Gene Knock-in durch CRISPR/Cas9 und Zellsortierung in Makrophagen- und T-Zelllinien

Ziel dieses Protokolls ist es, das CRISPR/Cas9-vermittelte Knock-in-Experiment in Makrophagen- und T-Zelllinien mit Hilfe von fluoreszierenden Reportern zu vereinfachen und die Zellsortierung zu beeinflussen. ROSA26 Locus ist als genomischer Safe-Harbor-Standort für die Insertion von Transgenen bekannt. Es ist üblich, Proteine von Interesse mit oder ohne Angriff in der Mauswelt von 26 Locus oder im menschlichen Ortho-Log auszudrücken.

Teil 1: Design und die Plasmidkonstruktion von sgRNAs für Rosa26 Locus. Entwerfen Sie zuerst sgRNAs aus dem Rosa26-Locus der Maus unter Verwendung von Sequenzen aus der Genominformatik der Maus und dem Ensemble Genome Browser, und laden Sie dann die genomische Sequenz des Rosa26-Gens der Maus herunter. Gehen Sie zum Online-Web-Tool CRISPOR, fügen Sie 100 Basenpaare der Eingabesequenz aus dem Rosa26 Locus ein.

Wählen Sie dann ein Genom aus, zum Beispiel Mus musculus-mouse Referenzgenom 2011. Als nächstes wählen Sie den Typ von PAM. Verwenden Sie 20bp NGG"PAM Motiv, erkannt von spCas9.

Klicken Sie auf Senden. Wählen Sie einen Leitfaden mit einem hohen Spezifitätswert, einem hohen Doing-Score und weniger Off-Zielen. Als ineffizient gekennzeichnete Leitfäden sollten vermieden werden.

Insbesondere wird es bevorzugt, zwei Hilfslinien mit überlappenden Sequenzen auszuwählen, die die Knock-in-Effizienz wie berichtet erhöhen können. Für die warme Dine-Sequenz synthetisieren Sie ein Forward Illegal und ein Reversal Illegal, das phosphorisiert und bereit zum Klonen zum Faktor glüht. Bereiten Sie die linearisierte Abnahme pro Vactor vor, zu der ich durch BBS eine Verdauung melden muss, wie den Neal, die Legals zum linearisierten Vektor zu bekommen, um das endgültige Konstrukt zu erzeugen, das gleichzeitig Die Leit-RNA und den CAS-Neunkern exprimiert, die mit einem DSRIP zwei fluoreszierenden Reportern verbunden sind.

Zweiter Teil: Konstruktion des Zielvektors als homologe Rekombinationsvorlage. Zur Expression des interessierenden Proteins. Zum Beispiel hat der Mensch durchgehalten.

Sie möchten die cDNA-Sequenz nach kommerzieller Quelle synthetisieren und Affinität OST-Tag oder ein anderer häufig verwendeter Angriff zur Reinigung von Protein kann mit der cDNA-Sequenz verschmolzen werden. Denken Sie daran, die kasachische Konsenssequenz vor der Einleitung der cDNA einzubeziehen. Verdaut durch Asc1 Restriktionsenzym, und wie bekommen Sie die CD und den Einsatz in das Rückgrat.

Vactor, nämlich pKhR26-IBFP IBP, das das endgültige Zielkonzentrat des Behälters ergibt, jeweils einen KB von fünf prime und drei prime homologen Armen. Das Ausdrucks-Cast-Set enthält einen CG-Promoter, das UST-Restaurant, wenn Sie eine Koonin-Region mit einer Iris verknüpft haben möchten, wenn VFD-Reporter und ein Poly-AC-Fonds finanziert werden. Schließlich wird auf dem Horizont-Targeting-Vektor mit einzigartigen Cutter-Enzymen wie EcoR1 oder BamH1 das Ferment und das Produkt in einem Lager gereinigt, das minus 20 Grad auf Elektroporationsnoten liegt.

Es wird empfohlen, eine hohe Konzentration linearisierter Vektor-DNA zu erhalten. Teil drei: Elektroporation von Makrophagen und T-Zelllinien bereiten zellkulturiert und trennt sich von Geritalkzellen. Die optimale Zelldichte betrug zum Zeitpunkt der Transfektion etwa 0,5 Millionen Zellen pro ML.

Volle Elektroporation in zehn Makro-Kleinen-Kern-Mode-Tip-Formaten bereitet eine 24-Well-Platte vor, die 500 Mikroliter vollständiges Wachstum enthält, Medium ohne Antibiotika in jeder Vertiefung. Vorwärmen Sie die Platten in befeuchteten 37 Grad vor, wobei 5% diesen Einstellinkubator abdecken. Schalten Sie die Elektrischen Betriebssystem-Eingangselektroporationsparameter für Jet Cat oder Rosales herunter.

Bereiten Sie Zell-DNA-Mischungs-Follow-ups oder Operationen vor, um Hühnerzellen zu sammeln. Curchin 25 Quadratzentimeter Kolbentransferzellen in den 15 Tieren. Da man röhren, dann Phillip die Zellen durch Zentrugation bei 90 mal G für acht Minuten bei Raumtemperatur, fragen Sie danach, die Überstände.

Zum Waschen die Zellen mit den fünf ML PBS erneut umdrehen und dann die Zellsuspension durch Zentrifugation unter Verwendung der gleichen Bedingung wie im vorherigen Schritt drehen. Entfernen Sie die DPPs. Und resuspendieren Sie die Zellkissen mit zwei ML DBS.

Sie bleiben Mikro-Kleine-Zell-Suspension und mischen mit dem gleichen Volumen von 0,2% Trepan Ballou, um die Zellzahl-Load-Probe in Bezug auf die Zählung Slot Insert Connie gleiten in der automatisierten Zelle Connor und sehen Sie das Bild selbst. Erhalten Sie dann ein Zellanzahlergebnis. Berechnen Sie 2 Millionen Zellen werden Den Ruf der Elektroporation pro Klopfexperiment finden, übertragen Sie die Anzahl der Zellen in 1,5 ML.Zentrifuge zwei Pelletzellen durch Zentrifugalisierung.

Um Zeit zu sparen, kann während der Zentrifugalisierung eine Elektroporationsmischung hergestellt werden, die jeweils 2,5 Mikrogramm CRISPR CAS-Neunvektor 2,4 Mikrogramm Belinda-Reis, gesprächigen Vektor und Re-Suspension Buffalo hinzufügt. Unser Gesamtvolumen von 55 Makrostreu in einem neuen 1,5 ML Zentrifugenrohr sanft Vertex und. Kurz stehen, um gut zu mischen.

Lassen Sie die Luxor Druckmischung und Raumtemperatur vor Gebrauch. Nach dem Spinnen von Aspart, der DTB ist diese im Wesentlichen Sicherung für weitere 30 Sekunden, entfernen Sie so viel Überstand wie möglich re suspend Zellen durch Zugabe der vorbereiteten Elektroporationsmischung Pipette nach oben und unten vorsichtig. Elektroporation fragte für den Zellelektroporationsmischer mit 10 Mikro kleine Kernfraktion Spitze war Pipetten wichtig.

Vermeiden Sie Luftblasen während der Pi-Streichelung, es kostet einen Galvanikausfall. Drücken Sie Start. Danach überträgt die Operation die Probe in einer Weile.

Bohrplatz von 24 Bohrplatten mit einer Vorwarnung des Bruttomediums führen den gleichen elektrischen Druck und die gleichen Verfahren wie oben auf den verbleibenden vier replizierten Proben aus, schaukeln sie sanft die Platte, um eine gleichmäßige Verteilung der Zellen zu gewährleisten. Inkubieren Sie die Zellen in einem 37-Grad-Inkubator für 48 bis 72 Stunden. Vor der Tat, Zellsortierung 24 Stunden nach der Transfektion, untersuchen Sie die Expression von Disrupt zwei für Restaurant Reporter mit floreszierender Mikroskopie, die von der Rep für uns selbst getrennt ist, zeigt an, dass die Elektroporation richtig funktioniert.

Teil 4: Zellsortierung zur Isolierung mutmaßlicher Knock-in-Zellen. Bevor die Zellsortierung vorbereitet wird, in 96 Well-Platten mit 150 Mikro-Wenig zelltypspezifischem Bruttomedium pro Bohrung verwenden Sie den falschen unteren Mikroplatz für die Kultur und sich selbst und den flachen unteren Mikroplatz für alle Zellen, um die Röhre auf Eis zu halten und die Box in den Weg durch das Fenster zu legen, Anschluss an den Zellsortierraum, falls zutreffend, Stellen Sie den Zellsortierer mit 85-Mikrometer-Düse und niedriger Durchflussrate für die Immunzellsortierung ein, um eine optimale Zellevaluierbarkeit und -überleben zu erreichen, nehmen Sie Kurz Proben aus dem Pass-Through-Fenster-Scheitelpunkt und laden Sie die Probe in die Aufnahmen. Champer richtete Fact Skating für die Zellsortierung ein, definierte zuerst Verkaufstrichter für Ford-Scatter und Side Scatter, dann definieren Sie die Lebenszellen, indem Sie die Set-Talks roten negativen Zellen gewinnen.

Als nächstes finden sie eine lebende Einzelzelle durch Single Single Single Tating mit dem FSC H versus FSE einem multi-diversen Block. Setzen Sie schließlich ein Gate für die gewünschten DSRs zwei und B, wenn die Volvo-positive Subpopulation, die darauf hinweist, dass Zellen erfolgreich mit CRISPR-Vektor und dem Pocketing-Vektor kotransfiziert wurden. So 10 Einzelzellen in der jeweils Bohrung der 96, Gutplatte ergänzt mit dem Vorwärmen, dem kompletten Wachstumsmedium im Periodenmodus oder Einzelzellmodus nach dem Sortieren inkubieren die 96, Brunnenplatten im Zellkulturinkubator zur Zellexpansion.

Teil fünf: Screening der Erhöhung positiver Knock-in-Zellen Nach etwa zwei Wochen Zellexpansion nach dem Überleben beurteilen die Zellen in der 48-Well-Platte die Expression von BFP oder Durchflusszytometrie unter Verwendung eines kleinen Anteils der Proliferation selbst unter Verwendung der Wandzellen als negative Kontrollzellpopulationen, die einen höheren Prozentsatz an BFP-positiven Zellen besitzen, um die Validierung zu erfüllen extrahieren die genomische DNA aus den Zellen, die wir exprimieren sollten BFP passieren die isolierte genomische DNA durch PCR mit Primern, die jede Seite der homologen Arme überspannen, nämlich eine primäre Lokalisierung in der genomischen Sequenz, außerhalb des Zielvektors. Die gesehene Seite des Gesprächs mit dem Vektor in diesem Experiment, die vorhergesagte Größe des PCR-Produkts, das mit dem Primären verstärkt wird, beträgt 1,2 KV. Und mit F zwei und R zwei sind 1,2 KB Sanger Sequenzierungsergebnisse. So zeigen PCR-Produkte die Sequenzen jedes Integrationsübergangs, die die richtige und klopfende Position in den Rosa 26 Lucas demonstrieren.

Ich sage, wie Immun-Blotting ermöglicht die Validierung des korrekten Klopfens auf Proteinebene Teil sechs repräsentative Ergebnisse. Als Beispiel, das in einer früheren Studie veröffentlicht wurde, haben wir ausgedrückt, dass 45 Moleküle das Inter mit einem OSD-Tag anheften, und es gab einen 26 Locus in Checkout-T-Zellen anschließend USD Takt. Ich bekomme 45 und Incident Directors oder durch Affinitätsreinigung und ein Thema der Massenspektrometrie heruntergezogen.

Ihre Proteomik-Daten zeigten die Interaktion von T-Zellen. Daher hat dieser Produktpool die Suche nach neuartigen Interkalatoren zur Aufklärung der Funktion eines bestimmten Proteins erheblich erleichtert. Diese technische Präsentation zeigte, dass durch transient ausgedrückte erhöhte pro Gusslinie RFP mit dem sprechenden Vektor co-exprimiert und BFP für Rosa 26 Locus.

Wir erzeugten klopfende Zelllinien mit permanenter Genexpression sowohl in T-Zellen als auch in Makrophagen, die bei genetischen Manipulationen schwer durchzuführen sind. Diese Methoden und Empfehlungen sind auf Chris anwendbar, die in Behauptungen eines großen DNA-Segments für mechanistische Studien von Immunzellen zugelassen sind, z. B. zur Identifizierung von Proteinen, Proteininteraktionsstudien.