Name: Nachweis von Glykosaminoglykanen durch Polyacrylamid-Gelelektrophorese und Silberfärbung (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-02-25T15:00:00.000+00:00
Duration: 5 min 57 s
Description: Lernen Sie die Polyacrylamid-Gelelektrophorese zur Detektion und Größenbestimmung von Glykosaminoglykanen aus biologischen Proben. Diese empfindliche Methode ermöglicht die Analyse von Heparansulfat und Chondroitinsulfat ohne spezialisierte Glykomik-Ausrüstung.

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Diese Arbeit wurde gefördert durch F31 HL143873-01 (WBL), R01 HL125371 (RJL und EPS)

Alle biologischen Proben, die in diesem Protokoll analysiert wurden, wurden von Mäusen gemäß Protokollen gewonnen, die vom Institutional Animal Care and Use Committee der University of Colorado genehmigt wurden.
1. Heparansulfat-Isolierung
<ol><li>Delipidierung von Gewebeproben HINWEIS: Die Delipidierung ist ein optionaler Schritt für fettreiche Gewebe.<ol>
<li>Stellen Sie eine 1:1-Mischung aus Methanol und Dichlormethan zusammen. Bereiten Sie etwa 500 μL pro Probe vor; größere Gewebestücke können bis zu 1 ml benötigen.</li>
		<li>Legen Sie jede Gewebeprobe in einen kleinen Glasbehälter mit einem Deckel zur Entpissenbildung. HINWEIS: Die Probenmasse kann je nach interessierendem Gewebe und experimentellem Bedarf variieren. 50 mg oder weniger sind in der Regel ausreichend für eine ausreichende GAG-Ausbeute, aber der Endbenutzer kann eine gewisse Optimierung erforderlich machen.</li>
		<li>500 μL der Methanol:Dichlormethan-Lösung in jeden Glasbehälter geben und mischen. Stellen Sie sicher, dass alle festen Gewebeproben vollständig in Lösungsmittel getaumt sind. HINWEIS: Verwenden Sie serologische Pipetten oder konische Kunststoffröhrchen, um die Methanol/Dichlormethan-Lösung zu mischen und zu handhaben. andere Kunststoffe können sich auflösen.</li>
		<li>Legen Sie die Proben auf einen Shaker (in gesichertem Gestell) in einem chemischen Abzug und rühren Sie 1 h lang sanft.</li>
		<li>Die Proben zum Mischen rühren und bei 17.000 x g für 5 min bei 4 °C zentrifugieren.</li>
		<li>Pipetten Sie vorsichtig die organische Lösungsmittelfraktion (Überstand) aus. Dies ist die Lipidfraktion - sie enthält keine GAGs und kann verworfen werden. HINWEIS: Versuchen Sie, das Gewebe nicht zu stören, da kleine Stücke verloren gehen könnten. Es ist vorzuziehen, einen Teil der organischen Schicht im Probenbehälter zu belassen, anstatt den Probenverlust zu riskieren.</li>
		<li>Lassen Sie den Deckel des Glasbehälters offen und lassen Sie ihn über Nacht in der Haube verdampfen. Wechseln Sie das Rohr für den nächsten Schritt, da diese Rohre die weitere Verarbeitung nicht überleben.</li>
		<li>Sobald das Lösungsmittelgemisch vollständig verdampft ist, fahren Sie mit dem mechanischen Zerfall (wenn die Restprobe >50 mg beträgt) oder dem Actinase E-Aufschluss (< 50 mg) fort.</li>
	</ol></li>
	<li>Mechanischer Zerfall von festem Gewebe (optional; bei größeren Gewebeproben) HINWEIS: Die meisten kleineren Stücke festen Gewebes (ca. 50 mg oder weniger) sollten sich während des Verdauungsschritts vollständig auflösen. Größere Proben erfordern jedoch eine mechanische Zersetzung.<ol>
<li>Flash-Freeze-Proben von Interesse, indem Sie sie in ein entsprechend großes Polypropylenrohr legen und das geschlossene Röhrchen in flüssigen Stickstoff legen. Lassen Sie die Probe einfrieren, bis sie vollständig fest ist.</li>
		<li>Mit einem sauberen Mörser und Stößel gefrorene Proben zu einer pulverartigen Konsistenz mahlen.</li>
		<li>Fahren Sie direkt mit der Actinase E-Verdauung fort (Schritt 1.4).</li>
	</ol></li>
	<li>Entsalzung und Konzentration der Probe HINWEIS: Dies ist ein optionaler Schritt und nur für verdünnte flüssige Gewebeproben (z. B. broncho-alveoläre Lavageflüssigkeit (BALF) oder Plasma) erforderlich.<ol>
<li>Pool von flüssigen Proben in geeigneten experimentellen Gruppen (z. B. durch biologische Replikation oder experimentelle Gruppe)</li>
		<li>Das Gesamte Probenvolumen wird in eine 500 μL Zentrifugalfiltersäule mit einer Molekulargewichtsabschaltung (MWCO) von 3.000 Da geben.</li>
		<li>30 min bei 14.000 x g bei Raumtemperatur drehen. Wiederholen Sie dies nach Bedarf, wenn das gewünschte Probenvolumen die Kapazität der Zentrifugalfiltersäule überschreitet.</li>
		<li>Waschen Sie jede Säule 3x mit 400 μL entionisiertem, gefiltertem Wasser. Verwerfen Sie den Durchfluss.</li>
		<li>Filter umkehren und 1 min bei 2.000 x g in frischen, entsprechend beschrifteten Auffangröhrchen drehen. Bei -80 °C einfrieren oder mit dem nächsten Schritt fortfahren.</li>
	</ol></li>
	<li>Actinase E Verdauung HINWEIS: Dieser Schritt ist erforderlich, um Proteinverunreinigungen aus Ihrer Probe zu verdauen und letztendlich zu entfernen.<ol>
<li>Mischen Sie die Proben 1:1 mit rekombinanter Actinase E auf eine gewünschte Konzentration von 10 mg/ml. Fügen Sie ein geeignetes Volumen von 10x Aufschlusspufferkonzentrat hinzu. Gewünschte Endkonzentration: 0,005 M Calciumacetat und 0,01 M Natriumacetat, pH 7,5. Zum Beispiel: 190 μL flüssige Probe, 190 μL 20 mg/ml Actinase E, 20 μL 0,05 M Calciumacetat, 0,1 M Natriumacetat.</li>
		<li>Rühren Sie die Proben sanft zum Mischen, dann verdauen Sie sie für 48-72 h bei 55 ° C (bis zu 7 Tage für das gesamte Gewebe).</li>
		<li>Auf 80 °C für 15-20 min erhitzen, um Actinase E zu inaktivieren.</li>
		<li>Frieren Sie die Probe bei -80 °C ein oder fahren Sie mit Schritt 1.5 fort.</li>
	</ol></li>
	<li>Entsalzung und Konzentration der Probe HINWEIS: Wenn eine geringe Masse des interessierenden GAG in der biologischen Probe erwartet wird oder wenn die Konservierung von verbrauchbaren Reagenzien (d. H. Zentrifugalfiltersäulen) wünschenswert ist, können Proben gepoolt werden, um ein einzelnes Konzentrat pro experimenteller Gruppe zu erzeugen (z. B. durch biologische Replikation oder experimentelle Gruppe).<ol>
<li>Das Gesamte Probenvolumen wird in eine 500 μL Zentrifugalfiltersäule mit einem MWCO von 3.000 Da geben.</li>
		<li>30 min bei 14.000 x g bei Raumtemperatur drehen. Wiederholen Sie dies nach Bedarf, wenn das gewünschte Probenvolumen die Kapazität der Zentrifugalfiltersäule überschreitet.</li>
		<li>Waschen Sie jede Säule 3x mit 400 μL entionisiertem, gefiltertem Wasser. Verwerfen Sie den Durchfluss.</li>
		<li>Filter umkehren und 1 min bei 2.000 x g in frischen, entsprechend beschrifteten Auffangröhrchen (in der Regel mit den Zentrifugalfiltersäulen enthalten) schleudern. Bei -80 °C einfrieren oder mit dem nächsten Schritt fortfahren.</li>
	</ol></li>
	<li>Austrocknung<ol>
<li>Entweder legen Sie die gelösten Proben aus Schritt 1.5.5 über Nacht in einen Rotationsvakuumkonzentrator oder lyophilisieren Sie die Proben wie unten beschrieben.</li>
		<li>Proben entweder über Nacht bei -80 °C oder durch Eintauchen in flüssigen Stickstoff gründlich einfrieren.</li>
		<li>Probendeckel mit einer 18 G Nadel durchstechen und in die Lyophilisatorkammer legen. Fügen Sie Papierhandtücher zum Verpacken nach Bedarf hinzu.</li>
		<li>Lyophilisatorkammer auf Lyophilisator fixieren und über Nacht gefriertrocken (mindestens -40 °C, 0,135 Torr)</li>
	</ol></li>
	<li>Kationenaustauschsäule<ol>
<li>Austrocknete Proben in bis zu 400 μL 8 M Harnstoff, 2% ige CHAPS-Lösung (oder, wenn Proben gepoolt werden, bis zu einem Maximum von (400/n) μL wiederverwenden, wobei n = die Anzahl der Proben im gewünschten Pool ist. Verwenden Sie so wenig wie möglich von der Reinigungslösung.</li>
		<li>Gleichsetzen Sie die Kationenaustauschsäule (IEX) mit 400 μL 8 M Harnstoff, 2% CHAPS-Lösung. 5 min bei 2.000 x g bei Raumtemperatur drehen.</li>
		<li>Laden Sie 400 μL Proben/gepoolte Proben in die IEX-Säule. 5 min bei 2.000 x g drehen.</li>
		<li>3x mit 400 μL 8 M Harnstoff, 2% CHAPS-Lösung waschen. Drehen Sie für 5 Minuten bei 2.000 x g jedes Mal.</li>
		<li>Elute 3x mit 400 μL von 0,2 M NaCl. Spin für 5 min bei jeweils 2.000 x g. Dies ist der Anteil mit niedriger Affinität - dieser kann auf Wunsch für die Qualitätskontrolle beibehalten werden.</li>
		<li>Elute 3x mit 400 μL von 2,7 M (16%) NaCl. Spin für 5 min bei jeweils 2.000 x g. Diese Fraktion enthält die isolierten Glykosaminoglykane von Interesse - behalten Sie alles!</li>
		<li>Um jede eluierte Fraktion zu entsalzen, fügen Sie Methanol bis zu 80 Vol.-% hinzu und inkubieren Sie bei 4 °C über Nacht. Drehen Sie jede Probe für 5 min bei 2.000 x g. Gewinnen Sie den festen Rückstand zurück, da dieser getrocknetes entsalztes Glykosaminoglykan ist. HINWEIS: Alternativ überspringen Sie diesen Schritt und fahren Sie mit Schritt 1.8 fort, um das Eluat ohne Methanol zu entsalzen.</li>
	</ol></li>
	<li>Entsalzung und Konzentration der Probe<ol>
<li>Falls erforderlich, die eluierten Fraktionen (ab 1.7.6) in geeignete experimentelle Gruppen (z. B. durch biologische Replikation oder experimentelle Gruppe) aufteilen.</li>
		<li>Das Gesamte Probenvolumen wird in eine 500 μL Zentrifugalfiltersäule mit einem MWCO von 3.000 Da geben.</li>
		<li>30 min bei 14.000 x g bei Raumtemperatur drehen. Wiederholen Sie dies nach Bedarf, wenn das gewünschte Probenvolumen die Kapazität der Zentrifugalfiltersäule überschreitet.</li>
		<li>Waschen Sie jede Säule 3x mit 400 μL entionisiertem, gefiltertem Wasser. Verwerfen Sie den Durchfluss. Fahren Sie direkt mit Schritt 1.9 fort.</li>
	</ol></li>
	<li>Chondroitin Verdauung HINWEIS: Der Zweck dieses Schritts besteht darin, GAGs zu entfernen, die für den Endbenutzer nicht von Interesse sind. In diesem Fall wird Chondroitinase verwendet, um Chondroitin zu entfernen. In den Geweben, die zur Erzeugung repräsentativer Ergebnisse (broncho-alveoläre Lavageflüssigkeit und ganze Lunge) verwendet werden, hinterlässt die Verdauung von Chondroitinsulfat Heparansulfat als primären Rest-GAG. Endbenutzer müssen möglicherweise zusätzliche Verdauungsschritte hinzufügen, abhängig von ihren experimentellen Zielen.<ol>
<li>Laden Sie 350 μL Aufschlusspuffer (50 mM Ammoniumacetat mit 2 mM Calciumchlorid eingestellt auf pH 7,0) in die Zentrifugalfiltersäule, ohne die Membran zu berühren.</li>
		<li>Fügen Sie 5 μL rekombinante Chondroitinase ABC hinzu.</li>
		<li>Das Probenröhrchen in einen 37 °C Backofen geben und 1 h inkubieren.</li>
		<li>Drehen Sie die Säule um und legen Sie sie in entsprechend beschriftete Auffangröhrchen. Spin für 1 min bei 2000 x g.</li>
		<li>Proben 15-20 min auf 80 °C erhitzen, um Chondroitinase ABC zu inaktivieren.</li>
	</ol></li>
	<li>Entsalzung und Konzentration der Probe<ol>
<li>Falls erforderlich, Chondroitin-Verdaute Proben aus Schritt 1.9.5 in geeigneten experimentellen Gruppen bündeln (z. B. durch biologische Replikation oder experimentelle Gruppe).</li>
		<li>Legen Sie das gesamte Probenvolumen in eine 500 μL Zentrifugalfiltersäule mit einem MWCO von 3.000 Da.</li>
		<li>30 min bei 14.000 x g bei Raumtemperatur drehen. Wiederholen Sie dies nach Bedarf, wenn das gewünschte Probenvolumen die Kapazität der Zentrifugalfiltersäule überschreitet.</li>
		<li>Waschen Sie jede Säule 3x mit 400 μL entionisiertem, gefiltertem Wasser. Verwerfen Sie den Durchfluss.</li>
		<li>Filter umkehren und 1 min bei 2.000 x g in frischen, entsprechend beschrifteten Auffangröhrchen spinnen. Bei -80 °C einfrieren oder mit dem nächsten Schritt fortfahren.</li>
	</ol></li>
	<li>Austrocknung HINWEIS: In diesem Schritt ist eine Austrocknung notwendig, damit Proben in möglichst kleiner Wassermenge und Laufpuffer wieder aufgewendet werden können.<ol>
<li>Entweder legen Sie die Chondroitin-Verdautproben aus Schritt 1.10.5 über Nacht direkt in einen Rotationsvakuumkonzentrator oder lyophilisieren Sie wie folgt:</li>
		<li>Proben entweder über Nacht bei -80 °C oder durch Eintauchen in flüssigen Stickstoff gründlich einfrieren.</li>
		<li>Probendeckel mit einer 18 G Nadel durchstechen und in die Lyophilisatorkammer legen. Fügen Sie Papierhandtücher zum Verpacken nach Bedarf hinzu.</li>
		<li>Lyophilisatorkammer auf Lyophilisator fixieren und über Nacht gefriertrocken (mindestens 40 °C, 0,135 Torr)</li>
	</ol></li>
</ol>2. Polyacrylamid-Gelelektrophorese isolierter und gereinigter Glykosaminoglykane
<ol><li>Bereiten Sie die für die Polyacrylamid-Gelelektrophorese (PAGE) erforderlichen Lösungen im Voraus vor (Tabelle 1). HINWEIS: Wählen Sie den Prozentacrylamid der auflösenden Gellösung in Abhängigkeit von der Größe der Glykosaminoglykane, die voraussichtlich in der Probe sein werden. 15% wird für die Auflösung größerer Fragmente empfohlen (mehr als 30 Disaccharid-Untereinheiten in der Länge); 22% für kleinere Fragmente (<20 Disaccharid-Untereinheiten in der Länge).</li>
	<li>Legen Sie die leere Kassette in den PAGE-Tank. Gießen Sie das auflösende Gel wie folgt: In 15 ml Röhrchen 10 ml auflösende Gellösung, 60 μL 10% Ammoniumpersulfat (muss frisch zubereitet werden) und 10 μL TEMED (TEMED zuletzt hinzufügen) mischen. 2-3x vorsichtig umkehren. Verwenden Sie die Pipette, um die oben genannte 10-ml-Lösung schnell zur Kassette hinzuzufügen. Mit 2 ml entionisiertem, gefiltertem Wasser überlagern und das auflösende Gel 30 min polymerisieren lassen. HINWEIS: Das folgende PAGE-Protokoll wurde für ein vertikales PAGE-System mit 13,3 x 8,7 cm (Breite x Länge) 1,0 mm dicken Gießkassetten mit einem Gesamtvolumen von ca. 12 ml optimiert. Andere Kassettensysteme können verwendet werden, müssen jedoch möglicherweise vom Endbenutzer optimiert werden.</li>
	<li>Nachdem das auflösende Gel vollständig polymerisiert ist, entsorgen Sie das überlagerte Wasser und werfen Sie das Stapelgel wie folgt aus: In einem 15-ml-Röhrchen 3 ml der Stapelgellösung, 90 μL 10% Ammoniumpersulfat (muss frisch zubereitet werden), 3 μL TEMED (TEMED zuletzt hinzufügen).</li>
	<li>2-3x vorsichtig umkehren. Verwenden Sie eine Pipette, um die Stapelgellösung schnell über das erstarrte auflösende Gel hinzuzufügen. Kassette bis zur Krempe füllen. Vollständig im Lieferumfang des Setups enthaltener Kamm einsetzen. Lassen Sie das Stapelgel 30 Minuten polymerisieren.</li>
	<li>Sobald das Gel polymerisiert ist, stellen Sie sicher, dass der Bandstreifen vom Boden der Kassette entfernt wird, und legen Sie die Kassette wieder in die PAGE-Tankbaugruppe.</li>
	<li>Füllen Sie die obere und untere Kammer mit einem oberen bzw. unteren Kammerpuffer.</li>
	<li>Die getrockneten Proben aus Schritt 1.11.4 werden in dem minimal erforderlichen Volumen an entionisiertem, gefiltertem Wasser (höchstens 50% des Volumens der Vertiefungen im PAGE-Gel) gelöst. Mischen Sie 1:1 mit Sample Loading Buffer. Laden Sie die Proben und die HS-Oligosaccharid-"Leitern" (siehe Tabelle 1)in das Gel.</li>
	<li>Führen Sie das Gel 5 Minuten bei 100 V vor. Dann führen Sie das Gel bei 200 V für 20-25 min (für ein 15% Polyacrylamid auflösendes Gel), 40-50 min (für ein 18% Polyacrylamid auflösendes Gel), 90-100 min (für 22% Polyacrylamid auflösendes Gel). HINWEIS: Eine gewisse Optimierung der 200 V Laufzeit kann erforderlich sein. Phenolrot wandert vor Heparin-Oligosacchariden, die 2 Polymeruntereinheiten in der Länge sind (dh Polymerisationsgrad 2 oder dp2); Bromphenolblau wandert vor dp10-dp14. Die besten Ergebnisse werden erzielt, wenn die Spannung so angelegt wird, dass das phenolrote Band fast, aber nicht ganz, zum Boden des Gels wandert. Passen Sie die Laufzeit entsprechend an.</li>
</ol>3. Silberfärbungsprotokoll
<ol><li>Bereiten Sie alle für die Silberfärbung erforderlichen Lösungen im Voraus vor (Tabelle 2). HINWEIS: Berühren Sie das PAGE-Gel erst direkt, wenn es gefärbt, entwickelt und in Stopplösung gelegt wurde. Manipulieren Sie stattdessen das Gel mit sauberen Kunststoff- oder Glaswerkzeugen. Die direkte Handhabung des Gels führt nach dem Färben zu Fingerabdruckverzerrungen und anderen sichtbaren Artefakten auf dem Gel.</li>
	<li>Sobald der Lauf abgeschlossen ist, zerlegen Sie die Kassette und extrahieren Sie das Gel in einem sauberen, mittelgroßen Behälter, der mit entionisiertem, gefiltertem Wasser gefüllt ist. HINWEIS: Um eine direkte Handhabung des Gels zu vermeiden, verwenden Sie die Pipettenspitze oder einen anderen Kunststoffgegenstand, um das Gel vorsichtig von der Kassette abzuziehen, während Sie in Wasser getaunken sind. Gel kann zerbrechlich sein - vorsichtig behandeln.<ol>
<li>Entsorgen Sie das Wasser. Das Gel in Alcian blau färben Sie es für 5 min.</li>
		<li>Entsorgen Sie alcian blauen Fleck. Schnell 2-3x mit entionisiertem, gefiltertem Wasser abspülen/waschen, bis der größte Teil der alcianblauen Färbelösung entfernt wurde.</li>
		<li>In entionisiertem, gefilterten Wasser über Nacht auf der Wippe entfärben lassen. Stellen Sie sicher, dass ausreichend entionisiertes, gefiltertes Wasser vorhanden ist, um sicherzustellen, dass alle Restflecken über Nacht vollständig vom Gel abgewaschen werden.</li>
		<li>Waschgel in 50% Methanol (40 min insgesamt, Lösung 2-3x wechseln).</li>
		<li>Gel in entionisiertem, gefiltertem Wasser für 30 min waschen. Entsorgen Sie Wasser und wiederholen Sie 3 weitere Zeit für insgesamt 2 h, wobei Sie das Wasser jedes Mal ersetzen.</li>
		<li>In einem frischen, sauberen Behälter das Gel 30 min in Silbernitrat-Färbelösung einfärben.</li>
		<li>Schnell 2-3x in entionisiertem, gefiltertem Wasser abspülen/waschen, um die Silberfärbelösung vollständig zu entfernen.</li>
		<li>30 min in entionisiertem, gefiltertem Wasser waschen. Entsorgen Sie Wasser und wiederholen Sie es 2x für insgesamt 90 Minuten, wobei Sie das Wasserbad jedes Mal ersetzen.</li>
		<li>Entsorgen Sie Wasser und fügen Sie die Entwicklungslösung hinzu.</li>
		<li>Sobald die Entwicklungslösung hinzugefügt wurde, beobachten Sie das Gel sorgfältig und achten Sie auf das Auftreten von Bändern. Abhängig von der Qualität des Flecks und der Masse der geladenen Probe kann die Entwicklung von wenigen Sekunden bis zu mehreren Minuten dauern.</li>
		<li>Sobald die gewünschten Bänder sichtbar sind, entsorgen Sie sofort die sich entwickelnde Lösung und waschen Sie sie kurz mit Derstopplösung.</li>
		<li>Entsorgen Sie die Stop-Lösungswäsche und ersetzen Sie sie durch frische Stop-Lösung. 1 h auf einer Wippe oder einem Shaker einweichen lassen.</li>
		<li>Über Nacht in entionisiertem, gefiltertem Wasser waschen (das Gel kann jedoch sofort nach dem Abwaschen der Stopplösung abgebildet werden).</li>
	</ol>
</li>
</ol>

<ol><li>LaRivière, W. B., Schmidt, E. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+pulmonary+endothelial+glycocalyx+in+ARDS%3A+A+critical+role+for+heparan+sulfate%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Topics+in+Membrane%22%5BJournal%5D)">The pulmonary endothelial glycocalyx in ARDS: A critical role for heparan sulfate.</a> Current Topics in Membrane. 82, 33-52 (2018).</li>
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<li>Pepi, L. E., Sanderson, P., Stickney, M., Amster, I. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Developments+in+mass+spectrometry+for+glycosaminoglycan+analysis%3A+A+review%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+and+Cellular+Proteomics%22%5BJournal%5D)">Developments in mass spectrometry for glycosaminoglycan analysis: A review.</a> Molecular and Cellular Proteomics. , 100025(2021).</li>
<li>Whiteman, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+quantitative+measurement+of+Alcian+Blue-glycosaminoglycan+complexes%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemical+Journal%22%5BJournal%5D)">The quantitative measurement of Alcian Blue-glycosaminoglycan complexes.</a> Biochemical Journal. 131 (2), 343-350 (1973).</li>
<li>Yuan, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+mass+dependence+of+hyaluronan+detection+by+sandwich+ELISA-like+assay+and+membrane+blotting+using+biotinylated+hyaluronan+binding+protein%5BTitle%5D)+AND+%22Glycobiology%22%5BJournal%5D)">Molecular mass dependence of hyaluronan detection by sandwich ELISA-like assay and membrane blotting using biotinylated hyaluronan binding protein.</a> Glycobiology. 23 (11), 1270-1280 (2013).</li>
</ol>

Die Autoren erklären, dass sie keine konkurrierenden finanziellen Interessen haben.

GAGs spielen eine zentrale Rolle in vielen verschiedenen biologischen Prozessen. Eine der Hauptfunktionen von sulfatierten GAGs (wie HS und CS) besteht darin, mit Liganden zu interagieren und an sie zu binden, was die nachgeschalteten Signalfunktionen verändern kann. Eine wichtige Determinante der GAG-Bindungsaffinität zu verwandten Liganden ist die Länge der GAG-Polymerkette 8,9,14. Aus diesem Grund ist es wichtig, dass Forsche...

Glykosaminoglykane (GAGs) sind eine vielfältige Familie linearer Polysaccharide, die ein allgegenwärtiges Element in lebenden Organismen sind und zu vielen grundlegenden physiologischen Prozessen beitragen1. GAGs wie Heparansulfat (HS) und Chondroitinsulfat (CS) können an verschiedenen Positionen entlang der Polysaccharidkette sulfatiert werden, wodurch geografische Domänen negativer Ladung entstehen. Diese GAGs, wenn sie an Zelloberflächenproteine gebunden sind, die als Proteoglykane bekannt sind, projizieren in den extrazellulären Raum und binden an verwandte Liganden, was die Regulation sowohl der cis- (Liganden, der an dieselbe Zelle gebunden ist) als auch der trans- (Liganden, die an benachbarte Zellen gebunden sind) Signalprozesse ermöglichen2. Darüber hinaus spielen GAGs auch eine kritische Rolle als Strukturelemente in Geweben wie der glomerulären Basalmembran3,dem vaskulären endothelialen Glycocalyx4 und dem pulmonalen epithelialen Glycocalyx5und in Bindegeweben wie Knorpel6.
Die Länge von GAG-Polysaccharidketten variiert je nach biologischem Kontext erheblich und kann durch ein hochkomplexes enzymatisches Regulationssystem dynamisch verlängert, gespalten und modifiziert werden7. Wichtig ist, dass die Länge der GAG-Polymerketten wesentlich zu ihrer Bindungsaffinität für Liganden und anschließend zu ihrer biologischen Funktion beiträgt8,9. Aus diesem Grund erfordert die Bestimmung der Funktion eines endogenen GAG eine Wertschätzung seiner Größe. Leider gibt es im Gegensatz zu Proteinen und Nukleinsäuren nur sehr wenige leicht verfügbare Techniken zum Nachweis und zur Messung von GAGs, was in der Vergangenheit zu einer relativ begrenzten Untersuchung der biologischen Rollen dieser vielfältigen Polysaccharidfamilie geführt hat.
Dieser Artikel beschreibt, wie GAGs aus den meisten biologischen Geweben isoliert und reinigt werden, und beschreibt auch, wie man Polyacrylamid-Gelelektrophorese (PAGE) verwendet, um die Länge der isolierten Polymere mit einem angemessenen Grad an Spezifität zu bewerten. Im Gegensatz zu anderen, hochkomplexen (und oft massenspektrometrischen) glykomischen Ansätzen kann diese Methode mit Standardlaborgeräten und -techniken eingesetzt werden. Dieser praktische Ansatz könnte daher die Fähigkeit der Forscher erweitern, die biologische Rolle nativer GAGs und ihre Interaktion mit kontextuell wichtigen Liganden zu bestimmen.

<table><tbody><tr><td>Accuspin Micro17 Tisch-Mikrozentrifuge</td><td>thermoFisher Scientific</td><td>13-100-675</td><td>Jede Tisch-Mikrozentrifugen-Rotor-Kombination mit einer Kapazität von 14000 xG ist geeignet</td></tr><tr><td>Acrylamid (fest)</td><td>thermoFisher Scientific</td><td>BP170-100</td><td>Elektrophorese-Qualität</td></tr><tr><td>Actinase E</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P5147</td><td>Proteasemischung aus S. griseus</td></tr><tr><td>Alcian Blue 8GX (fest)</td><td>thermoFisher Scientific</td><td>AC400460100</td><td></td></tr><tr><td>Ammoniumacetat (fest)</td><td>thermoFisher Scientific</td><td>A639-500</td><td></td></tr><tr><td>Ammoniumhydroxid (flüssig)</td> in molekularbiologischer <td>QualitätthermoFisher Scientific</td><td>A669S-500</td><td>zertifiziert ACS</td></tr><tr><td>Ammoniumpersulfat (fest)</td><td>thermoFisher Scientific</td><td>BP179-25</td><td>Elektrophoresequalität</td></tr><tr><td>Barnstead GenPure Pro Wasser Aufbereitungssystem</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>10-451-217PKG</td><td>Jedes Wasserentsalzungs-/Reinigungssystem ist ein akzeptabler Ersatz</td></tr> für <tr><td>Borsäure (fest)</td><td>thermoFisher Scientific</td><td>A73-500</td><td>Molekularbiologisches</td></tr><tr><td>Bromphenolblau (fest)</td><td>thermoFisher Scientific</td><td>B392-5</td><td></td></tr><tr><td>Calciumacetat (fest)</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>18-609-432</td><td></td></tr><tr><td>Calciumchlorid (fest)</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>AC349610250</td><td></td></tr><tr><td>CHAPS-Reinigungsmittel für Molekularbiologie (3-((3-Cholamidopropyl)-dimethylammonio)-1-propansulfonat)</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>28299</td><td></td></tr><tr><td>Chondroitinase ABC</td><td>Sigma Aldrich</td><td>C3667</td><td></td></tr><tr><td>Criterion leere Kassette für PAGE (1,0 mm dick, 12+2 Wells)</td><td>Bio-Rad</td><td>3459901</td><td>Jedes 1,0 mm dicke PAGE-Gießkassettensystem ist ausreichend</td></tr><tr><td>Criterion PAGE Cell-System (Zelle und Netzteil)</td><td>Bio-Rad</td><td>1656019</td><td>jedes vergleichbare vertikale Gel-PAGE-System funktioniert)</td></tr><tr><td>Dichlormethan (flüssig)</td><td>thermoFisher Scientific</td><td>AC610931000</td><td>zertifiziert ACS</td></tr><tr><td>EDTA Dinatriumsalz (fest)</td><td>thermoFisher Scientific</td><td>02-002-786</td><td>Molekular Biologie</td></tr><tr><td>Gletscheressig (flüssig)</td><td>thermoFisher Scientific</td><td>A35-500</td><td>Zertifiziertes ACS</td></tr><tr><td>Glycin (fest)</td><td>thermoFisher</td><td>Scientific G48-500</td><td>Elektrophoresequalität</td></tr><tr><td>Heparanase I/III</td><td>Sigma Aldrich</td><td>H3917</td><td>Aus Flavobacterium heparinum</td></tr><tr><td>Heparin abgeleitetes Dekasaccharid (dp10)</td><td>galen scientific</td><td>HO10</td><td></td></tr><tr><td>Aus Heparin gewonnenes Hexasacchar (dp6)</td><td>Galen scientific</td><td>HO06</td><td></td></tr><tr><td>Aus Heparin abgeleitetes Oligosaccharid (dp20)</td><td>Galen Scientific</td><td>HO20</td><td></td></tr><tr><td>Salzsäure (flüssig)</td><td>thermoFisher</td><td>Scientific A466-250</td><td></td></tr><tr><td>Lyophilisator</td><td>Labconco</td><td>7752020</td><td>Jeder Lyophilisator, der -40 °C und 0,135 Torr erreichen kann, funktioniert; kann auch durch einen Rotationsvakuumkonzentrator ersetzt werden</td></tr><tr><td>Methanol (flüssig)</td><td>thermoFisher Scientific</td><td>A412-500</td><td>Certified ACS</td></tr><tr><td>Molecular Imager Gel Doc XR System</td><td>Bio-Rad</td><td>170-8170</td><td>Jedes vergleichbare Gel-Imaging-System ist ein akzeptabler Ersatz</td></tr><tr><td>N,N'-Methylen-bis-acrylamid (fest)</td><td>thermoFisher Scientific</td><td>BP171-25</td><td>Elektrophorese-Qualität</td></tr><tr><td>Phenolrot (fest)</td><td>thermoFisher Scientific</td><td>P74-10</td><td>Freie Säure</td></tr><tr><td>Q Mini H Ionenaustauschersäule</td><td>Vivapure</td><td>VS-IX01QH24</td><td>Ionenaustauschersäule muss ein Mindestladevolumen von 0,4 ml, einen Arbeits-pH-Wert von 2-12 und eine Selektivität für ionische Gruppen mit einem pKa-Gehalt von 11</td></tr> haben <tr><td>Silbernitrat (fest)</td><td>thermoFisher Scientific</td><td>S181-25</td><td>zertifiziert ACS</td></tr><tr><td>Natriumacetat (fest)</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>S210-500</td><td>Molekularbiologische Qualität</td></tr><tr><td>Natriumchlorid (fest)</td><td>thermoFisher Scientific</td><td>S271-500</td><td>Molekularbiologisches</td></tr><tr><td>Natriumhydroxid (fest)</td><td>thermoFisher</td><td>Scientific S392-212</td><td></td></tr><tr><td>Saccharose (fest)</td><td>thermoFisher</td><td>Scientific BP220-1</td><td>Molekularbiologisches</td></tr><tr><td>Niveau TEMED (N,N,N',N'-Tetramethylendiamin)</td><td>thermoFisher Scientific</td><td>BP150-20</td><td>ThermoFisher</td></tr> <tr><td></td><td></td><td>Scientific BP152-500</td><td></td></tr><tr><td>Ultra-Zentrifugalfilter in Molekularbiologiequalität, 0,5 ml, 3000 Da</td><td>Molekulargewichts-Cutoff Amicon</td><td>UFC500324</td> Je <td>nach Probengröße können Filtereinheiten mit größerem Volumen verwendet werden.</td></tr><tr><td>Harnstoff (fest)</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>29700</td><td></td></tr><tr><td>Vacufuge Plus</td><td>Eppendorf</td><td>22820001</td><td>Jeder rotierende Vakuumkonzentrator funktioniert; kann durch einen Gefriertrockner ersetzt werden</td></tr><tr><td>Vakuumfiltereinheit, Einmalgebrauch, 0,22 μM Poren PES, 500 ml Volumen</td><td>thermoFisher Scientific</td><td>569-0020</td><td>Alternative Volumina und Filtermaterialien akzeptabel</td></tr></tbody></table>

nachweis von glykosaminoglykanen durch polyacrylamid-gelelektrophorese und silberfärbung

Detection of Glycosaminoglycans by Polyacrylamide Gel Electrophoresis and Silver Staining

Sulfatierte Glykosaminoglykane (GAGs) wie Heparansulfat (HS) und Chondroitinsulfat (CS) sind in lebenden Organismen allgegenwärtig und spielen eine entscheidende Rolle in einer Vielzahl grundlegender biologischer Strukturen und Prozesse. Als Polymere existieren GAGs als polydisperse Mischung, die Polysaccharidketten enthält, die von 4000 Da bis weit über 40.000 Da reichen können. Innerhalb dieser Ketten existieren Domänen der Sulfatierung, die ein Muster negativer Ladung verleihen, das die Interaktion mit positiv geladenen Rückständen verwandter Proteinliganden erleichtert. Sulfatierte Domänen von GAGs müssen eine ausreichende Länge haben, um diese elektrostatischen Wechselwirkungen zu ermöglichen. Um die Funktion von GAGs in biologischen Geweben zu verstehen, muss der Prüfer in der Lage sein, die Größe von GAGs zu isolieren, zu reinigen und zu messen. Dieser Bericht beschreibt eine praktische und vielseitige Polyacrylamid-Gel-Elektrophorese-basierte Technik, die genutzt werden kann, um relativ kleine Größenunterschiede zwischen GAGs zu lösen, die aus einer Vielzahl von biologischen Gewebetypen isoliert wurden.

Alcianblau wird verwendet, um sulfatierte GAGs 10zu färben; Dieses Signal wird durch die Verwendung eines nachfolgenden Silberflecks 11verstärkt. Abbildung 1 zeigt eine visuelle Demonstration des Entwicklungsprozesses der Silberfärbung. Wie gezeigt, wird das alcianblaue Signal, das durch Elektrophorese getrennte GAGs darstellt, verstärkt, wenn das entwicklungsende Mittel in das Polyacrylamidgel eindringt. Typischerweise reduziert der Entwicklun...

Dieser Bericht beschreibt Techniken zur Isolierung und Reinigung von sulfatierten Glykosaminoglykanen (GAGs) aus biologischen Proben und einen Polyacrylamid-Gelelektrophorese-Ansatz, um ihre Größe anzunähern. GAGs tragen zur Gewebestruktur bei und beeinflussen Signalprozesse durch elektrostatische Interaktion mit Proteinen. Die GAG-Polymerlänge trägt zu ihrer Bindungsaffinität für verwandte Liganden bei.

Nachweis von Glykosaminoglykanen durch Polyacrylamid-Gelelektrophorese und Silberfärbung

Sulfated glycosaminoglycans (GAGs) such as heparan sulfate (HS) and chondroitin sulfate (CS) are ubiquitous in living organisms and play a critical role ...

Dieses Protokoll beschreibt eine einfache Technik, mit der das Vorhandensein und die Länge von Glykosaminoglykanen, die Moleküle von zunehmend anerkannter Bedeutung für viele biologische Prozesse sind, nachgewiesen und gemessen werden kann. Diese Technik ist leicht an die meisten Life-Science-Labore anpassbar. Vergleichbare glykomische Techniken erfordern oft Ausrüstung und Fachwissen, die nur in glykochemischen Forschungslabors zu finden sind.Diese Technik kann besonders nützlich für Forscher sein, die daran interessiert sind, den Glykokalyx zu untersuchen, eine Polysaccharidschicht, die die Endothel- und Epitheloberflächen des menschlichen Körpers ausknurpt. Beginnen Sie, indem Sie eine leere Kassette in den PAGE-Tank legen. Gießen Sie ein auflösendes Gel, indem Sie 10 Milliliter auflösende Gellösung mit 60 Mikrolitern frisch zubereitetem 10% Ammoniumpersulfat in einem 15-Milliliter-Röhrchen mischen.Dann fügen Sie 10 Mikroliter TEMED hinzu. Kehren Sie das Rohr zwei- bis dreimal vorsichtig um. Schnell 10 Milliliter der aktivierten Polyacrylamid-Gellösung mit einer Pipette in die Kassette geben.Mit zwei Millilitern entionisiertem gefiltertem Wasser überlagern und das auflösende Gel 30 Minuten lang polymerisieren lassen. Nachdem das auflösende Gel vollständig polymerisiert ist, entsorgen Sie das überlagerte Wasser. Gießen Sie das Stapelgel, indem Sie drei Milliliter Stapelgellösung mit 90 Mikrolitern frisch zubereitetem 10% Ammoniumpersulfat in einem 15-Milliliter-Röhrchen mischen.Dann fügen Sie drei Mikroliter TEMED hinzu und kehren Sie das Röhrchen zwei- bis dreimal vorsichtig um. Verwenden Sie eine Pipette, um die Stapelgellösung schnell über das erstarrte auflösende Gel zu geben, bis die Kassette bis zum Rand gefüllt ist. Setzen Sie den mit der leeren Polyacrylamid-Gelkassette gelieferten Kamm vollständig ein und lassen Sie das Stapelgel 30 Minuten lang polymerisieren.Sobald das Gel polymerisiert ist, entfernen Sie den Bandstreifen vom Boden der Kassette und legen Sie die Kassette wieder in die PAGE-Tankbaugruppe. Füllen Sie die obere und untere Kammer mit den jeweiligen Pufferlösungen. Lösen Sie getrocknete Glykosaminoglykanproben in dem minimal erforderlichen Volumen an entionisiertem gefiltertem Wasser auf und mischen Sie sie mit dem Probenladepuffer in einem Verhältnis von eins zu eins.Laden Sie die Proben und die HS-Oligosaccharidleitern in das Gel. Führen Sie das Gel fünf Minuten lang bei 100 Volt vor und führen Sie es dann mit 200 Volt für 20 bis 100 Minuten aus, abhängig vom Acrylamidanteil der auflösenden Gellösung. Sobald der Lauf abgeschlossen ist, zerlegen Sie die Kassette und extrahieren Sie das Gel vorsichtig in einen großen, sauberen Behälter, der mit entionisiertem gefiltertem Wasser gefüllt ist.Dann entsorgen Sie das Wasser und färben Sie das Gel fünf Minuten lang in Alcian Blau färben. Entsorgen Sie den Alcian-Blaufleck und waschen Sie ihn schnell zwei- bis dreimal mit entionisiertem gefiltertem Wasser, bis der größte Teil der Alcian-Blaufärbungslösung entfernt wurde. Das Gel in Silbernitrat-Färbelösung in einem frischen, sauberen Behälter für 30 Minuten einfärben.Anschließend zwei- bis dreimal für jeweils 30 Minuten in entionisiertem gefiltertem Wasser waschen, um die Silberfärbelösung vollständig zu entfernen. Entsorgen Sie das Wasser und fügen Sie die entwicklungspenstige Lösung hinzu. Beobachten Sie das Gel sorgfältig auf das Auftreten von Bändern.Abhängig von der Qualität des Flecks und der Masse der geladenen Probe kann die Entwicklung von wenigen Sekunden bis zu mehreren Minuten dauern. Sobald die gewünschten Bänder sichtbar sind, entsorgen Sie sofort die sich entwickelnde Lösung und waschen Sie das Gel kurz mit STOP-Lösung. Die isolierten und gereinigten Glykosaminoglykane wurden mit alcianblauer und silberner Färbetechnik nach dichteabhängiger Auflösung durch eine Polyacrylamid-Gelelektrophorese visualisiert.Wie in dieser Abbildung zu sehen ist, waren Heparansulfat-Oligosaccharide unterschiedlicher Polymerlängen mit diesem PAGE-basierten Ansatz leicht nachweisbar. Die Nachweisgrenze dieser Methode von nur 0,5 Mikrogramm zeigt, dass die Technik beim Nachweis von aus biologischen Proben isolierten und gereinigten Glykosaminoglykanen sehr empfindlich ist. Von den vier verschiedenen Heparinsulfat-Oligosacchariden, die mit dieser Methode visualisiert wurden, war unfraktioniertes Heparin am wenigsten leicht nachweisbar.Aufgrund der Polydispersität von unfraktioniertem Heparin ist die Dichte jedes einzelnen Bandes aus dieser Probe niedriger als die Banden, die durch eine gleiche Masse gereinigter Heparin-Oligosaccharide erzeugt werden. Die Effizienz der Glykosaminoglykan-Reinigung aus flüssigen biologischen Proben wurde anhand von bronchoalveolären Lavage-Proben von Mäusen bewertet, die ursprünglich relativ geringe Konzentrationen von Glykosaminoglykanen enthielten. Darüber hinaus wurde der Erfolg dieser Technik mit Heparinsulfat demonstriert, das aus dem gesamten Lungenhomogenat isoliert wurde, was eine ausreichende Menge an isoliertem Heparinsulfat ergab, wobei die kleinsten Fragmente etwa 10 Disacchariduntereinheiten in der Masse entsprachen.Es ist sehr wichtig, frisch zubereitete Reagenzien zu verwenden und jedes reagenz, das in diesem Protokoll verwendet wird, zu filtern. Es ist wichtig, Reagenzien von höchster Reinheit und Qualität zu verwenden, um diese Technik erfolgreich durchzuführen.

detection-glycosaminoglycans-polyacrylamide-gel-electrophoresis

Research

Forschung

JoVE Journal

Biology

Biologie

Mit Hilfe spezifischer Glycosidasen um Zucker aus Glykoproteinen, die durch SDS-PAGE gefolgt zu entfernen, ist eine wertvolle Methode, um glycan Modifikationen am Protein-Proben erkannt und ist eine gute Wahl für die erste Glykobiologie Studien. Veränderungen nach Deglykosylierung kann als Verschiebungen in Gel-Mobilität oder durch Färbung mit glycan empfindliche Reagenzien nachgewiesen werden.

Identifizierung und Charakterisierung von Protein-Glykosylierung mit speziellen Endo-und Exoglycosidasen

In diesem Video demonstrieren wir eine Silberfärbemethode von Polyacrylamid-Gelen zur Visualisierung des Gesamtproteins mit fluorogenen Sonden.

Fluoreszierende Silberfärbung: Eine Technik zur Visualisierung des Gesamtproteins in Polyacrylamid-Gelen

In diesem Video demonstrieren wir ein Verfahren zur kombinierten Alcian-Blau- und Silberfärbung von sulfatierten Glykosaminoglykan-Oligosaccharid-Fragmenten. Diese kombinierte Färbetechnik verstärkt die Banden von Glykosaminoglykan-Polymeren unterschiedlicher Länge in Polyacrylamid-Gelen erheblich.

Silberfärbung von sulfatierten Glykosaminoglykanen: Eine Färbemethode zur Visualisierung von sulfatierten Glykosaminoglykanen in Polyacrylamidgelen

Dieses Video zeigt das Trennverfahren von Heparansulfaten, die aus Lungengewebe von Mäusen mittels Polyacrylamid-Gelelektrophorese isoliert wurden.

Polyacrylamid-Gelelektrophorese: Eine analytische Technik zum Nachweis von Heparansulfaten unterschiedlicher Kettenlängen, die aus Lungengewebe von Mäusen isoliert wurden

In diesem Video demonstrieren wir eine zweidimensionale Gelelektrophorese-Methode, die einzelne Proteine aus einer komplexen Proteinmischung trennt, die aus Tumorgeweben des humanen nichtfunktionellen Hypophysenadenoms (NFPA) gewonnen wurde. Die Proteine werden in der ersten Dimension anhand ihrer elektrischen Ladung und in der zweiten Dimension anhand von Molekulargewichten weiter getrennt.

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Hier berichten wir über eine einfache und kostengünstige Silber Färbeprotokoll erfordert nur drei Reagenzien und 7 min von Verarbeitung und eignet sich für schnelle Generierung von qualitativ hochwertigen SSR Daten in der genetischen Analyse.

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Nachweis von Glykosaminoglykanen durch Polyacrylamid-Gelelektrophorese und Silberfärbung

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