Bewertung des agrochemischen Risikos für gepaarte Honigbienenköniginnen

Dieses Protokoll wurde entwickelt, um das Verständnis dafür zu verbessern, wie Agrochemikalien die Reproduktion von Honigbienen (Apis mellifera) beeinflussen, indem Methoden etabliert werden, um Honigbienenköniginnen und ihre Arbeiterpfleger in einer kontrollierten Laborumgebung Agrochemikalien auszusetzen und ihre relevanten Reaktionen sorgfältig zu überwachen.

Agrochemische Exposition kann große Auswirkungen auf alle Mitglieder einer Honigbienenkolonie haben, einschließlich des wichtigsten Mitglieds, Königinnen. Aber bis vor kurzem waren nur wenige Werkzeuge verfügbar, um diese Effekte zu untersuchen. Diese Technik ermöglicht es Forschern, Königinnen unter kontrollierten Bedingungen Agrochemikalien auszusetzen, die Bedingungen simulieren, die sie im Feld erleben könnten.

Es ist ziemlich einfach, das Eiablageverhalten der Honigbienenkönigin zu stören, daher ist es wichtig, beim Umgang mit Arbeiterinnen und Königinnen vor und während des Experiments vorsichtig zu sein. Amy Floyd und Eliza Litsey, Labortechniker an der Invasive Species and Pollinator Health Research Unit, Honeybee Research Lab, werden diese Verfahren demonstrieren. Bauen Sie zunächst Königinnenüberwachungskäfige oder QMCs zusammen, indem Sie die Türverkleidungen einsetzen, und führen Sie dann den Königinnenausschluss in die Tür der Futterkammer über der Fütterungskammer ein, um zu verhindern, dass die Königin die behandelte Diät betritt und kontaktiert.

Fügen Sie eine einzelne ELP ein. Fügen Sie erst dann Zuführröhrchen hinzu, nachdem die Arbeiter in den Käfig gegeben wurden, und bedecken Sie die vier Zuführlöcher vorübergehend mit Klebeband in Laborqualität. Nachdem Sie die Wachswabenrahmen mit der gekappten Arbeiterbrut aus Honigbienenvölkern gesammelt und inkubiert haben, bürsten Sie die geschlossenen Bienen in einen offenen Behälter ab, der mit einer Insektenbarrierefarbe ausgekleidet ist, um zu verhindern, dass die Bienen herauskriechen.

Fügen Sie mindestens 50 Bienen nach Gewicht in die Eiablagekammer jedes QMC. Um sicherzustellen, dass ein vielfältiger genetischer Pool eingeführt wird, erhalten Sie eine ähnliche Anzahl von Arbeitsbienen aus mindestens drei Kolonien und lassen Sie sie mischen, bevor Sie Bienen zu den QMCs hinzufügen.

Verwenden Sie Königinnen, die von einem kommerziellen Züchter gekauft wurden, innerhalb von 48 Stunden nach Erhalt. Während sich die Königin noch im Versandkäfig befindet, legen Sie sie in eine durchsichtige Plastiktüte. Legen Sie dann ein Ende eines Kunststoffrohrs, das mit einem Kohlendioxidgaskanister verbunden ist, in den Beutel und öffnen Sie vorsichtig das Kanisterventil, damit das Kohlendioxidgas fließen kann.

Wenn der Beutel mit Gas aufgeblasen wurde, schließen Sie gleichzeitig das Kanisterventil und halten Sie den Beutel geschlossen, um das Gas im Inneren einzufangen. Halten Sie den Beutel 30 Sekunden lang geschlossen oder bis sich die Königin nicht mehr bewegt. Entfernen Sie die Königin, indem Sie den Versandkäfig öffnen, sobald beobachtet wird, dass die Königin bewusstlos ist.

Öffnen Sie teilweise die Tür zur Eierlegekammer, legen Sie die bewusstlose Königin vorsichtig hinein und schließen Sie den Deckel. Fügen Sie jedem QMC den zweiten ELP hinzu. Legen Sie ein Stück Laborband über die Oberseite der beiden ELPs, um zu verhindern, dass sie sich vom QMC-Rahmen trennen, und verhindern, dass Arbeiter den Käfig verlassen.

Stellen Sie die Käfige in einen dunklen Inkubator mit stabilen Umgebungsbedingungen von 34 bis 35 Grad Celsius und 50-70% relativer Luftfeuchtigkeit. Um die mit Agrochemikalien versetzte Diät zu verabreichen, bereiten Sie die Stammlösungen von Agrochemikalien in einem geeigneten Lösungsmittel wie Aceton in einer Konzentration vor, die der Diät zugesetzt werden kann, um die gewünschte Endkonzentration der Agrochemikalie von Interesse zu erreichen. Verabreichen Sie die agrochemischen Behandlungen in einer Saccharoselösung, einem kommerziellen Pollenpräparat oder beidem.

Bereiten Sie die experimentelle Diät für die Verwendung am selben Tag vor, indem Sie eine geeignete Menge Stammlösung zu gekühlter oder Raumtemperatur, 50% Saccharoselösung, hinzufügen. Mischen Sie gründlich, indem Sie mit mittlerer Geschwindigkeit wirbeln. Für Pollenpräparate fügen Sie eine berechnete Menge agrochemischer Stammlösung zur Saccharoselösung hinzu und wirbeln Sie gründlich, bevor Sie sie zu pulverförmigem Präparat hinzufügen.

Geben Sie Futter zu Feeder-Röhrchen hinzu und notieren Sie die Feeder-Gewichte, bevor Sie sie in den QMC legen. Um die Eiablage zu quantifizieren, entfernen Sie zunächst QMCs aus dem Inkubator. Untersuchen Sie die Rückseiten der durchsichtigen ELPs, wenn Eier vorhanden sind, entfernen Sie die Türverkleidung vor der Platte von Interesse.

Entfernen Sie das Klebeband von der anderen Seite der ELPs und schieben Sie die Türverkleidung zwischen dem ELP und den Bienen im QMC. Entfernen Sie bei eingeschalteter Türverkleidung das ELP und zählen und notieren Sie die Anzahl der Eier in den ELP-Zellen. Entfernen Sie die Eier, indem Sie auf den Rand des ELP mit der offenzelligen Seite nach unten auf eine harte Oberfläche klopfen.

Sobald die Eier herausfallen, ersetzen Sie das leere ELP im QMC. Entfernen und ersetzen Sie vorsichtig die Türverkleidung hinter dem ELP an der Außenseite des QMC. Wiederholen Sie dies bei Bedarf mit dem zweiten ELP und setzen Sie das Band nach Abschluss des QMC wieder ein.

Um den Lebensmittelverbrauch zu überwachen, ersetzen Sie das Essen alle zwei Tage durch eine frisch zubereitete Diät. Bereiten Sie neue Futterröhrchen vor und wiegen Sie sie, bevor Sie mit der Überwachung der Eierproduktion beginnen. Tauschen Sie alte Rohre gegen neue aus und wiegen Sie alte Rohre, bevor Sie sie entsorgen.

Vergleichen Sie das Endgewicht der Feeder-Sonde und der nicht verbrauchten Diät mit dem Gewicht derselben Tube, um den Futterverbrauch zu schätzen. Überprüfen Sie einmal täglich, ob die Feeder niemals leer sind. Wenn eine Feeder-Tube leer oder fast leer ist, entfernen Sie sie, füllen Sie sie auf, notieren Sie das Gewicht der Tube vorher und nachher und addieren Sie die Differenz zum zweitägigen Diätverbrauch für den QMC.

Entfernen Sie an einem ausgewählten Punkt während eines QMC-Experiments die ELPs, die frisch gelegte Eier enthalten, wie zuvor beschrieben aus dem QMC, aber entfernen Sie die Eier nicht aus dem ELP. Bedecken Sie das ELP zuerst mit einer PCR-Plattendichtung und dann einem universellen Mikroplattendeckel und legen Sie es mit einer gesättigten Kaliumsulfatlösung in einen Exsikkator. Bewerten Sie die Schlüpfraten etwa 78 Stunden nach dem Entfernen von ELPs aus dem QMC.

Eine C-förmige Larve im Boden der Zelle weist auf ein erfolgreiches Schlüpfereignis hin. Wenn die QMCs mit überschüssigen Arbeitskräften bevölkert waren, nehmen Sie die Arbeiterbienen zu einem ausgewählten Zeitpunkt während des Experiments ab, um die behandlungsinduzierten Veränderungen in ihrer Physiologie zu beurteilen. Platzieren Sie vor der Probenahme eine Türverkleidung zwischen einem ELP und dem Inneren des QMC und entfernen Sie das ELP.

Heben Sie die Türverkleidung vorsichtig etwa 0,5 Zentimeter von der Basis des Käfigs an und entfernen Sie eine Arbeitsbiene mit einer federleichten Pinzette aus dem Inneren des QMC. Für die Genexpressionsanalyse frieren Sie die Bienen in flüssigem Stickstoff ein und lagern sie bei 80 Grad Celsius. Bewahren Sie die gesammelte Biene für die Folgeanalyse auf und wiederholen Sie diesen Vorgang, bis die gewünschte Anzahl von Proben gesammelt wurde.

Diätbedingte Imidacloprid-Behandlungsänderungen der täglichen Eizellenzahl wurden durch implementierung einer linearen verallgemeinerten Poisson-Log-Schätzgleichung mit einer autoregressiven Korrelationsmatrix bewertet. Die tägliche Eierproduktion war in QMCs signifikant niedriger, wenn Pollenergänzung und Saccharose mit 50 Teilen pro Milliarde Imidacloprid verabreicht wurden. Es wurde ein dosisabhängiger Effekt auf die Gesamtzahl der eier beobachtet, die in jedem QMC für Imidacloprid-Behandlungen produziert wurden, die sowohl in Saccharose als auch in Pollenpräparat verabreicht wurden.

Mit der größten beobachteten Reduktion der QMCs wurden 50 Teile pro Milliarde Imidacloprid gespeist, gefolgt von 10 Teilen pro Milliarde Pollenzusatz plus Saccharose. Es wurde kein Unterschied in den insgesamt produzierten Eiern zwischen Kontroll- und QMCs beobachtet, die allein mit 10 Teilen pro Milliarde Imidacloprid und Pollenzusatz gefüttert wurden. Pollenergänzung, Wasser- und Saccharoseverbrauch wurden alle 48 Stunden für 10 oder 12 Tage aufgezeichnet.

Die täglichen Raten des Saccharosekonsums stiegen im Laufe des Experiments signifikant an, aber die Raten des Pollenergänzungskonsums sanken. Höhere Raten des Pollenkonsums wurden beobachtet, wenn 10 Teile pro Milliarde Imidacloprid allein in Pollenergänzung verabreicht wurden. Und die Rate sank, wenn 10 oder 50 Teile pro Milliarde in Pollenergänzung und Saccharoselösung zusammen verabreicht wurden.

Die Verwendung von Eintagsbienen ist entscheidend, um die Akzeptanz der Königin zu gewährleisten und die Reaktivierung von Arbeiterinnen zu reduzieren. Ebenfalls entscheidend ist der sorgsame Umgang mit der Königin und die Käfige in einer stabilen Umgebung zu halten.