Überwachung von Protein-Liganden-Interaktionen in menschlichen Zellen durch quantitative In-Zell-NMR in Echtzeit mit einem Bioreaktor mit hoher Zelldichte
9. März 2021
Dieses Protokoll beschreibt den Aufbau eines NMR-Bioreaktors, um verkapselte menschliche Zellen bis zu 72 h lebensfähig zu halten, gefolgt von einer zeitaufgelösten NMR-Datenerfassung und -analyse in der Zelle. Die Methodik wird angewendet, um intrazelluläre Protein-Ligand-Interaktionen in Echtzeit zu überwachen.
Die In-Cell-NMR-Spektroskopie bietet einen einzigartigen Ansatz, um die Proteinstruktur und -funktion direkt in lebenden Zellen zu untersuchen und biologisch relevante Prozesse wie Protein-Ligand-Interaktionen zu überwachen. Dieser NMR-Bioreaktor kann eine große Anzahl menschlicher Zellen für mehrere Tage im Spektrometer lebensfähig und metabolisch aktiv halten und Echtzeit-NMR-Anwendungen in der Zelle ermöglichen. Diese Methode kann auf jedes lösliche, frei taumelnde intrazelluläre Protein angewendet werden, das Konformations- oder chemische Veränderungen erfährt.
Die Isotopenkennzeichnung erweitert die Anwendbarkeit des Verfahrens weiter. Montieren Sie zunächst die Durchflusseinheit mit einem zweiten NMR-Rohr für die Durchflusseinheit, das später durch das mit Zellen enthaltende ersetzt wird. Informationen zur korrekten Montage finden Sie in der Bedienungsanleitung der Durchflusseinheit.
Stellen Sie das an die Durchflusseinheit angeschlossene Wasserbad auf 37 Grad Celsius ein und legen Sie die Reservoirflasche in das Wasserbad. Schließen Sie den FEP-Schlauch der Reservoirflasche an die Pumpe an. Drehen Sie das Bioreaktorventil zum Bypass und füllen Sie die Pumpe mit Medium vor.
Drehen Sie dann das Bioreaktorventil zum Durchfluss und füllen Sie den Bioreaktor mit dem Medium mit 0,1 Millilitern pro Minute vor. Nehmen Sie einen T75-Kolben mit transfizierten HEK 293 T-Zellen aus dem Kohlendioxid-Inkubator und entfernen Sie das verbrauchte Medium. Fügen Sie zwei Milliliter Trypsin EDTA zu den Zellen hinzu und inkubieren Sie fünf Minuten lang bei Raumtemperatur, um die Zellen zu lösen.
Inaktivieren Sie das Trypsin mit 20 Millilitern vollständigem DMEM und suspendieren Sie die Zellen gründlich durch Pipettieren auf und ab. Anschließend in ein 50-Milliliter-Zentrifugenröhrchen überführen. Zentrifugieren Sie die Zellen bei 800X G für fünf Minuten bei Raumtemperatur und entsorgen Sie den Überstand.
Das Zellpellet in ein 1,5-Milliliter-Mikrozentrifugenröhrchen mit Verschluss geben. Um die Zellen in Agarosefäden einzubetten, schmelzen Sie ein Aliquot erstarrter Agarose bei 85 Grad Celsius in einer Blockheizung und halten Sie es dann in Lösung bei 37 Grad Celsius in der Blockheizung. Füllen Sie mit einer Pasteur-Pipette den Boden des NMR-Rohrs der Durchflusseinheit mit 60 bis 70 Mikrolitern 1,5% Agarose-Gel und legen Sie es auf Eis, um einen fünf Millimeter hohen Bodenstopfen zu erzeugen.
Erhitzen Sie das Zellpellet für 15 bis 20 Sekunden in der Blockheizung und suspendieren Sie die Zellen vorsichtig in 450 Mikrolitern Agaroselösung, um die Bildung von Blasen zu vermeiden. Saugen Sie die Zell-/Agarosesuspension in einen 30 Zentimeter langen Chromatographie-PEEK-Schlauch mit einem Innendurchmesser von 0,75 Millimetern an, der mit einer Ein-Milliliter-Spritze verbunden ist. Lassen Sie den Schlauch zwei Minuten bei Raumtemperatur abkühlen.
Füllen Sie das NMR-Rohr der Durchflusseinheit mit 100 Mikrolitern PBS bei Raumtemperatur vor. Gießen Sie Fäden von Zellen, die in Agarose eingebettet sind, in das NMR-Rohr der Durchflusseinheit, indem Sie die Spritze vorsichtig drücken. Entfernen Sie das leere NMR-Rohr aus der Durchflusseinheit und erhöhen Sie die Durchflussrate für einige Minuten auf zwei Milliliter pro Minute, um Restgasblasen im Einlassschlauch zu entfernen.
Stellen Sie die Durchflussrate auf 0,2 Milliliter pro Minute ein und führen Sie die NMR-Röhre mit den Zellen ein, indem Sie sie langsam, aber stetig nach oben drücken. Versorgen Sie das Bioreaktormedium mit einer Durchflussrate von 0,1 Millilitern pro Minute. Stellen Sie die Temperatur im NMR-Spektrometer auf 310 Kelvin ein und setzen Sie die Durchflusseinheit in das Spektrometer ein.
Sobald der Bioreaktor in das NMR-Spektrometer eingeführt wurde, warten Sie einige Minuten, um den Mediumsaustausch zu ermöglichen. Passen Sie die Anpassung und Abstimmung des Protonenkanals an, unterteilen Sie den Magneten und berechnen Sie die Protonen-90-Grad-Hartpulslänge. Passen Sie die Protonenleistungspegel in jeder Pulsfolge entsprechend dem Protonen-Hartpuls an.
Nehmen Sie ein erstes Zgesgp-Protonen-NMR-Spektrum auf, um den Probengehalt in Feldhomogenität aufzuzeichnen. Kopieren Sie das zgesgp und das p3919gp oder die SOFAST-HMQC-Experimente auf die gewünschte Anzahl und stellen Sie sie in den Erfassungsspooler. Injizieren Sie eine konzentrierte Lösung des externen Moleküls in die mittlere Reservoirflasche, indem Sie den Silikonschlauch mit einer sterilen Langnadelspritze durchstechen.
Ersetzen Sie am Ende des NMR-Experiments das Röhrchen mit den Zellen durch ein leeres Rohr und spülen Sie die Durchflusseinheit mit Wasser ab. Für Zellen, die unmarkierte Carboanhydrase exprimieren, verarbeiten Sie die p3919gp-Spektren durch Anwendung der Nullfüllungs- und exponentiellen Linienverbreiterungsfensterfunktion. Für Zellen, die Stickstoff-15-markierte Superoxiddismutase exprimieren, verarbeiten Sie die SOFAST-HMQC-Spektren durch Anwendung der Nullfüllung und der quadratischen Glockenfensterfunktion in beiden Dimensionen.
Importieren Sie in MATLAB die Spektralbereiche mithilfe des benutzerdefinierten Skripts Load_ascii_spectra. Führen Sie das Skript Load_acqus aus, um die Zeitstempel aus den 1D-Spektren zu extrahieren. Öffnen Sie die grafische Benutzeroberfläche von MCR-ALS 2.0, indem Sie das Skript mcr_main ausführen, und laden Sie auf der Registerkarte Datenauswahl die Spektrenmatrix.
Überprüfen Sie die Daten, indem Sie sie plotten. Bewerten Sie die Anzahl der Komponenten, entweder durch Einzelwertzerlegung oder manuell, und wählen Sie eine Methode zur anfänglichen Schätzung der reinen Spektren aus. Es kann entweder die reinste Variablenerkennung oder die Entwicklung der Faktorenanalyse verwendet werden.
Wählen Sie im Fenster Auswahl des Datasets die Option Weiter aus. Legen Sie die Einschränkungen für die Konzentrationen im Fenster Einschränkungen:Zeilenmodus fest. Wenden Sie eine Nicht-Negativitätseinschränkung an, indem Sie fnnls als Implementierung und zwei als Anzahl der Arten auswählen.
Wenden Sie dann eine Schließungsbedingung an, setzen Sie die Einschränkung auf eins, die Schließungsbedingung auf gleich und gelten Sie für alle Arten. Legen Sie die Einschränkungen für die Spektren im Fenster Integritätsregeln:Spaltenmodus fest. Wenden Sie eine Nicht-Negativitätseinschränkung an, indem Sie fnnls als Implementierung und zwei als Anzahl der Arten auswählen.
Legen Sie im letzten Fenster 50 Iterationen und ein Konvergenzkriterium von 0,01 fest. Geben Sie die Ausgabenamen für Konzentrationen, Spektren und Standardabweichungen an. Klicken Sie auf Weiter, um die MCR-ALS-Anpassung auszuführen.
Die Zellen im Bioreaktor können bis zu 72 Stunden am Leben erhalten werden, wie ein Trypan-Blue-Test bestätigt. Der Bioreaktor wurde zur Echtzeitüberwachung der Bindung von zwei Inhibitoren, Acetazolamid und Methazolamid, an Carboanhydrase verwendet, die im Zytosol von HEK 293 T-Zellen überexprimiert wurde. Das Vorhandensein von Signalen aus dem überexprimierten Protein und die Feldhomogenität wurde mit dem ersten erreizungsformenden Protonenspektrum bewertet.
Im Fall der Carboanhydrase wurde die intrazelluläre Bindung der beiden Inhibitoren überwacht, indem Protonensignale im Bereich zwischen 11 und 16 ppm des WATERGATE-Spektrums beobachtet wurden, die aus den Zink-koordinierenden Histidinen und anderen aromatischen Rückständen resultieren. Die erfolgreiche Bindung wurde durch das Auftreten zusätzlicher Signale bestätigt. MCR-ALS wurde verwendet, um die NMR-Signale, die sich aus der freien und gebundenen Carboanhydrase ergeben, zu trennen und die relativen Konzentrationsprofile der beiden Spezies bereitzustellen.
Der Bioreaktor wurde eingesetzt, um die Bildung einer zinkgebundenen intramolekularen Disulfidbindung der Superoxiddismutase zu überwachen, die durch Ebselen, eine Glutathionperoxidase-Nachahmung, gefördert wird. Die MCR-ALS-Analyse an ausgewählten Regionen des 2D-Spektrums trennte die von den beiden Spezies ausgehenden Signale und lieferte ihre relativen Konzentrationsprofile. Es ist wichtig, das NMR-Rohr der Durchflusseinheit langsam und stetig einzusetzen und zu entfernen, um Drucksprünge zu vermeiden, die zur Bildung von Blasen führen können.
Die Entwicklung von NMR-Bioreaktoren hat den Weg geebnet, um zeitabhängige Prozesse mit atomarer Auflösung zu untersuchen, wie z.B. die Darstellung der Redux-Regulation und der Wechselwirkungen zwischen Medikament und Ziel in lebenden Zellen.
Übersicht
Dieser Artikel beschreibt die Anwendung der In-Zelle-NMR-Spektroskopie in Kombination mit einem spezialisierten NMR-Bioreaktor zur Beobachtung von Protein-Ligand-Wechselwirkungen und chemischen Proteinmodifikationen in lebenden menschlichen Zellen. Der beschriebene Arbeitsablauf ermöglicht die Echtzeit-Beobachtung intrazellulärer Prozesse mit atomarer Auflösung und überwindet damit die traditionellen Einschränkungen hinsichtlich der Zellviabilität innerhalb des NMR-Spektrometers. Das Protokoll umfasst die Probenpräparation, den Aufbau des Bioreaktors, die NMR-Datenaufnahme sowie die quantitative Analyse mittels multivariater Kurvenauflösung (MCR-ALS).
Wesentliche Studienkomponenten
Bereich der Wissenschaft
- Strukturbiologie
- zelluläre Biochemie
- NMR-Spektroskopie
Hintergrund
- Die In-cell-NMR ermöglicht die direkte Beobachtung der Proteinstruktur und -dynamik in lebenden Zellen.
- Die herkömmliche In-cell-NMR ist durch die kurze Lebensfähigkeit der Zellen im Spektrometer begrenzt.
- NMR-Bioreaktoren können die Lebensfähigkeit der Zellen verlängern und dadurch längere Experimente sowie die Echtzeitüberwachung ermöglichen.
- Die quantitative Analyse von NMR-Daten in lebenden Zellen ist aufgrund komplexer Signalüberlappungen und dynamischer Veränderungen herausfordernd.
Zweck der Studie
- Eine detaillierte Anleitung zur Verwendung eines NMR-Bioreaktors, um humane Zellen über längere Zeiträume während von NMR-Experimenten lebensfähig zu halten.
- Die Echtzeitüberwachung von Protein-Ligand-Wechselwirkungen und Proteinmodifikationen in lebenden Zellen demonstrieren.
- Eine Arbeitsabfolge zur quantitativen Analyse von Echtzeit-In-Zelle-NMR-Daten mittels MCR-ALS vorstellen.
Verwendete Methoden
- Herstellung transfizierter HEK-293T-Zellen und Einbettung in Agarosefäden.
- Aufbau und Betrieb eines temperaturgesteuerten NMR-Bioreaktors mit kontinuierlichem Mediumfluss.
- Echtzeit-NMR-Datenaufnahme in Zellen, einschließlich 1D- und 2D-Experimente (z. B. SOFAST-HMQC).
- Quantitative Analyse von NMR-Spektren mittels multivariater Kurvenauflösung mit alternierenden kleinsten Quadraten (MCR-ALS) in MATLAB.
Hauptergebnisse
- Der Bioreaktor gewährleistete eine hohe Zellviabilität und metabolische Aktivität über einen Zeitraum von bis zu 72 Stunden.
- Die Echtzeit-Überwachung der Inhibitorbindung (Acetazolamid, Methazolamid) an Kohlenstoffanhydrase in lebenden Zellen wurde erreicht.
- MCR-ALS ermöglichte die Trennung und Quantifizierung freier und gebundener Proteinspezies über die Zeit.
- Mithilfe des Systems wurde zudem die chemische Modifizierung von Proteinen überwacht, beispielsweise die Bildung von Disulfidbrücken in Superoxiddismutase, induziert durch Ebselen.
Schlussfolgerungen
- Die NMR-Bioreaktor-Anordnung ermöglicht erweiterte, Echtzeit-In-Zell-NMR-Untersuchungen von Protein-Ligand-Interaktionen und -Modifikationen.
- MCR-ALS stellt eine robuste Methode zur quantitativen Analyse komplexer, zeitlich aufgelöster NMR-Daten in lebenden Zellen bereit.
- Dieser Ansatz verbessert die Untersuchung dynamischer biologischer Prozesse und von Wechselwirkungen zwischen Wirkstoffen und Zielstrukturen auf atomarer Ebene in zellulärem Kontext.
Häufig gestellte Fragen
Ausschlaggebende Bedeutung für die Industrie
Die Echtzeit-quantitative In-Zell-NMR unter Verwendung eines Bioreaktors mit hoher Zelldichte ermöglicht eine direkte, atomar auflösende Überwachung von Protein-Ligand-Wechselwirkungen und chemischen Modifikationen in lebenden menschlichen Zellen. Diese Fähigkeit schließt eine entscheidende Lücke im frühen Arzneimitteldesign, indem sie dynamische, quantitative Einblicke in die intrazelluläre Zielstrukturenbindung und mechanistische Prozesse bietet. Die Methode erhöht die Vorhersagesicherheit in den Phasen der Zielvalidierung und der Leitstruktur-Optimierung und unterstützt so risikoadjustierte Portfolioentscheidungen.
Strategische Anwendungen in der Biopharma-Forschung und -Entwicklung
Frühe Entdeckung und Zielvalidierung
- Ermöglicht die direkte Beobachtung der Protein-Ligand-Bindung und konformationellen Veränderungen in einem nativen zellulären Kontext.
- Unterstützt die mechanistische Ent风险bewertung durch Quantifizierung des zeitlich aufgelösten intrazellulären Target-Engagements.
- Liefert kinetische und konzentrationsbezogene Profile zur funktionellen Target-Validierung.
- Erleichtert die Priorisierung von Targets basierend auf dynamischen, quantitativen Messwerten.
Screening und Assay-Entwicklung
- Liefert validierte, reproduzierbare biologische Systeme für nachgeschaltete Screening-Workflows.
- Ermöglicht quantitative, zeitlich aufgelöste Assayausgaben zur Verbindungsevaluation.
- Unterstützt die Assay-Standardisierung und Plattform-Skalierbarkeit durch robusten Bioreaktorbetrieb.
- Verbessert die Screening-Bereitschaft, indem hohe Zellviabilität und metabolische Aktivität aufrechterhalten werden.
Translationale und präklinische Forschung
- Koppelt intrazelluläre Target-Bindungsdaten mit krankheitsrelevanten zellulären Modellen.
- Gewährleistet Kontinuität von der Entdeckung bis zur präklinischen Validierung, indem Proteinmodifikationen und -interaktionen in Echtzeit verfolgt werden.
- Ermöglicht risikoadjustierte Entscheidungen über die Weiterentwicklung basierend auf quantitativen, zellulären Befunden.
- Unterstützt die Entwicklung translationsbezogener Biomarker, indem molekulare Ereignisse mit funktionellen Ergebnissen verknüpft werden.
Pipeline- und Workflow-Integration
Diese Methode integriert sich in den Entdeckungsprozess von der frühen Target-Validierung bis hin zur Leitstruktur-Identifizierung und präklinischen Forschung und bietet eine wiederverwendbare Plattform für die Echtzeit- und quantitative Analyse von Protein-Ligand-Interaktionen in lebenden Zellen.
- Entdeckungsbiochemie: Unterstützt die Hypothesenprüfung und die Aufklärung von Signalwegen durch die Überwachung dynamischer intrazellulärer Prozesse.
- Screening: Bietet reproduzierbare, quantitative Assayausgaben zur Bewertung und Optimierung von Verbindungen.
- Analytik: Ermöglicht Konzentrationsprofile und kinetische Parameter durch multivariate Kurvenauflösung (MCR-ALS-Analyse).
- Translationale Forschung: Verbindet Entdeckungs- und präklinische Phase, indem sie die Echtzeitüberwachung in krankheitsrelevanten humanen Zellmodellen ermöglicht.
- Unternehmensweite Wiederverwendung: Etabliert einen standardisierten, skalierbaren Workflow für die wiederholte Anwendung über verschiedene Zielstrukturen und Programme hinweg.
Operative und unternehmerische Auswirkungen
- Wissenschaftlicher Wert: Erhöht die Vorhersagesicherheit und verringert mechanistische Mehrdeutigkeiten bei der Target-Validierung.
- Operationaler Wert: Verbessert die Standardisierung, Reproduzierbarkeit und Skalierbarkeit von In-Zelle-NMR-Arbeitsabläufen.
- Strategischer Wert: Verbessert Go/No-Go-Entscheidungen und Kapitalnutzungseffizienz durch bereitgestellte quantitative Echtzeitdaten.
- Portfolio-Wirkung: Ermöglicht risikoadjustierte Priorisierung und Weiterentwicklung von Entdeckungsprogrammen.
Durchführungsüberlegungen
- Erfordert Fachkenntnisse in der NMR-Spektroskopie, Zellkultur und quantitativer Datenanalyse.
- Benötigt spezialisierte Instrumentierung, einschließlich eines temperaturgesteuerten NMR-Bioreaktors und eines Systems für kontinuierlichen Mediumfluss.
- Erfordert eine standardisierte Vorgehensweise über Teamgrenzen hinweg bei der Probenvorbereitung, Datenaufnahme und Analyseprotokollen.
- Anwendbar auf verschiedene lösliche, frei rotierende intrazelluläre Proteine, die eine Isotopenmarkierung ermöglichen können.
- Die Zellviabilität und metabolische Aktivität müssen sorgfältig aufrechterhalten werden, um Datenqualität und Reproduzierbarkeit sicherzustellen.
