Name: Herstellung und Kryo-FIB-Mikrobearbeitung von Saccharomyces cerevisiae für die Kryo-Elektronentomographie (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-11-20T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 6 s
Description: Lernen Sie die Kryo-FIB-Mikrobearbeitung von Saccharomyces cerevisiae für die Kryo-Elektronentomographie. Dieses Protokoll zeigt die Herstellung dünner Lamellen aus Hefezellen für hochauflösende Strukturanalysen im Zellinneren.

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Die Autoren haben nichts preiszugeben.

Die Vorbereitung der Zellproben für Kryo-ET ist ein komplexer Workflow, der den Einsatz mehrerer High-End-Instrumente erfordert. Die Probenqualität kann bei jedem Vorbereitungsschritt beeinträchtigt werden, der den Durchsatz des gesamten Protokolls beeinflusst. Darüber hinaus stellt die Notwendigkeit des Probentransfers zwischen einzelnen Instrumenten ein zusätzliches Risiko der Probenkontamination oder Devitrifikation dar. Daher ist die Optimierung einzelner Schritte im Probenvorbereitungs-Workflow von hoher Bedeutung, um den Durchsatz und die Reproduzierbarkeit des Lamellenvorbereitungs-Workflows zu erhöhen. Das hier vorgestellte Protokoll beschreibt die optimierte Herstellung von Saccharomyces cerevisiae zur strukturellen Charakterisierung makromolekularer Komplexe in situ mittels Kryo-ET.
Das Protokoll beschreibt die Herstellung von zwei Arten von Hefeproben, die sich hauptsächlich in der Konzentration der Zellen auf dem TEM-Gitter unterscheiden. Beide Hefeproben ergaben hochwertige Lamellen für Kryo-ET und die Auswahl des Probentyps kann entsprechend den Zielen der jeweiligen Studie erfolgen. Die Hefe bildet isolierte Cluster von wenigen Zellen, die im ersten Fall zufällig über die Gitteroberfläche verstreut sind, während für den zweiten Probentyp eine kontinuierliche Monoschicht von Zellen auf der TEM-Gitteroberfläche vorhanden ist. Ersteres eignet sich dank des geringen Volumens des zu fräsenden Materials für die schnelle Lamellenvorbereitung. Die endgültige Lamelle ist ziemlich kurz und enthält daher nur 2-4 zelluläre Querschnitte. Die für die Probenvorbereitung geeigneten Bereiche sind zufällig über die Gitteroberfläche einschließlich der Gitterquadrate verteilt, was die Automatisierung des Lamellenvorbereitungsworkflows teilweise einschränken kann. Letztere Art der Probe erfordert die Verwendung größerer Ströme während der anfänglichen Mahlphase, um die Gesamtmahlzeit beizubehalten. Darüber hinaus ist diese Art von Probe anfälliger für Artefakte, die durch ungleichmäßiges Fräsen (Vorhang) entstehen. Daher wird GIS 50% länger auf die Probenoberfläche gesputtert als bei der Probe mit kleinen Zellclustern, um eine dickere Schutzschicht zu bilden. Als nächstes wird die Probe mit einer zusätzlichen Iridiumschicht (alternativ Platin oder Gold) gesputtert, um die GIS-Schicht auszuhärten, steifer zu machen und die Leitfähigkeit der Probenoberfläche zu erhöhen. FIBM von zusätzlichen Bereichen auf jeder Seite der Lamelle (~ 2-5 μm von der Lamellenkante) während des ersten Schritts des groben Lamellenfräsens wurde als vorteilhaft befunden, um die Anzahl der gebrochenen Lamellen höchstwahrscheinlich aufgrund der verringerten Spannung im endgültigen Querschnitt zu verringern23. Die endgültige Lamelle ist lang und enthält ~ 10 zelluläre Querschnitte, was die Anzahl der für Kryo-ET geeigneten Regionen erhöht. Die unsachgemäße Vitrifikation des Mediums oder Puffers zwischen den Zellen kann leicht durch die Zugabe des Kryoschutzmittels zur Pufferlösung (5% Glycerin, das in dieser Studie verwendet wurde) abgeschwächt werden. Da die meisten Quadrate für die Lamellenvorbereitung geeignet sind, eignet sich die Probe mit Zellen, die in einer kontinuierlichen Monoschicht organisiert sind, gut für die unbeaufsichtigte Lamellenvorbereitung.
Ein weiterer wichtiger Aspekt bei der Lamellenvorbereitung ist die Übertragung auf das Transmissionselektronenmikroskop und die korrekte Positionierung der Lamelle auf die Neigungsachse des Mikroskopetablierungs. Optimalerweise steht die Lamellenhauptachse senkrecht zur Neigungsachse des Mikroskops, was eine Verfolgung und Fokussierung auf Höhe des abgebildeten Bereichs ermöglicht und verhindert, dass die Lamellenkanten das Sichtfeld bei hohen Neigungswinkeln abschirmen. Bei der Erfassung der Kryo-ET-Daten nach dem dosissymmetrischen Schema18 sollte die Probe zunächst im Mikroskop gedreht werden, um die Neigung der Lamelle in Bezug auf die Gitterebene zu kompensieren.

Jüngste Technologie- und Softwareentwicklungen haben die Elektronen-Kryomikroskopie (Kryo-EM) von verglasten biologischen Proben zu einer der Schlüsseltechniken in der strukturbiologischen Forschung in den letzten zehn Jahren gemacht1,2. Die Herstellung einer Probe für Kryo-EM besteht in der Regel aus dem Auftragen eines gereinigten Proteins oder eines Proteinkomplexes mit Nukleinsäure auf den Probenträger (TEM-Gitter), gefolgt von der Entfernung des größten Teils der Flüssigkeit mit einem Filterpapier und dem Einfrieren des Gitters mit der restdünnen Schicht einer Probe in flüssiges Ethan oder Propan3 . Die Probe wird somit in einer dünnen Schicht (typischerweise <80 nm) amorphen Puffers in einem vollständig hydratisierten Zustand, unter nahezu nativen Bedingungen und ohne chemische Fixierung oder Schwermetallkontrast fixiert. Die Abbildung der strukturell homogenen Probe im Transmissionselektronenmikroskop liefert dann Daten, die zur Bestimmung der dreidimensionalen Struktur des Makromoleküls bei nahezu atomarer Auflösung mit einem Einzelpartikelanalyseprotokoll2verwendet werden können. Eine solche in vitro Struktur entspricht der Darstellung des Makromoleküls unter den Bedingungen und der Behandlung, die während der Probenvorbereitung verwendet werden. Obwohl die unter den In-vitro-Bedingungen ermittelten Strukturen in der Regel dem voll funktionsfähigen Zustand des Makromoleküls entsprechen, würde die Fähigkeit, räumliche Beziehungen zwischen verschiedenen Makromolekülen innerhalb der Zelle abbilden, einen zusätzlichen funktionalen Kontext zu den Strukturdaten liefern.
Die Kryo-Elektronentomographie (Kryo-ET) wird verwendet, um 3D-Volumina pleomorpher Objekte oder makromolekularer Komplexe in situ4,5zurekonstruieren. Der Vorteil von Kryo-ET besteht darin, dass die dreidimensionale Information durch Die Abbildung einer einzelnen Entität erhalten wird. Die Auflösung, mit der einzelne makromolekulare Komplexe oder Organellen beobachtet werden, ist jedoch sehr begrenzt. Daher ist eine Mittelung der Makromoleküle (Sub-Tomogramm-Mittelung, STA) mit der gleichen Struktur aus einer größeren Anzahl von Tomogrammen notwendig, um 4-8 Å-Auflösungsmodelle aus den Kryo-ET-Daten6,7zu erreichen. Kürzlich wurde gezeigt, dass Kryo-ET und STA auch zur Bestimmung hochauflösender Strukturen makromolekularer Maschinen wie Ribosomen im Kontext der zellulären Umgebung eingesetzt werden können7. Der Einsatz der Transmissionselektronenmikroskopie ist jedoch durch die Probendicke begrenzt. Im Allgemeinen ist dies kein Problem für Einzelpartikel-Kryo-EM, wo die Optimierung der Vitrifikationsbedingungen schließlich zur Einbettung der Probe in eine dünne Eisschicht führen kann. Auf der anderen Seite sind die meisten Zellen für den 300 keV Elektronenstrahl tatsächlich nicht elektronentransparent. Der unelastische mittlere freie Weg in den verglasten biologischen Proben für die 300 keV-Elektronen beträgt etwa 395 nm8, was bedeutet, dass Kryo-ET-Studien für die meisten Zellen auf die zelluläre Peripherie beschränkt sind.
Es wurden verschiedene Techniken entwickelt, um die Probe auf eine ausreichende Dicke für Kryo-ET zu verdünnen. Die Kryo-Ultramikrotomie nutzt das mechanische Schneiden der Probe mit einem Diamantmesser bei der Temperatur des flüssigen Stickstoffs (-196 °C), um 60-80 nm dicke Abschnitte bereitzustellen, die für Kryo-ET9,10,11geeignet sind. Mehrere Schnitte können aus einer einzigen Zelle vorbereitet werden und die Datenanalyse kann schließlich 3D-Strukturinformationen für den größeren Teil der Zelle erzeugen. Das mechanische Slicing kann jedoch mehrere Artefakte wie gekrümmte Abschnitte, Spalten oder Probenkompression verursachen, die die resultierende Struktur beeinflussen und die Kryo-ET-Daten verzerren können10,11,12. Die kryofokussierte Ionenstrahlmikrobearbeitung (Kryo-FIBM) stellt einen alternativen Ansatz dar, bei dem ein dünner Zellschnitt durch allmähliche Ablation der Probe unter Verwendung eines fokussierten Strahls von Ga+ Ionen (FIB) in einem mehrstufigen Prozess hergestellt wird, was zu einem 80–300 nm dicken zellulären Querschnitt (Lamelle) führen kann13,14,15 . Im Gegensatz zur Kryo-Ultramikrotomie wird nur eine Lamelle aus einer einzigen Zelle hergestellt, die ~ 0,3-3% ihres Volumens ausmacht, und die Mikrobearbeitung mehrerer Zellen ist in der Regel notwendig, um einen Bereich von Interesse im gefrästen Querschnitt zu finden. Darüber hinaus ist der Durchsatz des gesamten Workflows heutzutage noch recht gering, oft beschränkt auf 6-8 hochwertige Lamellen aus einer 8-stündigen Kryo-FIBM-Sitzung. Zum anderen sind die Kryo-FIBM-Querschnitte frei von jeglichen Kompressionsartefakten und bieten einen geeigneten Eingang für hochauflösendes Kryo-ET. Darüber hinaus ist die Übertragung der Lamelle auf den Probenträger für Kryo-ET nicht notwendig, da die Probe während des gesamten Lamellenvorbereitungsprozesses auf dem TEM-Gitter zurückgehalten wird und dasselbe Gitter anschließend auf TEM übertragen werden kann. Wir gehen davon aus, dass der Durchsatz des Kryo-FIBM bald deutlich verbessert wird, vor allem durch die Verfügbarkeit von Software für das unbeaufsichtigte Lamellenfräsen16,17 und die Verwendung von FIBs, die nach dem Prinzip des Charge-Couple-Plasmas arbeiten, was eine schnellere Materialablation ermöglicht.
Saccharomyces cerevisiae (Hefe) sind eukaryotische Zellen mit Kugelform und Durchmesser von ~2-5 μm. Dank ihrer Größe, Zugänglichkeit, Genetik, Generationszeit und einfachen Manipulation wird die Hefe als eukaryotischer Modellorganismus in der zell- und molekularbiologischen Forschung umfassend untersucht, ähnlich wie Escherichia coli,die als prokaryotischer Modellorganismus in der Bakteriologie gut untersucht ist. Die Hefe kann leicht in Suspension kultiviert werden und in kurzer Zeit wird eine hohe Menge an Zellen erzeugt (Verdopplungszeit 1 – 2 Stunden). Noch wichtiger ist, dass Hefe eine komplexe interne Zellstruktur mit tierischen und pflanzlichen Zellen teilt, während sie ein kleines Genom behält, das aus einem geringen Gehalt an nicht-kodierender DNA besteht. Die strukturelle Charakterisierung des Hefeproteoms aus den hochauflösenden In-situ-Daten kann somit helfen, eine mechanistische Beschreibung für die umfangreiche Menge an funktionellen Daten in der Literatur zu liefern.
Hiermit stellen wir ein umfassendes Protokoll für die Erfassung von in situ Kryo-ET-Daten an der Hefeprobe zur Verfügung, das alle Schritte von der Probenkultivierung über die Kryo-FIBM-Lamellenvorbereitung bis hin zum Probentransfer zu TEM zur Kryo-ET-Datenerfassung abdeckt.

<table><tbody><tr><td>Agar</td><td>Himedia</td><td>MB053</td><td></td></tr><tr><td>Glukose</td><td>PENTA</td><td>12020-31000</td><td></td></tr><tr><td>Glycerin</td><td>Merck</td><td>G5516-1L</td><td></td></tr><tr><td>Ethan</td><td>Messer</td><td>1007</td><td></td></tr><tr><td>LN2</td><td>Lineq</td><td>LN2-1L</td><td></td></tr><tr><td>Pepton</td><td>Merck</td><td>P5905-1KG</td><td></td></tr><tr><td>Saccharomyces cerevisiae</td><td>ATCC</td><td>201388</td><td>Stamm BY4741</td></tr><tr><td>Pinzette</td><td>Dumont</td><td>T539</td><td></td></tr><tr><td>Hefeextrakt</td><td>Duchefa Biochemie</td><td>Y1333.1000<</td><td></td></tr><tr><td>strong>Einweg</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Löschpapiere</td><td>Ted Pella</td><td>47000-10</td><td></td></tr><tr><td>C-Clip</td><td>ThermoScientific</td><td>9432 909 97551</td><td></td></tr><tr><td>C-Clip-Ring</td><td>ThermoScientific</td><td>9432 909 97561</td><td></td></tr><tr><td>Streichstäbchen</td><td>Merck</td><td>Z376779-1PAK</td><td></td></tr><tr><td>Sterile Impfösen</td><td>MARKE</td><td>BR452201-1000EA</td><td></td></tr><tr><td>Sterile Petrischalen aus Kunststoff</td><td>Sigma</td><td>SIAL0166</td><td></td></tr><tr><td>TEM-Gitter</td><td>Quantifoil</td><td>4420G-XA</td><td></td></tr><tr><td>Ausrüstung</stark></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Autoklav</td><td>Systec</td><td>101291545</td><td></td></tr><tr><td>Waagen</td><td>BEL</td><td>M124A</td><td></td></tr><tr><td>Kryo-FIB/REM-Mikroskop</td><td>ThermoScientific</td><td>1006123</td><td></td></tr><tr><td>Kryo-TEM Mikroskop</td><td>ThermoScientific</td><td>9432 057 03301</td><td></td></tr><tr><td>Laminar-Flow-Box</td><td>Telstar</td><td>AH5</td><td></td></tr><tr><td>Plasmareiniger</td><td>Gatan</td><td>955.82001</td><td></td></tr><tr><td>Schüttel-Inkubator</td><td>New Brunswick</td><td>M1282-0002</td><td></td></tr><tr><td>UV/VIS-Spektralphotometer</td><td>WPA</td><td>S800</td><td></td></tr><tr><td>Vitrifikationsroboter</td><td>ThermoScientific</td><td>9432 053 50621</td><td></td></tr></tbody></table>

herstellung und kryo-fib-mikrobearbeitung von saccharomyces cerevisiae für die kryo-elektronentomographie

Preparation and Cryo-FIB micromachining of Saccharomyces cerevisiae for Cryo-Electron Tomography

Heute ist die Kryo-Elektronentomographie (Kryo-ET) die einzige Technik, die strukturnahe Daten über makromolekulare Komplexe in situliefern kann. Aufgrund der starken Wechselwirkung eines Elektrons mit der Materie beschränken sich hochauflösende Kryo-ET-Studien auf Proben mit einer Dicke von weniger als 200 nm, was die Anwendbarkeit von Kryo-ET nur auf die peripheren Regionen einer Zelle beschränkt. Ein komplexer Workflow, der die Vorbereitung dünner zellulärer Querschnitte durch kryofokussierte Ionenstrahlmikrobearbeitung (Kryo-FIBM) umfasst, wurde in den letzten zehn Jahren eingeführt, um die Erfassung von Kryo-ET-Daten aus dem Inneren größerer Zellen zu ermöglichen. Wir präsentieren ein Protokoll zur Herstellung von zellulären Lamellen aus einer Probe, die durch Tauchgefrieren unter Verwendung von Saccharomyces cerevisiae als prototypisches Beispiel einer eukaryotischen Zelle mit breiter Nutzung in der zellulären und molekularbiologischen Forschung verglast wurde. Wir beschreiben Protokolle zur Vitrifikation von S. cerevisiae in isolierte Flecken einiger Zellen oder eine kontinuierliche Monoschicht der Zellen auf einem TEM-Gitter und stellen für diese beiden Proben ein Protokoll zur Lamellenpräparation mittels Kryo-FIB zur Verfügung.

Die Kultur Saccharomyces cerevisiae wurde mitten in der exponentiellen Wachstumsphase geerntet. Wir bereiteten zwei Arten von Proben vor, bei denen die Zellen entweder als kleine Cluster mehrerer Zellen über die Oberfläche des TEM-Gitters verteilt wurden (Abbildung 1A, C) oder eine kontinuierliche Monoschicht über einzelnen Gitterquadrate des TEM-Gitters bildeten ( Abbildung1B, D). Der unterscheidungsbescheidender Faktor für die Vorbereitung der Probe mit entweder verschiedenen Zellinseln oder der zellulären Monoschicht ist die Konzentration der Zellkultur, die auf das TEM-Gitter aufgetragen wird. Die geerntete Zellkultur wurde auf OD600 = 1,0 für den ersten Fall bzw. auf OD600 = 30 bis 60 für den letzteren Fall konzentriert. Die Probe zur Herstellung der zellulären Monoschicht wurde vor der Vitrifikation mit 5% v/v Glycerin ergänzt. Das Glycerin ist entscheidend für die Vitrifikation der Pufferlösung, die den Raum zwischen den Zellen ausfüllt (Abbildung 2), da die Reflexionen des kristallinen Puffers für die ordnungsgemäße Positionsverfolgung und Fokussierung während der Kryo-ET-Datenerfassung nachteilig sein können.
Zusätzlich wurde die Hefe-Suspensionskultur gegen das nicht saugfähige Material wie das PTFE-Blotting-Pad oder das kundenspezifische 3D-gedruckte Pad aus FlexFill 98A-Material abgesaugt. Das Löschpapier wurde in Bezug auf die Probenanwendung nur auf der Rückseite des Rasters positioniert (Back-Blotting). Für das Tauchgefrieren der Suspensionskultur wird die Back-Blotting-Strategie empfohlen, da das Beittblendung mit dem Filterpapier von beiden Seiten zu einer Haftung der Zellen auf dem Löschpapier führt (Abbildung 1E).
Das hier beschriebene Protokoll verwendet TEM-Gitter, die in der Gitterpatrone abgeschnitten sind, was eine stabile Unterstützung für das Gitter bildet und die Probenhandhabung der Probe nach der Vitrifizierung erleichtert. Dies erzwingt die Notwendigkeit, dass andere Probenhalter und Shuttles im FIB/SEM- und TEM-Mikroskop eine solche Gitterkartusche aufnehmen können.
Nach dem Transfer der Probe in das FIB/REM-Mikroskop wurde die Probe zunächst mit einer 0,3–1,0 μm Schicht Methylcyclopentadienylplatin mit dem mikroskopischen Gasinjektionssystem (GIS) beschichtet. Eine zusätzliche Schicht des anorganischen Iridiums wurde auf die Probenoberfläche gesputtert, um die GIS-Schicht zu härten und die Oberfläche leitfähig zu machen. Die Lamellen wurden in mehreren Schritten gefräst (Abbildung 3), wobei (I) der Frässtrom, (II) die Lamellenbreite und (III) der Abstand der Fräsfläche über und unter den Proben schrittweise verringert wurden. Der letzte Frässchritt ("Polieren") wurde bei niedrigem Strom (10-30 pA) nur von der Oberseite der Lamelle und mit einer zusätzlichen Neigung der Probe um weitere 1° zum Ga+-Balken durchgeführt. Die Verwendung des beschriebenen Protokolls hat im Durchschnitt dazu geführt, dass innerhalb einer 6-8-stündigen Sitzung 8-10 Lamellen auf zwei TEM-Gittern hergestellt wurden.
Die TEM-Gitter mit den Lamellen wurden anschließend in ein Transmissionselektronenmikroskop überführt. Die Lamellen wurden zuerst gescreent und nur diejenigen ausgewählt, die minimale Vorhänge (Artefakte, die durch ungleichmäßiges Fräsen über die Lamellenoberfläche stammen), einen niedrigen Oberflächenkontaminationsgrad und einen guten Zellkontrast (normalerweise beobachtet bei Lamellen mit &lt; 200 nm Dicke) für die Erfassung der Kryo-ET-Daten zeigten. Darüber hinaus wurden Lamellen, die Risse über die gesamte Länge enthielten, aus der Datenerfassung verworfen. Im Allgemeinen waren etwa 50% der auf TEM übertragenen Lamellen für die Datenerfassung geeignet. Die Tilt-Serie wurde auf dem Post-GIF-K2-Direktelektronendetektor mit dem energieselektrierten Spalt auf 20 eV gesammelt. Die Datenerfassung erfolgte in der SerialEM-Software18 und die Neigungsreihen wurden nach einem dosissymmetrischen Schema19 mit dem Neigungsbereich von ±60° und dem Inkrement von 3° erfasst. Die Daten wurden bei der Vergrößerung erfasst, die der Pixelgröße von 3,47 A/px entspricht. Die Gesamtdosis von 65 e/Å2 wurde gleichmäßig auf die einzelnen Teilrahmen verteilt. Die Neigungsbilder wurden als Satz von drei Frames gesammelt, die anschließend bei der Datenerfassung mit dem MotionCor220-Programm auf die Bewegungs- und Strahlungsschäden korrigiert wurden. Parameter der Kontrastübertragungsfunktion wurden mit Ctffind421geschätzt. Die Neigungsserien wurden in eTomo18 verarbeitet. Die Patch-Tracking-Routine wurde verwendet, um die Bilder auszurichten. Das Tomogramm wurde mit einem gewichteten Rückprojektionsalgorithmus nach 2x Binning der Bilder rekonstruiert und anschließend mit SIRT-ähnlichem Filter (auf 8 Iterationen eingestellt) in IMOD18gefiltert. Die Tomogrammsegmentierung wurde manuell in der Amira Software22durchgeführt. Die rekonstruierten Tomogramme liefern eine hochauflösende Darstellung des Hefezellinneren und ermöglichen es uns, Organellen wie Vakuolen oder Mitochondrien mit hohem Detaillierungsgrad zu beobachten oder makromolekulare Komplexe wie Mikrotubuli oder Kernporenkomplexe in situ und unter nahezu nativen Bedingungen zu untersuchen (Abbildung 4).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62351/62351fig1.jpg"> Abbildung 1: FIB- und REM-Bilder von vitrifiziertem S. cerevisiae FIB (A) und SEM (C) Bilder der kleinen Hefecluster, die auf dem TEM-Gitter verglast sind. FIB (B) und SEM (D) Bilder der Hefe, die eine kontinuierliche Monoschicht auf der Gitteroberfläche bildet. Die Probe wurde vor der Bildgebung mit GIS und Irridium-Layer beschichtet. Die Maßstabsbalken in Paneelen A-B entsprechen 10 μm. Die Hefeprobe wird gegen nicht saugfähiges Material wie PTFE oder FlexFill 98A (grün) und mit dem Löschpapier von der Rückseite des Gitters (weiß, E)positioniert. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62351/62351fig1large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62351/62351fig2.jpg"> Abbildung 2: S. cerevisiae Lamellen Ein TEM-Bild einer Lamelle, die aus der Probe mit kontinuierlicher Monolayer-Hefe über der Gitteroberfläche mikrobearbeitet wurde. Die zwischen den Zellen beobachteten Reflexionen enthielten falsch verglastes Medium/Puffer (A, mit roten Kreisen hervorgehoben). Ein TEM-Bild der auf der Hefe erzeugten Lamelle wird in eine kontinuierliche Monoschicht mit Der Zugabe von 5% Glycerin in das Medium/Puffer (B) verglast. Der Maßstabsbalken entspricht 2 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62351/62351fig2large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62351/62351fig3.jpg"> Abbildung 3: Kryo-FIBM-Workflow Schematische Darstellung des Lamellenfräsprozesses. Die ersten groben Frässchritte werden bei hohen FIB-Strömen von beiden Seiten der vorläufigen Lamellenposition durchgeführt (grün hervorgehoben), während der letzte Polierschritt nur von der Oberseite und bei niedrigem FIB-Strom durchgeführt wird (orange hervorgehoben, siehe begleitendes Video bei 6:33). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62351/62351fig3large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62351/62351fig4.jpg"> Abbildung 4: Hefeorganellen und makromolekulare Komplexe, dargestellt durch Kryo-ET Scheiben der rekonstruierten Tomogramme, die eine Vakuole (A, Maßstabsbalken: 200 nm), Ribosomen (B, Maßstabsbalken: 200 nm), einen parakristallinen Kern von Peroxisom (C, Maßstabsbalken: 100 nm), Mikrotubuli (weißer Pfeil) in der Nähe einer nicht identifizierten Faserstruktur (schwarzer Pfeil, D, Maßstabsbalken: 100 nm), Details mehrerer Mikrotubuli (E, Maßstabsbalken: 50 nm), eine Kernmembran mit poren gekennzeichneten Poren (F, Maßstabsbalken 200nm), Mitochondrium(G,H,Maßstabsbalken: 100 nm, die Pfeile zeigen einzelne Kristalle an), ein Bündel nicht identifizierter filamentöser Strukturen(I,Maßstabsbalken: 100 nm). Die Tafeln B, C, D, E, G enthalten einen Abschnitt von Tomogrammen, die aus kleinen Zellclustern hergestellt wurden, während die Abschnitte von Tomogrammen, die auf Lamellen aus einer Monoschicht der Zellen gesammelt wurden, in den Tafeln A, F, H, Idargestellt sind. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62351/62351fig4large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.</a>

Wir präsentieren ein Protokoll zur Lamellenpräparation von gefrorenen biologischen Proben mittels kryofokussiertem Ionenstrahl-Mikrobearbeitung für hochauflösende Strukturstudien von Makromolekülen in situ mit Kryo-Elektronentomographie. Das vorgestellte Protokoll enthält Richtlinien für die Herstellung von hochwertigen Lamellen mit hoher Reproduzierbarkeit zur strukturellen Charakterisierung von Makromolekülen innerhalb der Saccharomyces cerevisiae.

Herstellung und Kryo-FIB-Mikrobearbeitung von Saccharomyces cerevisiae für die Kryo-Elektronentomographie

Today, cryo-electron tomography (cryo-ET) is the only technique that can provide near-atomic resolution structural data on macromolecular complexes in ...

Dieses Video konzentriert sich auf die Vorbereitung von Hefe-Salmonellen für die Kryo-Elektronentomographie Wir werden den Workflow von der Zellkultivierung bis zur Kryo-Elektronentomographie durchlaufen Saccharomyces cerevisiae werden für die Ionenprobenvorbereitung in Suspension kultiviert Es wird empfohlen, unter sterilen Bedingungen in der Laminar-Flow-Box zu arbeiten Zehn Milliliter sterile Hefe, die für die Zellkultivierung extrahiert wurden, werden hinzugefügt, um den Kultivierungskolben zu sterilisieren. Der Kolben mit Kultivierungsmedium eine Hefekolonie wird sorgfältig von unserer Kultivierungsplatte gepflückt und in das vorbereitete Wachstumsmedium im Kultivierungskolben übertragen, dann mit Folie bedeckt und gut gemischt, um Zellen zu dispergieren Zellkultur wird in den Inkubator gegeben und bei dreißig Grad mit konstanter Bewegung kultiviert, bis die exponentielle Phase hefe Zellkultur ist zu exponentieller Phase herangewachsen und zellphysikalische Dichte wird gemessen durch Halten des Messgeräts gegen ein sauberes Medium als Referenzprobe Zellkultur wird auf OD1 oder OD30 konzentriert, zusätzlich zu fünf Prozent Glycerin vor dem Blanchieren Gefrieren Elektromikroskopische Gitteroberfläche wird gereinigt und für die Anwendung der Zellsuspension aktiviert, indem Plasmagitter in eine Glühentladungskammer mit Blick auf die Kohlenstoffseite nach oben gelegt werden und das Verfahren der Plasmareinigung auf dreißig bis fünfundvierzig Sekunden eingestellt ist, die EM-Gitter jetzt haben und sie sind bereit für die Zelle Probenanwendung Die Vitrifikation der Hefezellsuspension auf EM-Gittern erfolgt durch Blanchieren in das flüssige Ethan mit vitrobot-Maschine Die Herstellung von flüssigem Ethan erfolgt durch Verflüssigen von Ethangas in einem mit flüssigem Stickstoff gekühlten Metallbecher EM-Gitter mit Zellsuspension wird durch Filterpapier von der Rückseite und durch nicht adhäsiven Kunststoff, der von der Vorderkohlenstoffseite gebogen wird Die Temperatur im Inneren der Vitrobot-Kammer wird auf achtzehn Grad und Luftfeuchtigkeit zu hundert Prozent Wartezeit, Blot-Zeit und Blot-Kraft werden auch auf vitrobot-Bildschirm eingestellt Das Glimmentladungsgitter wird von vitrobot Pinzette gepflückt und am Instrument montiert drei Punkt fünf Mikroliter Saccharomyces cerevisiae Suspension wird auf die Kohlenstoffseite des Gitters in der Vitrobot Klimakammer aufgetragen Suspension muss richtig gemischt werden, bevor jede Anwendung des Gittergitters blanchiert wird in die flüssige Ethanelektromikroskopie-Gitter mit verglasten Zellen werden unter flüssigen Stickstoffbedingungen gelagert oder in die Gitterkartusche zum Laden in das Kryo-REM-Mikroskop montiert Das Gitter mit verglasten Zellen wird dann in der Gitterkartusche befestigt, die sowohl auf REM- als auch auf TEM-Mikroskope geeignet ist C-Clip-Ring wird am Clipping-Werkzeug montiert und in flüssigem Stickstoffgitter abgekühlt wird auf Gitterkartuschenkohlenstoff nach unten gelegt und mit dem Die C-Clip-Ringprobe wird dann in die spezielle Gitterbox gelegt Probe für die Lamila-Vorbereitung wird auf das Zweistrahl-FIB / REM-Mikroskop geladen und mit der Kryo-Stage-Vorbereitungskammer ausgestattet, der Ladetopf wird ordnungsgemäß abgekühlt und mit flüssigem Stickstoff gefüllt Probenhalter namens Shuttle wird in die und abgekühlte Gitterbox mit der Probe wird vom Speicherdewar in den Topf übertragen und Gitter werden in zwei Schlitze im Shuttle-Carbon-Seite mit Zellen nach oben im Falle der Verwendung von FIB-Gitterkartuschen der Ausschnitt aus der Gitterkartusche sollte vorsichtig auf zwölf Uhr ausgerichtet werden, in den Shuttle-Gittern wird durch die Schraube angezogen und das Shuttle wird in die Ladeposition umgedreht Ladetopf wird in transferstation platziert und mit Deckel bedeckt Transferkammer mit Ladetopf wird auf die Oberseite des Deckels gelegt und durch die Niedervakuum-Shuttle mit Gittern wird am Stab befestigt und innerhalb der kleinen Transferkammer geschlossen Kammern, die in der Vorbereitungskammer gesammelt sind, gepumpt und Shuttle wird auf Kryo-Stufe in Hochvakuum-REM-Kammer-Stufe wird auf fünfundvierzig Grad geneigt und vier Millimeter auf der Mittelposition des Gitters bewegt Das Einführen der Nadel des Gasinjektionssystems erzeugt eine Schutzschicht organischer auf biologischer Probe gegen Strahlungsschäden während der Fokussierung Ionenstrahl-Fräsgitter werden dann mit einem dünnen Schleier aus anorganischem Metall beschichtet, um eine leitfähige Schicht auf biologischem Material zu erzeugen Fokussiertes Ionenstrahlfräsen von Lamellen in Zellcluster oder Monoschicht erfolgt in wenigen Schritten Schritt wird in den Fräswinkelbereich von Interesse bewegt und obere und untere Fräsmuster werden erzeugt Raulamellen werden mit allmählicher Abnahme des FIB-Stroms und der Lamellendicke gefräst Das endgültige Polieren der Lamelle ist nur mit oberem Muster und niedrigem FIB-Strom durchgeführt, um Frontendschäden und Vorhangeffekt auf lamellenoberflächen elektronenstrahl zu vermeiden zeigt den Fortschritt während des Fräsprozesses hier können wir die endgültige polierte Lamelle sehen Die endgültige Dicke der Lamelle muss weniger als zweihundertfünfzig Nanometer betragen, um für die Übertragung des Elektronenstrahls transparent zu sein die Illustration der Lamelle, die in Zellcluster und Monoschicht mit Vor- und Nachteilen von gefräst ist Beide Probentypen Gitter mit Lamali werden sehr schonend durch die Vorbereitungskammer zurück in den Ladetopf topf übertragen, abgekühlt und mit frischem und sauberem flüssigem Stickstoff gefüllt, um eine Eiskontamination von gemahlenen Lamali-Gittern zu vermeiden, werden aus dem Shuttle entfernt und zurück zur Gitterbox mit gefrästem Lamali gebracht, das schließlich in das Transmissionselektronen-Kryomikroskopgitter übertragen wird, das neunzig Grad gedreht werden muss, bevor es in die TEM-Autoloader-Kassette eingeführt wird um die richtige Ausrichtung der Lamelle in Bezug auf den TEM-Neigungszugang zu gewährleisten Lamili werden gescreent und Region von Interesse für die Erfassung von kryo-elektronentomographischen Daten ist lokalisiert Lamellenhauptachse ist senkrecht zur Neigungsachse des Mikroskops, um das rechte Sichtfeld bei hohen Neigungswinkeln zu sehen dosimetrische Methode wird verwendet, um Kryo-Elektronentomographie-Daten gesammelt zu sammeln Tomogramm wird dann in Etomo-Software verarbeitet und Monoschicht in Amira segmentiert Software In diesem Protokoll haben wir Ihnen gezeigt, wie Sie eine Hefezellprobe für eine Lamellenmikromaschine mit kryofokussiertem Ionenstrahlfräsen effizient vorbereiten und wie Sie Elektronentomographiedaten und Zelllamli aufbereiten und verarbeiten

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Research

Forschung

JoVE Journal

Biochemistry

Biochemie

Cryo Elektronenmikroskope, entweder Scanning (SEM) oder Transmission (TEM), werden häufig für die Charakterisierung von biologischen Proben oder anderen Materialien mit einem hohen Wassergehalt 1 verwendet wird. Eine SEM / Focused Ion Beam (FIB) wird verwendet, um Merkmale von Interesse in Proben zu identifizieren und extrahieren eine dünne, elektronentransparenten Lamellen für die Übertragung auf eine Kryo-TEM.

Cryo-Elektronen-Mikroskopie-Probenvorbereitung mit Hilfe eines Focused Ion Beam

Dieser Artikel beschreibt die Kryo-Elektronenmikroskopie-Methode, die verwendet wird, um qualitativ hochwertige mikroskopische Bilder von Makromolekülen in ihrem nahezu nativen Zustand zu erhalten. Die Methode liefert Bilder, die sich für die weitere computergestützte Verarbeitung mit dem Einzelpartikelansatz eignen, der entwickelt wurde, um die 3D-Rekonstruktion eines Makromoleküls zu erzeugen.

Gebote und Verbote der Kryo-Elektronenmikroskopie: A Primer für Probenvorbereitung und High Quality Data Collection für Makromolekulare 3D-Rekonstruktion

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Instrument und Verfahren zur Herstellung von Nanoliter große Probenvolumina für Transmissions-Elektronenmikroskopie wird vorgestellt. Papier-Blot-Schritte sind nicht erforderlich, wodurch die nachteiligen Folgen, die dies für Proteine, deutlich reduziert Probenverlust und ermöglicht die Analyse der einzelnen Zelle lysate für visuelle Proteomics haben kann.

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Fokussiertes Ionenstrahlfräsen zur Herstellung von glasartigen On-Grid-Lamellen aus tiefgefrorenen biologischen Proben für die Kryo-Elektronentomographie.

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Die steigende Nachfrage nach großflächiger Datenerfassung in der kryogenen Elektronentomographie erfordert Bilderfassungsroutinen mit hohem Durchsatz. Hier wird ein Protokoll beschrieben, das die jüngsten Entwicklungen fortschrittlicher Akquisitionsstrategien implementiert, die darauf abzielen, die Zeiteffizienz und den Durchsatz der tomographischen Datenerfassung zu maximieren.

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Die Strukturbestimmung makromolekularer Komplexe mittels KryoEM ist für bestimmte Klassen von Proteinen und Komplexen zur Routine geworden. Hier wird diese Pipeline zusammengefasst (Probenvorbereitung, Screening, Datenerfassung und -verarbeitung) und die Leser werden auf weitere detaillierte Ressourcen und Variablen geleitet, die bei anspruchsvolleren Proben geändert werden können.

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Hier stellen wir eine Pipeline für das 3D-korrelative fokussierte Ionenstrahlfräsen vor, um die Präparation zellulärer Proben für die Kryo-Elektronentomographie zu steuern. Die 3D-Position von fluoreszenzmarkierten Proteinen von Interesse wird zunächst durch Kryo-Fluoreszenzmikroskopie bestimmt und dann gezielt gemahlen. Das Protokoll eignet sich für Säugetier-, Hefe- und Bakterienzellen.

Probenvorbereitung durch 3D-korrelatives fokussiertes Ionenstrahlfräsen für die hochauflösende Kryo-Elektronentomographie

Das Ziel dieses Protokolls ist es, die Zelladhäsion und das Wachstum auf gezielte Bereiche von Gittern für die Kryo-Elektronenmikroskopie zu lenken. Dies wird durch das Auftragen einer Antifouling-Schicht erreicht, die in benutzerdefinierten Mustern abgetragen wird, gefolgt von der Ablagerung von extrazellulären Matrixproteinen in den gemusterten Bereichen vor der Zellaussaat.

Mikrostrukturierung von Transmissionselektronenmikroskopie-Gittern zur direkten Zellpositionierung innerhalb von Ganzzell-Kryo-Elektronentomographie-Workflows

Ein neu entwickelter mikrostrukturierter Chip mit Graphenoxidfenstern wird unter Anwendung mikroelektromechanischer Systemtechniken hergestellt, die eine effiziente und kryogene Elektronenmikroskopie-Bildgebung verschiedener Biomoleküle und Nanomaterialien mit hohem Durchsatz ermöglichen.

Herstellung eines mikrostrukturierten Chips mit kontrollierter Dicke für die kryogene Elektronenmikroskopie mit hohem Durchsatz

Diese Methode bietet ein zugängliches und flexibles Protokoll für die Herstellung von Elektronenmikroskopie-Gittern (EM) für die zelluläre In-situ-Kryotomographie und die korrelative Licht- und Elektronenmikroskopie (CLEM).

Probenvorbereitung für die In-situ-Kryotomographie von Säugetierzellen

Lernen Sie die Kryo-FIB-Mikrobearbeitung von Saccharomyces cerevisiae für die Kryo-Elektronentomographie. Dieses Protokoll zeigt die Herstellung dünner Lamellen aus Hefezellen für hochauflösende Strukturanalysen im Zellinneren.

Herstellung und Kryo-FIB-Mikrobearbeitung von Saccharomyces cerevisiae für die Kryo-Elektronentomographie

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