Name: Isolierung von braunen Adipozyten aus murinem interskapulärem braunem Fettgewebe für die Gen- und Proteinexpressionsanalyse (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-03-12T14:30:00.000+00:00
Duration: 7 min 7 s
Description: Lernen Sie die Isolierung brauner Adipozyten aus murinem braunem Fettgewebe mittels enzymatischer Verdauung und Iodixanol-Dichtegradienten. Diese Methode ermöglicht präzise Gen- und Proteinexpressionsanalysen.

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Z. Lin wurde von den National Institutes of Health HL138454-01 und dem Masonic Medical Research Institute unterstützt.

Alle Mäuse wurden unter pathogenfreien Bedingungen gehalten, und alle Verfahren wurden vom Masonic Medical Research Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) genehmigt. UCP1::Cre9 und Rosa 26tdTomato-Mäuse der Linien13 wurden zuvor berichtet. Alle Mäuse wurden bei Raumtemperatur mit einem 12 h Hell-Dunkel-Zyklus gehalten.
1. Herstellung der Lösungen und des braunen Fettgewebes (BVT)
<ol><li>Aufschlusslösung und Trennlösung in 15 ml Zentrifugenröhrchen vorbereiten.</li>
	<li>10 ml BAT-Aufschlusslösung: Zu 10 ml steriler phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS) werden 3,5 mg/ml Dispase II, 1 mg/ml Kollagenase II und 10 mM CaCl2 hinzugefügt, um eine BAT-Aufschlusslösung herzustellen.</li>
	<li>10 mL 12%ige Iodixanollösung (Trennlösung): Mischen Sie 1 ml 10x PBS, 2 ml 60% Iodixanol, 0,01 ml 1 M MgCl2, 0,025 ml 1 M KCl, 0,1 ml 0,2 M Ethylendiamintetraessigsäure (EDTA) und 6,865 mlddH2O, um12% Iodixanol zu erhalten.</li>
	<li>Euthanasieren Sie eine erwachsene Maus mit CO2 -Überdosis. Füllen Sie den Mauskäfig kurz mit 100% CO2 bei einer Verdrängungsrate von 10-30% Käfigvolumen pro min. 5 min später, bestätigen Sie den Tod, indem Sie auf das Fehlen einer sichtbaren Atmung prüfen.</li>
	<li>Sezieren Sie das Tier und sammeln Sie interskapuläre BAT. Entfernen Sie WAT und Muskelschichten unter einem Stereomikroskop.</li>
	<li>Für eine ausreichende Verdauung schneiden Sie jeden BAT-Lappen in ~ 3 mm3 Teile und legen Sie sie in einen sauberen 50-ml-Kolben mit einem Metallrührstab und 5 ml Aufschlusslösung. Lassen Sie den Kolben mit BAT und Aufschlusspuffer vor Beginn der Verdauung 1 h auf Eis ruhen. HINWEIS: In den folgenden Schritten wurden etwa 80 mg BAT zur Isolierung brauner Adipozyten verwendet.</li>
</ol>2. Isolationsverfahren für BAs
<ol><li>Stellen Sie den Kolben auf einen Magnetrührer, der in einem Inkubator eingeschlossen ist. Stellen Sie die Rührgeschwindigkeit auf 60 U/min bzw. die Temperatur des Inkubators auf 35 °C ein. Die Verdauung dauert ca. 30 min. Wenn die BAT-Scheiben während der Verdauung Klumpen um den Rührstab bilden, verwenden Sie eine 1-ml-Pipettenspitze, um das aggregierte Gewebe zu stören.</li>
	<li>Legen Sie einen 70-μm-Siebfilter auf ein sauberes 50-ml-Zentrifugenröhrchen. Pipettieren Sie etwa 4 ml Zellsuspension durch das Sieb. Waschen Sie das Sieb mit 4 ml 12% iger Jodixanollösung. Pipettieren Sie auf und ab, um die Zellen und die Jodixanollösung zu mischen. Die Zellmischung wird in zwei klare 5 mL Polystyrol-Reagenzgläser überführt. HINWEIS: Am Ende der Verdauung sollte die Verdauungslösung trüb sein, was auf eine ausreichende Verdauung hinweist. Verwenden Sie jedes Mal frische Verdauungslösung. Nach der Zubereitung sollte die Aufschlusslösung innerhalb von 2 h verwendet werden.</li>
	<li>Wiederholen Sie die Schritte 2.2 und 2.3 noch einmal, wenn die Verdauung nicht ausreicht.</li>
	<li>Lassen Sie die klaren Polystyrolröhrchen mit Trennlösung und BAs 1 h auf Eis. Die BAs bilden eine Schicht auf der Oberseite.</li>
	<li>Nehmen Sie 20 μL der isolierten BAs zur mikroskopischen Untersuchung heraus.</li>
</ol>3. RNA- und Proteinisolierung aus BAs
<ol><li>Pipettieren Sie die BAs-Schicht in zwei 1,7-ml-Mikrozentrifugenröhrchen zur RNA- und Proteinisolierung. Entfernen Sie vorsichtig die überschüssige Jodixanollösung, ohne die BAs-Schicht zu stören.</li>
	<li>Fügen Sie 1 ml Trizol hinzu, um gleichzeitig RNA, DNA und Protein in die Zelllösung zu isolieren. Ausreichend mischen, um die Zellen zu lysieren.</li>
	<li>Fügen Sie 200 μL Chloroform hinzu, um die Phasen zu trennen.</li>
	<li>Zentrifugieren Sie das Röhrchen für 9.981 x g für 10 min bei 4 °C.</li>
	<li>Verwenden Sie nach der Zentrifugation die wässrige Phase zur RNA-Isolierung. In dieser Studie wurde die Gesamt-RNA für die reverse Transkription verwendet, und die quantitative RT-PCR wurde mit Real-Time PCR durchgeführt. Primer-Sequenzen sind in der Materialtabelle aufgeführt.</li>
	<li>300 μL der organischen Phase in ein 2 mL Mikrozentrifugenröhrchen überführen.</li>
	<li>Zur organischen Phase 2,5 Volumen 100% Ethanol und Wirbel für 10 s hinzufügen.</li>
	<li>Fügen Sie 200 μL 1-Bromo-3-chlorpropan und Wirbel für 10 s hinzu.</li>
	<li>Fügen Sie 600 μL doppelt destilliertes Wasser und Wirbel für 10 s hinzu.</li>
	<li>Lassen Sie die Mischlösung 10 min bei Raumtemperatur stehen.</li>
	<li>Zentrifugieren bei 9.981 x g für 10 min bei 4 °C. In diesem Schritt werden die Phasen getrennt. Die Proteinphase ist in der mittleren Schicht lokalisiert.</li>
	<li>Entfernen Sie die obere wässrige Lösung. Geben Sie 1 ml 100% Ethanol in die restliche Lösung.</li>
	<li>Zentrifuge für 10 min, 9.981 x g, 4 °C. Nach der Zentrifugation bildet sich das Proteinpellet. Verwerfen Sie den Überstand.</li>
	<li>Waschen Sie das Pellet mit 1 ml 100% Ethanol.</li>
	<li>Zentrifuge für 10 min, 9981 x g, 4 °C. Speichern Sie das Pellet und entsorgen Sie den Überstand.</li>
	<li>Trocknen Sie das Pellet 10 min bei Raumtemperatur an der Luft.</li>
	<li>Messen Sie das Gewicht des nassen Pellets. Fügen Sie 1% ige SDS-Lösung in einem Verhältnis von 20 μL / mg Pellet hinzu.</li>
	<li>Lösen Sie das Pellet auf, indem Sie das Röhrchen in einen erhitzten Shaker geben. Stellen Sie die Temperatur auf 55 °C und die Geschwindigkeit auf 11 x g ein. Es dauert normalerweise 5-10 Minuten, um das Proteinpellet vollständig aufzulösen. HINWEIS: Die Konzentration des gelösten Proteins kann mit dem BCA-Assay14 gemessen werden.</li>
</ol>

<ol><li>Zwick, R. K., Guerrero-Juarez, C. F., Horsley, V., Plikus, M. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Anatomical%2C+physiological%2C+and+functional+diversity+of+adipose+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Metabolism%22%5BJournal%5D)">Anatomical, physiological, and functional diversity of adipose tissue.</a> Cell Metabolism. 27, 68-83 (2018).</li>
<li>Symonds, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Brown+adipose+tissue+growth+and+development%5BTitle%5D)+AND+%22Scientifica%22%5BJournal%5D)">Brown adipose tissue growth and development.</a> Scientifica. 2013, Cairo. 305763(2013).</li>
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<li>Ford, T., Graham, J., Rickwood, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Iodixanol%3A+A+nonionic+iso-osmotic+centrifugation+medium+for+the+formation+of+self-generated+gradients%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Iodixanol: A nonionic iso-osmotic centrifugation medium for the formation of self-generated gradients.</a> Analytical Biochemistry. 220, 360-366 (1994).</li>
<li>Kovacovicova, K., Vinciguerra, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+senescent+cells+by+iodixanol+%28OptiPrep%29+density+gradient-based+separation%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Proliferation%22%5BJournal%5D)">Isolation of senescent cells by iodixanol (OptiPrep) density gradient-based separation.</a> Cell Proliferation. 52, 12674(2019).</li>
<li>Lock, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((versatile+manufacturing+of+recombinant+adeno-associated+viral+vectors+at+scale%5BTitle%5D)+AND+%22Human+Gene+Therapy%22%5BJournal%5D)">versatile manufacturing of recombinant adeno-associated viral vectors at scale.</a> Human Gene Therapy. 21, 1259-1271 (2010).</li>
<li>Marin, R. D., Crespo-Garcia, S., Wilson, A. M., Sapieha, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RELi+protocol%3A+Optimization+for+protein+extraction+from+white%2C+brown%2C+and+beige+adipose+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22MethodsX%22%5BJournal%5D)">RELi protocol: Optimization for protein extraction from white, brown, and beige adipose tissues.</a> MethodsX. 6, 918-928 (2019).</li>
<li>Sonna, L. A., Fujita, J., Gaffin, S. L., Lilly, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Invited+Review%3A+effects+of+heat+and+cold+stress+on+mammalian+gene+expression%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Applied+Physiology%22%5BJournal%5D)">Invited Review: effects of heat and cold stress on mammalian gene expression.</a> Journal of Applied Physiology. 92, 1725-1742 (2002).</li>
<li>Gensch, N., Borchardt, T., Schneider, A., Riethmacher, D., Braun, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Different+autonomous+myogenic+cell+populations+revealed+by+ablation+of+Myf5-expressing+cells+during+mouse+embryogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Different autonomous myogenic cell populations revealed by ablation of Myf5-expressing cells during mouse embryogenesis.</a> Development. 135, 1597-1604 (2008).</li>
</ol>

In dieser Studie wurde eine neue Methode zur Isolierung von BAs für die Gen- und Proteinexpressionsanalyse entwickelt.
In einem veröffentlichten BAs-Isolationsprotokoll wurde eine 3%ige BSA-Lösung zur Anreicherung von BAs12 verwendet. Dennoch konnten die angereicherten BAs, die durch dieses veröffentlichte Protokoll erzielt wurden, nicht direkt für die Proteinexpressionsanalyse verwendet werden. Dies liegt daran, dass das in der BAs-Lösung vorhandene konzentrierte BSA d...

Sowohl Mäuse als auch Menschen haben zwei Arten von Fettgewebe: weißes Fettgewebe (WAT) und braunes Fettgewebe (BAT)1. WAT speichert Energie in Form von Triglyceriden in weißen Adipozyten, und die braunen Adipozyten (BAs) von BAT leiten chemische Energie als Wärme2 ab. Basierend auf ihrem Entwicklungsursprung werden BAs weiter kategorisiert in klassische BAs (cBAs), die während der Embryonalentwicklung entstanden sind, und aus weißen Adipozyten gewonnene BAs (beige/brite Zellen, die unter Stressbedingungen aus weißen Adipozyten umgewandelt werden)3. BAs sind multilokulär und exprimieren das thermogene Proteinentkopplungsprotein 1 (UCP1)4. Das interskapuläre BAT-Depot (iBAT) ist eines der primären cBAs-Depots bei kleinen Säugetieren5, während beige Zellen innerhalb von WAT6 dispergiert sind. 
Aufgrund ihrer Art der Energieableitung haben BAs als therapeutisches Ziel zur Verringerung von Fettleibigkeit viel Aufmerksamkeit erhalten7. Um BAs zur Behandlung von Fettleibigkeit zu nutzen, ist es wichtig, die molekularen Mechanismen zu verstehen, die die Funktion, das Überleben und die Rekrutierung von BAs steuern. Fettgewebe einschließlich BAT und WAT sind heterogen. Abgesehen von Adipozyten enthält Fettgewebe viele andere Zelltypen wie Endothelzellen, mesenchymale Stammzellen und Makrophagen8. Obwohl genetische Werkzeuge zur spezifischen Depletion von Kandidatengenen in Mäuse-BAs verfügbar sind, wie UCP1::Cre Linie9, sind Techniken zur Reinigung von BAs von BAT oder WAT begrenzt, was es schwierig macht, BAs auf Einzelzellebene zu untersuchen. Darüber hinaus wird ohne reine BAs die Beziehung zwischen BAs und Nicht-BAs nicht klar abgegrenzt. Zum Beispiel wurde der von Blutplättchen abgeleitete Wachstumsfaktorrezeptor alpha (PDGFRα) als Marker für undifferenzierte mesenchymale Zellen verwendet und wird in den endothelialen und interstitiellen Zellen von BAT exprimiert. In kalt gestressten BAT entstehen durch PDGFRα-positive Vorläuferzellen neue BAs10. PDGFRα wird durch seinen Liganden PDGF aktiviert, einen Wachstumsfaktor, der das Wachstum und die Proliferation von mesenchymalen Zellen reguliert11; Es ist jedoch unklar, ob BAs das Verhalten von PDGFRα-positiven Vorläuferzellen beeinflussen, indem sie PDGF sezernieren. 
Vor kurzem wurde ein BAs-Isolationsprotokoll veröffentlicht, das auf Fluoreszenz-aktivierter Zellsortierung (FACS)12 basiert. In diesem Protokoll wurde 3% ige Rinderserumalbumin (BSA) -Lösung verwendet, um BAs von Nicht-BAs zu trennen, und die angereicherten BAs wurden durch FACS weiter gereinigt. Die Anwendung dieses Protokolls ist durch die Anforderung des FACS-Prozesses begrenzt, der sowohl auf Geräten als auch auf FACS-Betriebserfahrungen beruht. In dieser Studie wurde ein neues Protokoll zur Isolierung von BAs aus BAT entwickelt. Die durch dieses Protokoll isolierten BAs können direkt für Gen- und Proteinexpressionsstudien verwendet werden. Darüber hinaus deuten Daten aus dieser Studie darauf hin, dass BAs eine wichtige PDGF-Ressource sind.

<table><tbody><tr><td>Antikörper</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Antigen</td><td>Unternehmen<</td><td>strong>Katalog</td><td></td></tr><tr><td>PPAR&gamma;</td><td>LSBio</td><td>Ls-C368478</td><td></td></tr><tr><td>PDGFRa</td><td>Santa Cruz</td><td>sc-398206</td><td></td></tr><tr><td>UCP1</td><td>R& D-System</td><td>IC6158P</td><td></td></tr><tr><td><stark>Chemikalie und Lösungen</stark></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Kollagenase, Typ II</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>17101015</td><td></td></tr><tr><td>1-Brom-3-chlorpropan</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>B62404</td><td></td></tr><tr><td>Rinderserumalbumin (BSA)</td><td>Goldbio</td><td>A-421-10</td><td></td></tr><tr><td>Calciumchlorid</td><td>Bio Basic</td><td>CT1330</td><td></td></tr><tr><td>Chloroform</td><td>IBI Scientific</td><td>IB05040</td><td></td></tr><tr><td>Dispase II, Protease</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D5693</td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Bio Basic</td><td>EB0107</td><td></td></tr><tr><td>Ethanol</td><td>IBI</td><td>Scientific IB15724</td><td></td></tr><tr><td>LiQuant Universal Green qPCR Master Mix</td><td>LifeSct</td><td>LS01131905Y</td><td></td></tr><tr><td>Magnesiumchlorid Hexahydrat</td><td>Boston BioProducts</td><td>P-855</td><td></td></tr><tr><td>OneScrip Plus cDNA Synthese SuperMix</td><td>ABM</td><td>G454</td><td></td></tr><tr><td>OptiPrep (Iodixanol)</td><td>Cosmo Bio USA</td><td>AXS-1114542</td><td></td></tr><tr><td>PBS (10x)</td><td>Caisson Labs</td><td>PBL07</td><td></td></tr><tr><td>PBS (1x)</td><td>Caisson Labs</td><td>PBL06</td><td></td></tr><tr><td>Pierce BCA Protein Assay Kit</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>23227</td><td></td></tr><tr><td>Kaliumchlorid</td><td>Boston BioProducts</td><td>P-1435</td><td></td></tr><tr><td>SimplyBlue sicherer Farbstoff</td><td>Invitrogen</td><td>LC6060</td><td></td></tr><tr><td>Natriumdodecylsulfat (SDS)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>75746</td><td></td></tr><tr><td>Trizol</td><td>Reagenz Lebensdaten Technoologien</td><td>15596018</td><td></td></tr><tr><td>Primers</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Genname (Spezies)&nbsp;</td><td>Vorwärts</td><td>Rückwärts</td><td></td></tr><tr><td>Pdgfra (Maus)</td><td>CTCAGCTGTCTCCTCACAgG</td><td>CAACGCATCTCAGAGAAAAGG</td><td></td></tr><tr><td>Pdgfa (Maus)</td><td>TGTGCCCATTCGCAGGAAGAG</td><td>TTGGCCACCTTGACACTGCG</td><td></td></tr><tr><td>36B4 (Maus)</td><td>TGCTGAACATCTCCCCCCCCTC</td><td>TCTCCACAGACAATGCCAGGAC</td><td></td></tr><tr><td>ucp1</td><td>ACTGCCACACCCAGTCATT</td><td>CTTTGCCTCACTCAGGGG</td><td></td></tr><<tr><td> strong>Equipment</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Name</td><td>Company</td><td>Anwendung</td><td></td></tr><tr><td>Keyence BZ-X700</td><td>Keyence</td><td>Imaging Braune Adipozyten</td><td></td></tr><tr><td>Magnetrührer</td><td>VWR</td><td>Dissoziieren BAT</td><td></td></tr><tr><td>QuantStudio 6 Flex Real-Time PCR System</td><td>angewendet Biosystem</td><td>Quantitative PCR</td><td></td></tr><tr><td>Die Odyssey Fc Imaging System</td><td>LI-COR</td><td>Western Blot Immaging</td><td></td></tr></tbody></table>

isolierung von braunen adipozyten aus murinem interskapulärem braunem fettgewebe für die gen- und proteinexpressionsanalyse

Isolating Brown Adipocytes from Murine Interscapular Brown Adipose Tissue for Gene and Protein Expression Analysis

Braunes Fettgewebe (BAT) ist für die nicht zitternde Thermogenese bei Säugetieren verantwortlich, und braune Adipozyten (BAs) sind die funktionellen Einheiten von BAT. BAs enthalten sowohl multilokuläre Lipidtröpfchen als auch reichlich Mitochondrien und exprimieren das Entkopplungsprotein 1 (UCP1). BAs werden basierend auf ihrer Herkunft in zwei Subtypen eingeteilt: embryonale klassische BAs (cBAs) und weiße Adipozyten abgeleitete BAs. Aufgrund ihrer relativ geringen Dichte können BAs mit herkömmlichen Zentrifugationsmethoden nicht aus BVT isoliert werden. In dieser Studie wurde eine neue Methode entwickelt, um BAs aus Mäusen für die Gen- und Proteinexpressionsanalyse zu isolieren. In diesem Protokoll wurde interskapuläre BAT von erwachsenen Mäusen mit Kollagenase- und Dispase-Lösung verdaut, und die dissoziierten BAs wurden mit 6% iger Jodixanollösung angereichert. Isolierte BAs wurden dann mit Trizol-Reagenz zur gleichzeitigen Isolierung von RNA, DNA und Protein lysiert. Nach der RNA-Isolierung wurde die organische Phase des Lysats für die Proteinextraktion verwendet. Unsere Daten zeigten, dass 6% Jodixanollösung BAs effizient anreicherte, ohne Folgestudien zur Gen- und Proteinexpression zu stören. Platelet-derived growth factor (PDGF) ist ein Wachstumsfaktor, der das Wachstum und die Proliferation von mesenchymalen Zellen reguliert. Im Vergleich zum braunen Fettgewebe hatten isolierte BAs eine signifikant höhere Expression von Pdgfa. Zusammenfassend bietet diese neue Methode eine Plattform, um die Biologie brauner Adipozyten auf Einzelzelltypebene zu untersuchen.

Herstellung von interakapular BAT zur Isolierung brauner Adipozyten Der Isolationsprozess für braune Adipozyten (BAs) ist in Abbildung 1A dargestellt. Der gesamte Prozess, von der Herstellung von BVT und Aufschluss-/Trennlösungen bis zur Gewinnung isolierter BAs, dauert etwa 4 Stunden.
Bei erwachsenen Mäusen gibt es reichlich BAT in der interskapulären Region. Diese interskapuläre BAT (iBAT) wird von Muskelschichten und WAT bedeckt (<strong cla...

Diese Studie beschreibt eine neue Methode zur Isolierung von murinen braunen Adipozyten für die Gen- und Proteinexpressionsanalyse.

Isolierung von braunen Adipozyten aus murinem interskapulärem braunem Fettgewebe für die Gen- und Proteinexpressionsanalyse

Brown adipose tissue (BAT) is responsible for non-shivering thermogenesis in mammals, and brown adipocytes (BAs) are the functional units of BAT. BAs ...

Um die biologischen Aspekte des braunen Fettgewebes zu untersuchen, ist es wichtig, die gereinigte braune Fettgröße zu klären. Derzeit kam keine braune Fettgrößenreinigung und die Massen sind verfügbar. In dieser Studie haben wir ein einfaches Protokoll entwickelt, um dieses Problem anzugehen.Nun sind für dieses Protokoll eine Fähigkeit erforderlich. Es benötigt viel weniger Untersuchungsmaterialien als andere Methoden und die gereinigte braune Fettgröße kann direkt für die Gen- und Proteinexpressionsanalyse verwendet werden. Dieses Protokoll bietet eine neue Methode zur Untersuchung der Biologie der klassischen braunen Fettgröße.Es kann auch angewendet werden, um den Bräunungsprozess der weißen Adipozyten zu untersuchen. Amanda, eine wissenschaftliche Mitarbeiterin aus meinem Labor, demonstriert das Verfahren. Beginnen Sie, indem Sie den Kolben mit BAT und Aufschlusslösung 30 Minuten lang in einen Magnetrührer mit 60 Umdrehungen pro Minute in einem 35-Grad-Inkubator stellen.Verwenden Sie eine Ein-Milliliter-Pipette, um die aggregierten Gewebeklumpen von BAT-Scheiben um den Rührstab herum zu stören. Nach dem Aufschluss einen 70-Mikrometer-Siebfilter auf ein sauberes 50-Milliliter-Zentrifugenröhrchen legen und etwa vier Milliliter Zellsuspension durch das Sieb pipettieren. Dann waschen Sie es mit vier Milliliter 12% Jodixanollösung.Pipettieren Sie nach oben und unten, um die Zellen mit Jodixanollösung zu mischen, und überführen Sie dann die Zellmischung in zwei klare Fünf-Milliliter-Polystyrol-Reagenzgläser. Legen Sie die Polystyrolröhrchen mit der Zellmischung für eine Stunde auf Eis, wodurch die BAs eine Schicht auf der Oberseite bilden. Nehmen Sie 20 Mikroliter der isolierten BAs zur mikroskopischen Untersuchung heraus.Für die RNA- und Proteinisolierung pipetten Sie die BA-Schicht in zwei 1,7-Milliliter-Mikrozentrifugenröhrchen. Entfernen Sie dann vorsichtig die überschüssige iodixonale Lösung, ohne die BA-Schicht zu stören. Dann fügen Sie einen Milliliter TRIzol in die Zelllösung hinzu, um gleichzeitig RNA, DNA und Protein zu isolieren und ausreichend zu mischen, um die Zellen zu lyzieren.Um die Phasen zu trennen, fügen Sie 200 Mikroliter Chloroform hinzu und zentrifugieren Sie das Röhrchen bei 9, 981 G für 10 Minuten bei vier Grad Celsius. Verwenden Sie nach der Zentrifugation die wässrige Phase zur RNA-Isolierung. 300 Mikroliter der organischen Phase in ein Zwei-Milliliter-Mikrozentrifugenröhrchen überführen und 750 Mikroliter 100%iges Ethanol hinzufügen.Nach dem Wirbeln für 10 Sekunden fügen Sie 200 Mikroliter 1-Brom-3-chlorpropan hinzu und wirbeln Sie erneut für 10 Sekunden. Fügen Sie 600 Mikroliter doppelt destilliertes Wasser hinzu, bevor Sie 10 Sekunden lang wirbeln. Lassen Sie die Mischlösung 10 Minuten bei Raumtemperatur stehen.Nach dem Zentrifugieren 9, 981 G für 10 Minuten bei vier Grad Celsius hinzufügen. Die Phasen werden getrennt, wobei die Proteinphase in der mittleren Schicht lokalisiert ist. Entfernen Sie die obere wässrige Lösung und fügen Sie einen Milliliter 100% Ethanol in die restliche Lösung hinzu.Nach dem Zentrifugieren bei 9, 981 G für 10 Minuten bei vier Grad Celsius wird der Überstand verworfen und das Pellet mit einem Milliliter 100%igem Ethanol gewaschen. Zentrifugieren bei 9, 981 g für 10 Minuten bei vier Grad Celsius. Nach dem Entfernen des Überstands das Pellet 10 Minuten bei Raumtemperatur an der Luft trocknen und das Gewicht des nassen Pellets messen.Fügen Sie 1% SDS-Lösung in einem Verhältnis von 20 Mikrolitern pro Milligramm Pellet hinzu. Lösen Sie das Pellet vollständig auf, indem Sie das Röhrchen für fünf bis 10 Minuten in einen erhitzten Shaker bei 55 Grad Celsius und 11 G geben. Im Protokoll wurde PBS mit 3% BSA verwendet, um BAs von BAT zu trennen.Die isolierten Zellen waren himbeerförmig mit multilokulären Lipidtröpfchen im Inneren und waren tdTom-positiv, was bestätigte, dass sie BAs waren. Das Protein wurde mit einem verbesserten GTPC-Protokoll aus den BAs isoliert und anschließend mit einem SDS-PAGE-Gel untersucht. Eine dominante Bande, die mit BSA assoziiert ist, wurde in der BA-Probe beobachtet, was auf ihre Interferenz bei der Proteinextraktion hindeutet.Um BSA-Interferenzen zu vermeiden, wurde eine 6%ige iodixonale Lösung zur Isolierung von BAs verwendet, die eine typische Himbeerform aufwiesen und multilokuläre Lipidtröpfchen enthielten. Die aus diesen BAs extrahierten Proteine wurden im SDS-PAGE-Gel gut getrennt. Diese Zellen erwiesen sich als tdTomato-positiv, während die aus dem Pellet gewonnenen Zellen tdTomato-negativ waren und keine offensichtlichen Lipidtröpfchen enthielten, was auf eine effiziente Trennung der BAs von den fettfreien Zellen hindeutet.In der Genexpressionsanalyse waren die mRNA-Spiegel von UCP1 und PDGFA in den isolierten BAs signifikant höher. Die mRNA von PDGFRA wurde jedoch nur in BAT nachgewiesen. UCP1-Protein wurde in isolierten BAs angereichert.EDGFR alpha wurde in BAT nachgewiesen, aber nicht in isolierten BAs. Diese Ergebnisse bestätigen die Effizienz der Methode zur Isolierung von BAs und zeigen, dass die isolierten BAs für Gen- und Proteinexpressionsstudien geeignet sind. Wenn Sie dieses Protokoll versuchen, verwenden Sie frischen Verdauungspuffer, um braunes Fettgewebe zu dissoziieren und die Bildung von Gewebeklumpen während der Verdauungsphase zu vermeiden.Diese neue Methode macht es einfach, die Biologie von braunem Fettgewebe auf einer Einzelzell-Tap-Ebene zu untersuchen. Durch die Anwendung dieser Methode kann man GN- und Proteinexpressionsstudien mit reinen braunen Adipozyten durchführen, die das Genexpressionsprogramm für braune Adipozyten präzise sezieren, ohne sich Gedanken über eine Kontamination machen zu müssen, die ursprünglich von fettfreien Zellen stammt.

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Research

Forschung

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologie und Infektion

Primäre weißen Präadipozyten aus weißem Fettgewebe von Mäusen isoliert werden in beige / brite Zellen unterschieden werden. Präsentiert hier ist ein zuverlässiger zellulären Modellsystem, um die molekulare Regulation von "Bräunung" der weiße Fett zu studieren.

Isolation und Differenzierung von Stroma-Vascular Cells Beige / Brite Cells

Durch die drastische und negative Zusammenhang zwischen Fettleibigkeit und andere Begleiterkrankungen, Forschung über die Rolle Fettgewebe spielt in Krankheit und die allgemeine Gesundheit gerechtfertigt ist. Wir stellen ein Protokoll für die Isolierung und Entfernung von Fettgewebe Depots ermöglicht die Untersuchung von Fettgewebe unter Verwendung von in situ und in vitro-Verfahren.

Lokalisierung, Identifizierung und Exzision Murine Fettgewebe Depots

Hier beschreiben wir ein Protokoll für effiziente Chromatin Immunopräzipitation (ChIP), gefolgt von Hochdurchsatz-DNA-Sequenzierung (ChIP-Seq) von braunen Fettgewebe (BAT) isoliert von einer Maus. Dieses Protokoll eignet sich für sowohl mapping Histon Änderungen und genomweite Lokalisierung von Histonproteine von Interesse in Vivozu untersuchen.

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Diese Veröffentlichung beschreibt ein Protokoll zur Isolierung von Kernen aus ausgereiften Adipozyten, zur Reinigung durch fluoreszenzaktivierte Sortierung und zur einzelligen Transkriptomik.

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Dieses Protokoll beschreibt den technischen Ansatz zur Isolierung von adipogenen und fibro-inflammatorischen Stromazell-Subpopulationen aus murinen intraabdominalen Depots aus weißem Fettgewebe (WAT) durch fluoreszenzaktivierte Zellsortierung oder immunomagnetische Kügelchentrennung.

Isolierung von adipogenen und fibro-inflammatorischen Stromazell-Subpopulationen aus murinen intraabdominalen Fettdepots

Dieser Bericht beschreibt ein Protokoll zur gleichzeitigen Isolierung von primären braunen und weißen Präadipozyten von neugeborenen Mäusen. Isolierte Zellen können in Kultur gezüchtet und dazu gebracht werden, sich in voll ausgereifte weiße und braune Adipozyten zu differenzieren. Die Methode ermöglicht die genetische, molekulare und funktionelle Charakterisierung primärer Fettzellen in Kultur.

Isolierung und Differenzierung primärer weißer und brauner Präadipozyten von neugeborenen Mäusen

Präadipozyten werden aus der stromalen Gefäßfraktion des interskapularen braunen Fettgewebes von neugeborenen Mäusen isoliert und zu Zellen differenziert, die Lipidtröpfchen akkumulieren, molekulare Marker exprimieren und die mitochondriale Morphologie reifer brauner Adipozyten zeigen. Diese Zellen werden weiter mittels Immunfluoreszenz und Transmissionselektronenmikroskopie analysiert.

Differenzierung und Bildgebung von braunen Adipozyten aus der stromalen vaskulären Fraktion des interscapularen Fettgewebes von neugeborenen Mäusen

Dieses Protokoll beschreibt die halbautomatische Isolierung der stromalen vaskulären Fraktion (SVF) aus murinem Fettgewebe, um Präadipozyten zu erhalten und eine Adipozytendifferenzierung in vitro zu erreichen. Die Verwendung eines Gewebedissoziators für den Kollagenaseverdau reduziert die experimentelle Variation und erhöht die Reproduzierbarkeit.

Halbautomatische Isolierung der stromalen vaskulären Fraktion aus murinem weißem Fettgewebe mit Hilfe eines Gewebedissoziators

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Dissektion, histologische Verarbeitung und Genexpressionsanalyse von murinem supraklavikulärem braunem Fettgewebe

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