoselösung herzustellen, legen Sie einen Rührstab in den Boden einer sauberen 1 L Glasreagenzflasche. Fügen Sie 500 g Saccharose und 500 ml entionisiertes Wasser hinzu. Schrauben Sie den Deckel der Flasche ab und verwenden Sie eine beheizte Rührplatte, die auf niedrige Hitze eingestellt ist, um die Lösung zu mischen, bis sich die gesamte Saccharose aufgelöst hat. Lassen Sie die Lösung auf Raumtemperatur abkühlen, bevor Sie die agrochemischen Stammlösungen hinzufügen.</li>
	<li>Bereiten Sie die Stammlösungen von Agrochemikalien in einem geeigneten Lösungsmittel wie Aceton in einer Konzentration vor, die der Nahrung zugesetzt werden kann, um die gewünschte Endkonzentration der interessierenden Agrochemikalie zu erreichen. HINWEIS: Bei der Verwendung von Aceton als Vehikellösungsmittel schreiben die Richtlinien der Organisation für wirtschaftliche Zusammenarbeit und Entwicklung (OECD) vor, dass die Endkonzentration von Aceton in der Ernährung bei Tests zur chronischen oralen Toxizität an erwachsenen Honigbienen47≤ 5% betragen muss. Einige Lösungsmittel wie n-Methyl-2-pyrrolidon5,31 und Dimethylsulfoxid25 können jedoch toxische Wirkungen unterhalb dieser Konzentration ausüben, daher wird empfohlen, die Lösungsmittelkonzentrationen in der Behandlungsdiät so niedrig wie möglich zu halten. Je nach Volumen und Art des verwendeten Lösungsmittels kann es erforderlich sein, sowohl eine Lösungsmittelkontrollgruppe als auch eine Negativkontrollgruppe einzubeziehen, um sicherzustellen, dass potenzielle Wirkungen aufgrund von Lösungsmitteltoxizität nachgewiesen werden. Bei der Verwendung von formulierten Produkten muss die Menge des verwendeten Produkts auf der Grundlage der in der Formulierung vorhandenen Konzentration angepasst werden. Abhängig von der Stabilität der im Lösungsmittel interessierenden Agrochemikalie können Stammlösungen bis zu 2 Wochen bei -20 °C aufbewahrt werden.</li>
	<li>Wählen Sie subletale Dosen basierend auf den Ergebnissen des OECD-Tests Nr. 245: Honigbiene (Apis mellifera L.),Chronischer oraler Toxizitätstest (10-Tage-Fütterung)47und identifizieren Sie die relevante Literatur durch Abfrage der Ecotox-Wissensdatenbank48.</li>
	<li>Verabreichen Sie die agrochemischen Behandlungen in einer Saccharoselösung, einem kommerziellen Pollenpräparat (falls als Pulver erhältlich) oder beidem. Bereiten Sie die experimentelle Diät für die Verwendung am selben Tag vor, indem Sie eine geeignete Menge Stammlösung zu gekühlter / raumtemperaturiger 50% iger Saccharoselösung (w / w) hinzufügen. Gründlich durch Wirbeln oder mit einem Rührstab auf mittlere Geschwindigkeit mischen. Für Pollenpräparate fügen Sie die agrochemisch geschnürte Saccharoselösung dem pulverförmigen Präparat anstelle des Sirups gemäß den Protokollen des Herstellers hinzu und stellen Sie sicher, dass das Volumen der verwendeten Stammlösung entsprechend dem Endgewicht der Pollendiät angepasst wird. Beispiele für Berechnungen finden Sie in Tabelle 1.</li>
	<li>Bereiten Sie die Dosierröhrchen aus 2 ml Mikrozentrifugenröhrchen vor.<ol>
<li>Für flüssige Diät-Feeder erhitzen Sie die Spitze einer 20-Gauge-Nadel auf einer Kochplatte / Herdplatte und durchstechen Sie den Boden des Röhrchens zweimal. Schließen Sie den Röhrchendeckel und pipettieren Sie ca. 1,5 ml Saccharoselösung oder Wasser durch eines der Einstichlöcher. Stellen Sie das Rohr mit der punktierten Seite nach oben, bis es zum QMC hinzugefügt wird.</li>
		<li>Verwenden Sie für Pollenergänzungsfütterer eine Rasierklinge, um den Boden der Röhre abzuschneiden. Schließen Sie den Deckel und drücken Sie eine 1-2 g Kugel Pollenergänzung in die Tube, bis sie den Deckel berührt.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Notieren Sie die Feedergewichte, bevor Sie sie in die QMCs legen. Halten Sie die ungenutzte Diät nicht länger als 48 Stunden bei 4 ° C.</li>
</ol><table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td></td>
			<td>Gewünschte Konzentration</td>
			<td>Gewünschte Lösungsmittel-Vehikel-Konzentration</td>
			<td>Gewünschtes Endvolumen/Masse der Saccharoselösung</td>
			<td>Voume der Stammlösung</td>
			<td>Imidacloprid auf Lager Lösung</td>
			<td>Vorgeschlagenes Stammlösungsrezept</td>
		</tr>
<tr>
<td>Saccharose-Lösung</td>
			<td>10 ppb (w/w)</td>
			<td>0,05% (v/v)</td>
			<td>81,45 ml/100 g*</td>
			<td>40,7 μL</td>
			<td>0,001 mg/40,7 μL</td>
			<td>0,02 mg/814 μL</td>
		</tr>
<tr>
<td>Pollen Ergänzung</td>
			<td>10 ppb (w/w)</td>
			<td></td>
			<td>10 g**</td>
			<td>4,07 μL</td>
			<td>0,0001 mg/4,07 μL</td>
			<td>0,02 mg/814 μL</td>
		</tr>
<tr>
<td>Saccharose-Lösung</td>
			<td>50 ppb (w/w)</td>
			<td>0,05% (v/v)</td>
			<td>78,5 ml/100 g*</td>
			<td>40,7 μL</td>
			<td>0,005 mg/40,7 μL</td>
			<td>0,1 mg/814 μL</td>
		</tr>
<tr>
<td>Pollen Ergänzung</td>
			<td>50 ppb (w/w)</td>
			<td></td>
			<td>10 g**</td>
			<td>4,07 μL</td>
			<td>0,0005 mg/4,07 μL</td>
			<td>0,1 mg/814 μL</td>
		</tr>
</tbody></table>Tabelle 1: Beispielrezepte für behandelte Saccharoselösung, Pollenergänzung und Brühenlösung. *Volumen basierend auf der Dichte von 50% (w/w) Saccharoselösung (1,228 g/ml). ** Die Dichte des Pollenpräparats variiert je nachdem, welches Produkt verwendet wird, aber wenn dieses Lösungsmittelvolumen verwendet wird, liegt die endgültige Lösungsmittelkonzentration im Pollenpräparat im gewünschten Bereich von ≤ 5% vol.
3. Überwachung - Eierproduktionsrate
<ol><li>Quantifizieren Sie die Eiablage 1 bis 2 Mal pro Tag morgens und / oder abends. Beginnen Sie mit dem Entfernen von QMCs aus dem Inkubator, um nach Eiern zu suchen. HINWEIS: In einem erfolgreichen Experiment beginnt die Eierproduktion in den meisten Kontroll-QMCs innerhalb von 3 Tagen nach der ersten Käfigmontage. Nehmen Sie nur so viele QMCs gleichzeitig aus dem Inkubator, die innerhalb von 10 Minuten überprüft und gefüttert werden können. Längere Zeiträume außerhalb des Inkubators können die Eierproduktion stören.</li>
	<li>Untersuchen Sie die Rückseite der klaren ELPs auf Eier. Wenn Eier vorhanden sind, entfernen Sie die Türverkleidung vor dem Gewünschten Teller. Entfernen Sie das Klebeband von der anderen Seite der ELPs und schieben Sie die Türverkleidung vorsichtig zwischen dem ELP und den Bienen im QMC, wobei Sie darauf achten, dass keine Bienen zerquetscht werden, die die Zellen in den ELPs reinigen könnten.</li>
	<li>Entfernen Sie bei eingeschalteter Türverkleidung das ELP und zählen und notieren Sie die Anzahl der Eier in den ELP-Zellen. Entfernen Sie die Eier, indem Sie den Rand des ELP mit der offenen Zellseite nach unten auf eine harte Oberfläche (z. B. die Lippe eines Abfallbehälters) klopfen. Sobald die Eier herausfallen, ersetzen Sie das leere ELP im QMC. Entfernen und ersetzen Sie vorsichtig die Türverkleidung hinter dem ELP an der Außenseite des QMC. Wiederholen Sie dies bei Bedarf mit dem zweiten ELP und setzen Sie das Band nach Abschluss des QMC wieder ein. HINWEIS: Die Eierproduktion nimmt im Allgemeinen ab und die Mortalität steigt in qmCs nach 2 Wochen32,33, daher wird empfohlen, die Experimente nach 14 Tagen abzuschließen.</li>
</ol>4. Überwachung - Lebensmittelverzehr
<ol><li>Ersetzen Sie alle in qmc-Feedern verbleibenden Lebensmittel alle zwei Tage durch frisch zubereitete Diät. Bereiten Sie neue Futterröhrchen (einschließlich Wasser) vor und wiegen Sie sie, bevor Sie QMCs zur Überwachung aus dem Inkubator entfernen. Tauschen Sie alle alten Tuben durch neue aus und wiegen Sie alte Tuben, bevor Sie nicht verbrauchte Diät entsorgen. Vergleichen Sie das Endgewicht des Feeder-Röhrchens und des nicht verbrauchten Futters mit dem Gewicht desselben Feeder-Röhrchens, bevor Sie es in den QMC legen, um den Futterverbrauch zu schätzen.</li>
	<li>Überprüfen Sie zwischen den Tagen, an denen feeder ausgetauscht werden sollen, den Futterverbrauch einmal täglich (zur gleichen Zeit, wenn QMCs für die Eierproduktion überwacht werden), um sicherzustellen, dass die Feeder niemals leer sind. Wenn eine Feeder-Tube leer oder fast leer ist, entfernen Sie sie, füllen Sie sie auf, notieren Sie das Gewicht der Tube vorher und nachher und addieren Sie die Differenz zum 2-Tage-Diätverbrauch für den QMC.</li>
</ol>5. Überwachung - Lebensfähigkeit des Embryos
<ol><li>Entfernen Sie an einem ausgewählten Punkt während eines QMC-Experiments ELPs, die frisch gelegte Eier enthalten, gemäß Schritt 3aus dem QMC , entfernen Sie jedoch keine Eier aus dem ELP.</li>
	<li>Decken Sie das ELP mit einem universellen Mikrotiterdeckel ab und legen Sie es in einen Exsikkator mit einer gesättigten K2SO4-Lösung (150 gK2SO4 in 1 L Wasser, in einer flachen Schale aufbewahrt). HINWEIS: Etwas Salz sollte auf dem Boden der Schale sichtbar sein, nachdem die Mischung im Inkubator auf Temperatur gekommen ist.</li>
	<li>Bewahren Sie den Exsikkator in einem Inkubator auf 34,5 ° C auf, was zu einer relativen Luftfeuchtigkeit von 95% im Inneren des Exsikkators führt, ähnlich den von Collins49verwendeten Bedingungen . HINWEIS: Fast alle Eier schlüpfen innerhalb von 72 ± 6 Stunden nach derLege 49,so dass die Schlüpfraten bereits 78 Stunden nach der Entfernung der ELPs aus dem QMC beurteilt werden können. Eine "C" -förmige Larve im Boden der Zelle weist auf ein erfolgreiches Schlüpfereignis hin. Eine gewisse Variation in diesem Timing ist möglich, wenn es sich beispielsweise um Drohnen und nicht um Arbeiter50 handelt.</li>
</ol>6. Stichproben von Arbeitnehmern
<ol><li>Wenn die QMCs mit überschüssigen Arbeitskräften gefüllt wurden, nehmen Sie die Arbeiterbienen zu einem ausgewählten Zeitpunkt während des Experiments zur Beurteilung behandlungsinduzierter Veränderungen in ihrer Physiologie ab. Führen Sie die Sammlungen in Verbindung mit täglichen Fütterungs- und Eierzählaktivitäten durch, um die Zeit zu minimieren, für die sich die QMCs außerhalb des Inkubators befinden.</li>
	<li>Platzieren Sie vor der Probenahme eine Türverkleidung zwischen einem ELP und dem Inneren des QMC und entfernen Sie das ELP. Heben Sie die Türverkleidung vorsichtig ca. 0,5 cm von der Basis des Käfigs an und entfernen Sie eine Arbeiterbiene mit einer federleichten Pinzette aus dem Inneren des QMC. Um zu verhindern, dass Bienen entweichen, bedecken Sie Teile der 0,5 cm großen Öffnung bei Bedarf mit einem behandschuhten Finger oder einem Stück Baumwolle.</li>
	<li>Bewahren Sie die gesammelte Biene für die Folgeanalyse auf und wiederholen Sie diesen Vorgang, bis die gewünschte Anzahl von Proben entnommen wurde. Für die Genexpressionsanalyse wird dringend empfohlen, Bienen in flüssigem Stickstoff einzufrieren und sofort bei -80 °C zu lagern51.</li>
</ol>7. Sterblichkeit der Arbeitnehmer
<ol><li>Beurteilen Sie die Sterblichkeit der Arbeiter während des Experiments, indem Sie die Anzahl der toten Bienen am Boden der Futterkammer und der Eiablagekammer zählen. Führen Sie diese Beurteilung in Verbindung mit der täglichen Quantifizierung der Eiablage durch.</li>
	<li>Entfernen Sie die toten Bienen vorsichtig mit einer Pinzette durch die Feederlöcher und bedecken Sie das Loch mit einem behandschuhten Finger oder einem Stück Baumwolle, während die Pinzette nicht eingeführt wird.</li>
	<li>Entfernen Sie die toten Bienen aus der Eiablagekammer, indem Sie die Türverkleidung vorsichtig etwa 0,5 cm von der Basis des Käfigs anheben und eine Pinzette einsetzen. Um zu verhindern, dass Bienen entweichen, bedecken Sie Teile der 0,5 cm großen Öffnung bei Bedarf mit einem behandschuhten Finger oder einem Stück Baumwolle.</li>
	<li>Beurteilen Sie die Arbeitersterblichkeit am Ende des Experiments, indem Sie alle toten Bienen aus den QMCs entfernen und zählen, indem Sie die zuvor beschriebenen Methoden anwenden, bevor sie die verbleibenden Bienen einschläfern. HINWEIS: In Abwesenheit von Arbeiterbienen produzieren Königinnen keine Eier und verhungern innerhalb von 24 Stunden. Wenn also festgestellt wird, dass alle Arbeiter in einem QMC tot sind, sollte der QMC aus dem Experiment entfernt werden. Ebenso, wenn eine Königin während des Experiments stirbt, sollte die QMC entfernt werden, und die Daten sollten angemessen zensiert werden.</li>
</ol>

Die Autoren haben keine Interessenkonflikte zu erklären.

Die Fruchtbarkeit weiblicher Solitärinsekten sowie Von Königinnen in eusozialen Insektenkolonien kann durch abiotische Stressoren wie Agrochemikalien25,28,29,30,33beeinflusst werden . Bei Honigbienen können die Auswirkungen von Agrochemikalien auf Königinnen indirekt sein, da sie durch Veränderungen in ihrer Pflege und Fütterung durch Arbeiterbienen auftreten ...

Aufgrund der weltweit gestiegenen Nachfrage nach landwirtschaftlichen Erzeugnissen erfordern moderne landwirtschaftliche Praktiken häufig den Einsatz von Agrochemikalien zur Bekämpfung zahlreicher Schädlinge, von denen bekannt ist, dass sie die Ernteerträge verringern oder schädigen1. Gleichzeitig verlassen sich die Erzeuger vieler Obst-, Gemüse- und Nusskulturen auf die Bestäubungsdienste kommerzieller Honigbienenvölker, um reichlich Ernteerträge zu erzielen2. Diese Praktiken können dazu führen, dass Bestäuber, einschließlich Honigbienen (Apis mellifera), schädlichen Pestizidrückständen ausgesetzt sind3. Gleichzeitig erfordert das weit verbreitete Vorhandensein von parasitärem Varroa destructor Milbenbefall in Honigbienenvölkern häufig, dass Imker ihre Bienenstöcke mit Mitiziden behandeln, was sich auch negativ auf die Gesundheit und Langlebigkeit der Kolonie auswirken kann4,5,6. Um die schädlichen Auswirkungen agrochemischer Produkte zu reduzieren und zu mildern, ist es notwendig, ihre Sicherheit für Honigbienen vor ihrer Umsetzung vollständig zu bewerten, damit Empfehlungen für ihre Verwendung zum Schutz nützlicher Insekten abgegeben werden können.
Derzeit stützt sich die Environmental Protection Agency (EPA) auf eine abgestufte Risikobewertungsstrategie für die Pestizidexposition gegenüber Honigbienen, die Labortests an erwachsenen Bienen und manchmal Honigbienenlarven umfasst7. Wenn Labortests der unteren Ebene die Bedenken hinsichtlich der Toxizität nicht ausräumen, können Feld- und Halbfeldtests auf höherer Ebene empfohlen werden. Während diese Labortests wertvolle Einblicke in die möglichen Auswirkungen von Agrochemikalien auf die Langlebigkeit der Arbeiter liefern, sind sie nicht unbedingt prädiktiv für ihre Auswirkungen auf Königinnen, die sich biologisch signifikant von Arbeiterinnen unterscheiden8 und verhaltensmäßig9. Darüber hinaus gibt es zahlreiche potenzielle Auswirkungen von Agrochemikalien auf Insekten über die Mortalität hinaus, die erhebliche Folgen für soziale Insekten haben können, die auf koordinierte Verhaltensweisen angewiesen sind, um als Kolonieeinheit zu fungieren10,11.
Obwohl die Mortalität die am häufigsten in Betracht gezogene Wirkung von agrochemischen Pestiziden ist12, können diese Produkte eine breite Palette von Auswirkungen sowohl auf Ziel- als auch auf Nichtzielarthropodenhaben,einschließlich verändertem Verhalten13,14 , 15,16, Abstoßung oder Attraktivität17,18,19, Veränderungen der Fütterungsmuster20,21,22 , und erhöhte oder verminderte Fruchtbarkeit20,21,22,23,24,25. Für soziale Insekten können diese Effekte die Interaktionen und Funktionen der Kolonien systemisch stören11. Von diesen Funktionen kann die Fortpflanzung, die stark von einer einzigen eierlegenden Königin abhängig ist, die vom Rest der Kolonieeinheit9unterstützt wird, besonders anfällig für Störungen aufgrund von Pestizidexposition sein.
Studien, die an unreifen Königinnen durchgeführt wurden, haben gezeigt, dass die Entwicklungsexposition gegenüber Mitiziden das Verhalten, die Physiologie und das Überleben der erwachsenen Königin beeinflussen kann26,27. In ähnlicher Weise haben Studien mit vollen oder reduzierten Kolonien gezeigt, dass Agrochemikalien erwachsene Honigbienenköniginnen beeinflussen können, indem sie den Paarungserfolg28verringern, die Eiablage29verringern und die Lebensfähigkeit der produzierten Eier verringern25,30,31. Diese Phänomene waren bisher ohne den Einsatz ganzer Kolonien schwer zu beobachten, was vor allem auf einen Mangel an verfügbaren Labormethoden zurückzuführen war. Eine Methode zur Untersuchung der Eiablage von Königinnen unter streng kontrollierten Laborbedingungen unter Verwendung von Queen Monitoring Cages (QMC)32 wurde jedoch kürzlich angepasst, um die Auswirkungen von Agrochemikalien auf die Fruchtbarkeit der Königin zu untersuchen33. Hier werden diese Techniken zusammen mit zusätzlichen Methoden zur Messung und Verfolgung des Nahrungsverbrauchs der Arbeitnehmer in QMCs ausführlich beschrieben.
Diese Methoden sind vorteilhafter als Experimente, die Kolonien in voller Größe erfordern, da sie die Verabreichung präziser Dosen von Agrochemikalien an eine stark reduzierte Anzahl von Arbeitern im Vergleich zu den Zehntausenden ermöglichen, die typischerweise in einer Kolonie34vorhanden sind, die dann die Königin versorgen. Diese Expositionstechnik spiegelt die Exposition aus zweiter Hand wider, die Königinnen in realen Szenarien erleben würden, da sich Königinnen innerhalb einer Kolonie nicht selbst ernähren und sich auf Arbeiter verlassen, um sie mit Diät zu versorgen9. Ebenso verlassen Königinnen den Bienenstock im Allgemeinen nicht, außer während der Koloniereproduktion (Schwärmen) für Paarungsflüge35. Gepaarte Honigbienenköniginnen können von kommerziellen Königinnenzüchtern gekauft und über Nacht verschickt werden. Typischerweise verkaufen Königinnenzüchter Königinnen direkt, nachdem sie bestätigt haben, dass sie mit der Eiablage begonnen haben, was als Hinweis auf eine erfolgreiche Paarung angesehen wird. Wenn genauere Informationen über das Alter oder die Verwandtschaft der Königin benötigt werden, können sich die Forscher vor der Bestellung mit dem Königinzüchter beraten.
QMCs ermöglichen eine genaue Beobachtung und Quantifizierung der Eiablage von Honigbienenköniginnen und der Brutraten von Eiern32,33, was wertvolle Daten über die Auswirkungen der agrochemischen Exposition auf die Fruchtbarkeit der Königin liefert. Die hier vorgestellten repräsentativen Ergebnisse beschreiben ein Experiment zur Quantifizierung von Eiablage, Diätkonsum und Embryonenlebensfähigkeit in QMCs unter chronischer Exposition gegenüber feldrelevanten Konzentrationen des systemischen Neurotoxikanten Neonicotinoid-Pestizids Imidacloprid36. Einmal aufgetragen, transloziert Imidacloprid in Pflanzengewebe37, und Rückstände wurden die Pollen und der Nektar zahlreicher bienenbestäubter Pflanzen38,39,40nachgewiesen . Die Exposition gegenüber Imidacloprid kann eine breite Palette von schädlichen Auswirkungen auf Honigbienen haben, einschließlich einer beeinträchtigten Futtersuche16,einer beeinträchtigten Immunfunktion41und einer verringerten Rate der Kolonieausdehnung und des Überlebens42,43. Hier wurde Imidacloprid für die Verwendung als Testsubstanz ausgewählt, da Feldexperimente gezeigt haben, dass es die Eiablage der Honigbienenkönigin beeinflussen kann29

<table><tbody><tr><td>Fluon</td><td>BioQuip, Rancho Dominguez, CA</td><td>2871A</td><td></td></tr><tr><td>Honigbienenköniginnen</td><td>Olivarez Honey Bees, Orland, CA</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Imidacloprid</td><td>Sigma-Aldritch, St. Louis, MO</td><td>37894</td><td></td></tr><tr><td>MegaBee Powder</td><td>MegaBee, San Dieago, CA</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Mikrozentrifugenröhrchen 2 mL</td><td>ThermoFisher Scientific, Waltham, MA</td><td>02-682-004</td><td></td></tr><tr><td>Nadeln 20 Gauge</td><td>W. W. Grainger, Lake Forest, IL</td><td>5FVK4</td><td></td></tr><tr><td>Kaliumsulfat</td><td>Sigma-Aldritch, St. Louis, MO</td><td>P0772</td><td></td></tr><tr><td>Königinnenüberwachungskäfige</td><td>Universität von Illinois Urbana-Champaign</td><td></td><td>Patentanmeldenummer: 20190350175</td></tr><tr><td>Saccharose</td><td>Sigma-Aldritch, St. Louis, MO</td><td>S8501</td><td></td></tr><tr><td>Universal-Mikroplattendeckel</td><td>ThermoFisher Scientific, Waltham, MA</td><td>5500</td><td></td></tr></tbody></table>

bewertung des agrochemischen risikos für gepaarte honigbienenköniginnen

Assessing Agrochemical Risk to Mated Honey Bee Queens

Aktuelle Risikobewertungsstrategien für Honigbienen stützen sich stark auf Labortests, die an erwachsenen oder unreifen Arbeitsbienen durchgeführt wurden, aber diese Methoden erfassen möglicherweise nicht genau die Auswirkungen der agrochemischen Exposition auf Honigbienenköniginnen. Als einzige Produzentin von befruchteten Eiern in einer Honigbienenkolonie ist die Königin wohl das wichtigste Einzelmitglied einer funktionierenden Kolonieeinheit. Daher sollte das Verständnis, wie sich Agrochemikalien auf die Gesundheit und Produktivität von Königinnen auswirken, als kritischer Aspekt der Risikobewertung von Pestiziden angesehen werden. Hier wird eine angepasste Methode vorgestellt, um Honigbienenköniginnen und Arbeiterköniginnen Begleitern agrochemischen Stressoren auszusetzen, die durch eine Arbeiterdiät verabreicht werden, gefolgt von der Verfolgung der Eierproduktion im Labor und der Beurteilung der ersten Instar-Eklosion mit einem speziellen Käfig, der als Queen Monitoring Cage bezeichnet wird. Um den Verwendungszweck der Methode zu veranschaulichen, werden die Ergebnisse eines Experiments beschrieben, in dem Arbeiterinnenbegleiterinnen mit subletalen Dosen von Imidacloprid gefüttert und die Auswirkungen auf Königinnen überwacht wurden.

Die Produktion von Eiern wurde in QMCs überwacht, die wie oben beschrieben zusammengestellt und aufrechterhalten wurden, mit einmal täglichen Beobachtungen der Eierproduktion und 15 Käfigen pro Behandlungsgruppe. Neu gepaarte Königinnen von hauptsächlich krainer Beständen wurden gekauft und über Nacht von einem Königinnenzüchter verschifft, und Honigbienenarbeiter wurden aus 3 Kolonien gewonnen, die nach kommerziellen Standardmethoden in der Bienenforschungseinrichtung der Universität von Illinois Urbana-Champaign gehalt...

Dieses Protokoll wurde entwickelt, um das Verständnis dafür zu verbessern, wie Agrochemikalien die Reproduktion von Honigbienen (Apis mellifera) beeinflussen, indem Methoden etabliert werden, um Honigbienenköniginnen und ihre Arbeiterpfleger in einer kontrollierten Laborumgebung Agrochemikalien auszusetzen und ihre relevanten Reaktionen sorgfältig zu überwachen.

Bewertung des agrochemischen Risikos für gepaarte Honigbienenköniginnen

Current risk assessment strategies for honey bees rely heavily upon laboratory tests performed on adult or immature worker bees, but these methods may not ...

Agrochemische Exposition kann große Auswirkungen auf alle Mitglieder einer Honigbienenkolonie haben, einschließlich des wichtigsten Mitglieds, Königinnen. Aber bis vor kurzem waren nur wenige Werkzeuge verfügbar, um diese Effekte zu untersuchen. Diese Technik ermöglicht es Forschern, Königinnen unter kontrollierten Bedingungen Agrochemikalien auszusetzen, die Bedingungen simulieren, die sie im Feld erleben könnten.Es ist ziemlich einfach, das Eiablageverhalten der Honigbienenkönigin zu stören, daher ist es wichtig, beim Umgang mit Arbeiterinnen und Königinnen vor und während des Experiments vorsichtig zu sein. Amy Floyd und Eliza Litsey, Labortechniker an der Invasive Species and Pollinator Health Research Unit, Honeybee Research Lab, werden diese Verfahren demonstrieren. Bauen Sie zunächst Königinnenüberwachungskäfige oder QMCs zusammen, indem Sie die Türverkleidungen einsetzen, und führen Sie dann den Königinnenausschluss in die Tür der Futterkammer über der Fütterungskammer ein, um zu verhindern, dass die Königin die behandelte Diät betritt und kontaktiert.Fügen Sie eine einzelne ELP ein. Fügen Sie erst dann Zuführröhrchen hinzu, nachdem die Arbeiter in den Käfig gegeben wurden, und bedecken Sie die vier Zuführlöcher vorübergehend mit Klebeband in Laborqualität. Nachdem Sie die Wachswabenrahmen mit der gekappten Arbeiterbrut aus Honigbienenvölkern gesammelt und inkubiert haben, bürsten Sie die geschlossenen Bienen in einen offenen Behälter ab, der mit einer Insektenbarrierefarbe ausgekleidet ist, um zu verhindern, dass die Bienen herauskriechen.Fügen Sie mindestens 50 Bienen nach Gewicht in die Eiablagekammer jedes QMC. Um sicherzustellen, dass ein vielfältiger genetischer Pool eingeführt wird, erhalten Sie eine ähnliche Anzahl von Arbeitsbienen aus mindestens drei Kolonien und lassen Sie sie mischen, bevor Sie Bienen zu den QMCs hinzufügen.Verwenden Sie Königinnen, die von einem kommerziellen Züchter gekauft wurden, innerhalb von 48 Stunden nach Erhalt. Während sich die Königin noch im Versandkäfig befindet, legen Sie sie in eine durchsichtige Plastiktüte. Legen Sie dann ein Ende eines Kunststoffrohrs, das mit einem Kohlendioxidgaskanister verbunden ist, in den Beutel und öffnen Sie vorsichtig das Kanisterventil, damit das Kohlendioxidgas fließen kann.Wenn der Beutel mit Gas aufgeblasen wurde, schließen Sie gleichzeitig das Kanisterventil und halten Sie den Beutel geschlossen, um das Gas im Inneren einzufangen. Halten Sie den Beutel 30 Sekunden lang geschlossen oder bis sich die Königin nicht mehr bewegt. Entfernen Sie die Königin, indem Sie den Versandkäfig öffnen, sobald beobachtet wird, dass die Königin bewusstlos ist.Öffnen Sie teilweise die Tür zur Eierlegekammer, legen Sie die bewusstlose Königin vorsichtig hinein und schließen Sie den Deckel. Fügen Sie jedem QMC den zweiten ELP hinzu. Legen Sie ein Stück Laborband über die Oberseite der beiden ELPs, um zu verhindern, dass sie sich vom QMC-Rahmen trennen, und verhindern, dass Arbeiter den Käfig verlassen.Stellen Sie die Käfige in einen dunklen Inkubator mit stabilen Umgebungsbedingungen von 34 bis 35 Grad Celsius und 50-70% relativer Luftfeuchtigkeit. Um die mit Agrochemikalien versetzte Diät zu verabreichen, bereiten Sie die Stammlösungen von Agrochemikalien in einem geeigneten Lösungsmittel wie Aceton in einer Konzentration vor, die der Diät zugesetzt werden kann, um die gewünschte Endkonzentration der Agrochemikalie von Interesse zu erreichen. Verabreichen Sie die agrochemischen Behandlungen in einer Saccharoselösung, einem kommerziellen Pollenpräparat oder beidem.Bereiten Sie die experimentelle Diät für die Verwendung am selben Tag vor, indem Sie eine geeignete Menge Stammlösung zu gekühlter oder Raumtemperatur, 50% Saccharoselösung, hinzufügen. Mischen Sie gründlich, indem Sie mit mittlerer Geschwindigkeit wirbeln. Für Pollenpräparate fügen Sie eine berechnete Menge agrochemischer Stammlösung zur Saccharoselösung hinzu und wirbeln Sie gründlich, bevor Sie sie zu pulverförmigem Präparat hinzufügen.Geben Sie Futter zu Feeder-Röhrchen hinzu und notieren Sie die Feeder-Gewichte, bevor Sie sie in den QMC legen. Um die Eiablage zu quantifizieren, entfernen Sie zunächst QMCs aus dem Inkubator. Untersuchen Sie die Rückseiten der durchsichtigen ELPs, wenn Eier vorhanden sind, entfernen Sie die Türverkleidung vor der Platte von Interesse.Entfernen Sie das Klebeband von der anderen Seite der ELPs und schieben Sie die Türverkleidung zwischen dem ELP und den Bienen im QMC. Entfernen Sie bei eingeschalteter Türverkleidung das ELP und zählen und notieren Sie die Anzahl der Eier in den ELP-Zellen. Entfernen Sie die Eier, indem Sie auf den Rand des ELP mit der offenzelligen Seite nach unten auf eine harte Oberfläche klopfen.Sobald die Eier herausfallen, ersetzen Sie das leere ELP im QMC. Entfernen und ersetzen Sie vorsichtig die Türverkleidung hinter dem ELP an der Außenseite des QMC. Wiederholen Sie dies bei Bedarf mit dem zweiten ELP und setzen Sie das Band nach Abschluss des QMC wieder ein.Um den Lebensmittelverbrauch zu überwachen, ersetzen Sie das Essen alle zwei Tage durch eine frisch zubereitete Diät. Bereiten Sie neue Futterröhrchen vor und wiegen Sie sie, bevor Sie mit der Überwachung der Eierproduktion beginnen. Tauschen Sie alte Rohre gegen neue aus und wiegen Sie alte Rohre, bevor Sie sie entsorgen.Vergleichen Sie das Endgewicht der Feeder-Sonde und der nicht verbrauchten Diät mit dem Gewicht derselben Tube, um den Futterverbrauch zu schätzen. Überprüfen Sie einmal täglich, ob die Feeder niemals leer sind. Wenn eine Feeder-Tube leer oder fast leer ist, entfernen Sie sie, füllen Sie sie auf, notieren Sie das Gewicht der Tube vorher und nachher und addieren Sie die Differenz zum zweitägigen Diätverbrauch für den QMC.Entfernen Sie an einem ausgewählten Punkt während eines QMC-Experiments die ELPs, die frisch gelegte Eier enthalten, wie zuvor beschrieben aus dem QMC, aber entfernen Sie die Eier nicht aus dem ELP. Bedecken Sie das ELP zuerst mit einer PCR-Plattendichtung und dann einem universellen Mikroplattendeckel und legen Sie es mit einer gesättigten Kaliumsulfatlösung in einen Exsikkator. Bewerten Sie die Schlüpfraten etwa 78 Stunden nach dem Entfernen von ELPs aus dem QMC.Eine C-förmige Larve im Boden der Zelle weist auf ein erfolgreiches Schlüpfereignis hin. Wenn die QMCs mit überschüssigen Arbeitskräften bevölkert waren, nehmen Sie die Arbeiterbienen zu einem ausgewählten Zeitpunkt während des Experiments ab, um die behandlungsinduzierten Veränderungen in ihrer Physiologie zu beurteilen. Platzieren Sie vor der Probenahme eine Türverkleidung zwischen einem ELP und dem Inneren des QMC und entfernen Sie das ELP.Heben Sie die Türverkleidung vorsichtig etwa 0,5 Zentimeter von der Basis des Käfigs an und entfernen Sie eine Arbeitsbiene mit einer federleichten Pinzette aus dem Inneren des QMC. Für die Genexpressionsanalyse frieren Sie die Bienen in flüssigem Stickstoff ein und lagern sie bei 80 Grad Celsius. Bewahren Sie die gesammelte Biene für die Folgeanalyse auf und wiederholen Sie diesen Vorgang, bis die gewünschte Anzahl von Proben gesammelt wurde.Diätbedingte Imidacloprid-Behandlungsänderungen der täglichen Eizellenzahl wurden durch implementierung einer linearen verallgemeinerten Poisson-Log-Schätzgleichung mit einer autoregressiven Korrelationsmatrix bewertet. Die tägliche Eierproduktion war in QMCs signifikant niedriger, wenn Pollenergänzung und Saccharose mit 50 Teilen pro Milliarde Imidacloprid verabreicht wurden. Es wurde ein dosisabhängiger Effekt auf die Gesamtzahl der eier beobachtet, die in jedem QMC für Imidacloprid-Behandlungen produziert wurden, die sowohl in Saccharose als auch in Pollenpräparat verabreicht wurden.Mit der größten beobachteten Reduktion der QMCs wurden 50 Teile pro Milliarde Imidacloprid gespeist, gefolgt von 10 Teilen pro Milliarde Pollenzusatz plus Saccharose. Es wurde kein Unterschied in den insgesamt produzierten Eiern zwischen Kontroll- und QMCs beobachtet, die allein mit 10 Teilen pro Milliarde Imidacloprid und Pollenzusatz gefüttert wurden. Pollenergänzung, Wasser- und Saccharoseverbrauch wurden alle 48 Stunden für 10 oder 12 Tage aufgezeichnet.Die täglichen Raten des Saccharosekonsums stiegen im Laufe des Experiments signifikant an, aber die Raten des Pollenergänzungskonsums sanken. Höhere Raten des Pollenkonsums wurden beobachtet, wenn 10 Teile pro Milliarde Imidacloprid allein in Pollenergänzung verabreicht wurden. Und die Rate sank, wenn 10 oder 50 Teile pro Milliarde in Pollenergänzung und Saccharoselösung zusammen verabreicht wurden.Die Verwendung von Eintagsbienen ist entscheidend, um die Akzeptanz der Königin zu gewährleisten und die Reaktivierung von Arbeiterinnen zu reduzieren. Ebenfalls entscheidend ist der sorgsame Umgang mit der Königin und die Käfige in einer stabilen Umgebung zu halten.

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JoVE Journal

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