Präparation von Lamellen aus glasartigen biologischen Proben mit einem Zweistrahl-Rasterelektronenmikroskop für die Kryo-Elektronentomographie

Dieses Protokoll beschreibt die Präparation von Glaskörperlamellen von Plasmodium-falciparum-infizierten roten Blutkörperchen für die Kryo-Elektronentomographie. Dies ermöglicht die direkte Beobachtung detaillierter struktureller Informationen darüber, wie der Parasit Malaria verursacht. Die Kryo-Elektronentomographie zeichnet hochauflösende Informationen über das Innere von Zellen auf.

Es ist leistungsfähig genug, um einzelne Proteinkomplexe in situ zu beobachten, die computergestützt extrahiert und gemittelt werden können, um dreidimensionale Strukturinformationen über Proteine zu erhalten. Dieses Protokoll kann leicht an verschiedene Zelltypen angepasst werden und kann ein Ausgangspunkt für jemanden sein, der neu in der Herstellung von Glaskörperlamellen für die Kryo-Elektronentomographie ist. Das ist Alejandra Carbajal, die heute das Protokoll ausführen wird.

Untersuchen Sie zunächst die gefrorenen Kupfergitter mit einem CryoStage für ein Lichtmikroskop unter besonderer Berücksichtigung des Eisgradienten über das Gitter. Überprüfen Sie die einzelnen Gitterquadrate auf die Zellbedeckung in den dünneren Eisbereichen. Verwenden Sie einen schwarzen, unauslöschlichen Marker, um die Vorderseite und die gegenüberliegende Seite der Cryo-FIB-SEM-spezifischen Autogrid-Felgen zu markieren.

Laden Sie das geclippte Gitter mit der Carbonseite nach oben in das Cryo-FIB-REM-Shuttle und tragen Sie eine vier Nanometer dicke Carbon- oder Platin-E-Beam-Rotationsschicht auf die Oberfläche der Zellen auf. Laden Sie das Shuttle in das Cryo-FIB-REM und beurteilen Sie die Zellverteilung auf jedem Gitter per REM bei fünf Kilovolt. Verschaffen Sie sich einen Überblick bei niedriger Vergrößerung bei einer Leistung von 100, um Eisgradienten im gesamten Gitter zu betrachten.

Nehmen Sie dann Bilder mit höherer Vergrößerung und einer Leistung von 5.000 auf, um einzelne Gitterquadrate zu betrachten. Tragen Sie eine zwei Mikrometer große Organoplatinschicht auf die Oberfläche jedes Gitters auf, indem Sie die Nadel des Gasinjektionssystems in die Kammer über dem Gitter einführen und die Organoplatinquelle für eine bestimmte Zeit auf eine eingestellte Temperatur erwärmen, um einen Dampfstrom zu erzeugen. Um die Probe zu beobachten, neigen Sie die Probe so, dass die Ebene des Gitters etwa 10 Grad vom Einfallswinkel des Ionenstrahls entfernt ist, und verschieben Sie die Mitte eines geeigneten Gitterquadrats, das sowohl auf den REM- als auch auf den FIB-Bildern zu sehen ist.

Untersuchen Sie das Gitter mit hoher Vergrößerung, um die Zellen in der Mitte eines Gitterquadrats zu visualisieren. Markieren Sie zwei rechteckige Muster zum Fräsen, eines über und eines unter einem drei Mikrometer dicken geschützten Bereich. Wählen Sie dann die Strahleinstellungen und korrigieren Sie die Hornhautverkrümmung, indem Sie Helligkeit und Kontrast anpassen.

Nachdem die Einrichtung abgeschlossen ist, beginnen Sie mit dem Fräsen bei einem Strom von 300 Pikoampere, während Sie den Live-Fortschritt in der Ionenstrahlansicht und intermittierend per REM überwachen. Die Probe wird in der REM-Ansicht und nach dem ersten Fräsen überprüft. Wenn der Ionenstrahl die Probe oberhalb und unterhalb des geschützten Bereichs nicht durchbrochen hat, entfernen Sie mehr Material, indem Sie die Höhe der rechteckigen Muster erhöhen. Beenden Sie das Fräsen, wenn die Oberfläche ober- und unterhalb der Lamelle in der Ionenstrahlansicht vollständig glatt ist.

Wiederholen Sie den Fräsvorgang schrittweise und reduzieren Sie dabei jedes Mal den Ionenstrahlstrom, bis eine Dicke von 300 Nanometern erreicht ist. Notieren Sie die X-Y-Z-Position jeder Lamelle. Um die Lamellen am Ende des Experiments zu polieren, verwenden Sie eine REM-Übersicht mit geringer Vergrößerung, um eine Gruppe von Lamellen auszuwählen, die poliert werden sollen, und markieren Sie die Polierwurzel.

Sobald die Polierwurzel markiert ist, reduzieren Sie den Abstand zwischen den beiden rechteckigen Mustern auf 100 bis 200 Nanometer und beginnen Sie mit dem Polieren bei einem Ionenstrahlstrom von 30 Pikoampere. Überwachen Sie den Fortschritt per REM bei zwei bis drei Kilovolt. Beenden Sie das Polieren, wenn der Kontrast in der Lamelle durch REM verloren geht oder wenn die Organoplatinbeschichtung oder die Lamelle selbst an Integrität verliert.

Erfassen und speichern Sie REM-Bilder mit geringer Vergrößerung von jeder Lamelle. Nehmen Sie nach Abschluss des Experiments das Shuttle aus dem Mikroskop. Entfernen Sie die Gitter mit Lamellen und lagern Sie sie unter flüssigem Stickstoff.

Gehen Sie vorsichtig mit den Gittern um. Um die Morphologie zu untersuchen, wurden die Schizonten in verschiedenen Stadien des Ausstiegs mit Verbindung zwei in E-64-Inhibitoren blockiert. In Gegenwart von Verbindung zwei war die Grenze zwischen den parasitophoren Membranen und dem umgebenden Hämoglobin in den roten Blutkörperchen des Wirts gut definiert.

Die intakten parasitophoren Vakuolen (PVs) waren mit Merozoiten in einem einzigen Cluster von Hämozoinkristallen verpackt. Als zwei synchronisierte Schizonten in E-64 gespült wurden, riss die PV-Membran und die Merozoiten breiteten sich innerhalb des Erythrozyts aus. Ein typisches Beispiel für eine gute Zellverteilung auf einem Kupfergitter zeigt große rote Blutkörperchen mit einer gut definierten Peripherie und einer intakten Vakuolenmembran.

Innerhalb eines teilweise kollabierten roten Blutkörperchens des Wirts wurden die einzelnen Merozoiten als kleine Zellhaufen visualisiert. Jeder Schizont hatte einen schwarzen Fleck in seiner Mitte, der die Position der Hämozoinkristalle anzeigte. Nach dem Fräsen wurden die Gitter in das TEM geladen, um die Positionen der Lamellen zu identifizieren und geeignete Bereiche für die Tomographie zu finden.

Auf dem Probenmikroskop ist eine Erythrozyte zu sehen, die kurz zuvor von einem Merozoiten befallen worden war. Der Merozoite, der von der Membran der Wirtszelle umgeben ist, konnte innerhalb der Grenzen des Erythrozyts gesehen werden. Am apikalen Ende des Merozoiten waren die beiden Membranen, die die Zelle umgeben, und die vier Membranen, die in der Spitze des Merozoiten gestapelt sind, deutlich sichtbar, die mit einem elektronendichten pilzförmigen Merkmal verbunden sind.

Im Zytoplasma des Merozoiten wurde ein Fusionsereignis zwischen der Merozoiten-Plasmamembran und einem mehrschichtigen Vesikel identifiziert. In einer zusätzlichen TEM-Analyse einer 230 Nanometer dicken Lamelle wurde die typische Morphologie eines mit E-64 behandelten reifen Merozoiten beobachtet. Innerhalb der Membran der roten Blutkörperchen ist die Merozoiten-Plasmamembran mit Organellen wie dem inneren Membrankomplex, polaren Ringen, Mikronemen, Rhoptrien und der Kernhülle zu sehen.

Der wichtigste Teil dieser Technik ist die Optimierung der Gitter, um eine reproduzierbare und effiziente Herstellung von dünnen Lamellen zu ermöglichen. Die Weiterentwicklung dieser Technik wird es den Forschern ermöglichen, einzelne Proteinmoleküle in Malariaparasiten sichtbar zu machen und ihre Rolle beim Austritt von Malaria zu bestimmen.