Probenvorbereitungs- und Übertragungsprotokoll für die In-Vakuum-Langwellenkristallographie auf der Beamline I23 an der Diamantlichtquelle

Die langwellige makromolekulare Kristallographie nutzt das anomale Signal von Lichtatomen, die nativ in Proteinen und Nukleinsäuren vorkommen. Diese Technik wird verwendet, um das kristallographische Gesichtsproblem experimentell zu lösen und die Identität und Position dieser Elemente zu bestimmen. Beamline I23 at Diamond Light Source ist ein einzigartiges Synchrotroninstrument, das für Experimente mit langen Wellenlängen bis zu fünf Angström optimiert ist.

Es ermöglicht den Zugang zu den Absorptionsrändern von Elementen mit hoher biologischer Relevanz wie Kalzium, Kalium, Chlor, Schwefel und Phosphor. Aufgrund der signifikanten Absorption von Röntgenstrahlen durch Luft im langwelligen Bereich werden diese Experimente in einer Vakuumumgebung durchgeführt. Um Proben bei kryogenen Temperaturen in der Vakuumumgebung zu halten, sind die Kristalle auf speziellen, wärmeleitenden Probenhaltern montiert.

Der kryogene Probentransfer von flüssigem Stickstoff zur Vakuumendstation ist den Techniken der Kryo-Elektronenmikroskopie sehr ähnlich. Dieses Protokoll stellt das Verfahren zur Übertragung von Kristallen in die Vakuumumgebung mit den an der Diamond Light Source entwickelten Werkzeugen und Geräten dar. Trennen Sie zunächst den Deckel von der Basis des CombiPuck, so dass die Probenhalter an der Basis befestigt bleiben und die Fläschchen im Deckel gehalten werden.

Tauchen Sie den Deckel mit Fläschchen in flüssigen Stickstoff, befestigen Sie dann einen Probenhalter und einen Adapter an einem Magnetstab und ernten Sie die Kristalle. Kühlen Sie jede Probe direkt in den CombiPuck und notieren Sie die Probenposition. Um den Puck zu schließen, verwenden Sie einen Puckstab, um die Basis am Deckel zu befestigen.

Übertragen Sie den CombiPuck von flüssigem Stickstoff zum Trockenversender oder Lager. Legen Sie die Basis des Blockpucks, der bereits mit leeren Transferblöcken bestückt ist, in einen Schaumstoffbehälter auf seine Stützbasis und füllen Sie ihn dann mit flüssigem Stickstoff. Legen Sie dann den CombiPuck in den mit flüssigem Stickstoff gefüllten Schaumbehälter und stellen Sie sicher, dass die Basis des Pucks am magnetischen Halter im Schaumbehälter befestigt ist.

Kühlen Sie alle notwendigen Werkzeuge in flüssigem Stickstoff vor. Trennen Sie dann den Deckel von der Basis mit dem Puck-Separator-Werkzeug auf der hohen Einstellung, so dass die Basis am magnetischen Halter befestigt bleibt und die Probenhalter in flüssigem Stickstoff freilegen. Platzieren Sie den Trennstab über dem Probenhalter und dem Adapter so weit wie möglich nach unten, und stellen Sie sicher, dass der Stab vertikal ist.

Bewegen Sie den kleinen Hebel am Trennstab mit dem Daumen nach unten, bis er klickt, um den Probenhalter im Inneren zu befestigen, und ziehen Sie den Probenhalter vom Adapter. Senken Sie den Separator über die gewünschte Transferblockposition und stellen Sie sicher, dass einer der drei Zinken in das zentrale Loch des Transferblocks passt. Lösen Sie den Probenhalter, indem Sie den Hebel wieder nach oben bewegen.

Um Proben in den nächsten Übertragungsblock zu laden, verwenden Sie das Karussell-Schlüsselwerkzeug, um einen leeren Übertragungsblock in die horizontale Position zu drehen. Sobald alle Probenhalter übertragen sind, schließen Sie den Blockpuck, indem Sie den Deckel in flüssigen Stickstoff legen. Warten Sie, bis sich die Temperatur ausgeglichen hat, und legen Sie dann den Deckel über die Basis und heben Sie ihn vorsichtig an, um sich vom Karussell zu lösen.

Befestigen Sie den Shuttle an der Station. Öffnen Sie die Stickstoffgas- und Luftventile und stellen Sie sicher, dass Gase fließen. Schalten Sie dann das CTS ein.

Kühlen Sie sowohl das Bad als auch das Shuttle mit flüssigem Stickstoff ab. Legen Sie den mitgelieferten Trichter in den Füllanschluss des Shuttles und gießen Sie langsam flüssigen Stickstoff in den Trichter, während Sie den Füllstand auf dem Bildschirm überwachen. Stoppen Sie, wenn die Anzeige von Rot nach Blau wechselt.

Füllen Sie das Bad mit flüssigem Stickstoff mit dem Trichter. Übertragen Sie einen Blockpuck aus flüssigem Stickstoff mit dem angebrachten Puckabscheiderwerkzeug in das CTS-Bad. Entfernen Sie den Deckel des Blockpucks und schließen Sie den Deckel des CTS-Bades.

Um einen Transferblock in das Shuttle einzuführen, entriegeln Sie den Shuttle-Griff durch Drehen um 90 Grad im Uhrzeigersinn und bewegen Sie ihn in Richtung Bad, so dass die geführte Spur am Griff den richtigen Fahrweg erzwingt. Sobald die Blockabdeckung abgekühlt ist, schieben Sie den Griff vor, um den Block in das Shuttle einzuführen. Um den Transferblock am Shuttle zu befestigen, drehen Sie den Griff um 180 Grad im Uhrzeigersinn.

Ziehen Sie den Griff in die ursprüngliche hintere Position zurück und verriegeln Sie ihn durch Drehen um 90 Grad gegen den Uhrzeigersinn. Drücken Sie close Shuttle Valve Pump auf dem Bildschirm, um die Shuttle-Evakuierung zu starten. Sobald die Meldungen Shuttle ready to move und Don not move rod, valve closed auf dem Touchscreen angezeigt werden, drücken Sie den Hebel unter dem Shuttle und heben Sie ihn vorsichtig mit dem Griff oben an.

Tragen Sie das Shuttle in aufrechter Position zur Luftschleuse an der Vakuumendstation und befestigen Sie es. Wählen Sie eine leere Blockposition innerhalb des Behälters, indem Sie die entsprechende Taste auf dem Touchscreen drücken und das Probenhotel in die richtige Ladeposition bringen. Sobald sich ein Musterhotel in Position befindet, drücken Sie die Öffnen-Taste, um die Vakuum-Verriegelungssequenz einzuleiten.

Nachdem die Sequenz abgeschlossen ist und sich der Status in Airlock open ändert, blockieren Sie im Shuttle, drehen Sie den Griff um 90 Grad im Uhrzeigersinn, um die Stange zu entriegeln. Drücken Sie die Stange vorsichtig in das Gefäß, damit die geführte Spur den richtigen Fahrweg in Richtung des Probenhotels erzwingt. Legen Sie den Transferblock langsam in das Hotel ein, indem Sie den auf dem Bildschirm angezeigten Video-Feed zur Orientierung verwenden, um sicherzustellen, dass das Blockpositionssymbol auf dem Touch-Display aktiviert ist.

Nach der Aktivierung drehen Sie den Griff um 180 Grad gegen den Uhrzeigersinn, um den Transferblock freizugeben und die Stange aus dem Behälter zu ziehen. Sobald Sie den Griff vollständig eingefahren haben, drehen Sie den Griff um 90 Grad gegen den Uhrzeigersinn, um die Stange zu verriegeln. Drücken Sie die Taste Close, um das Vakuumventil der Endstation zu schließen und den Raum zwischen dem Shuttle und dem Behälter auf atmosphärischen Druck zu entlüften.

Entfernen Sie das Shuttle, wenn die Airlock-Anzeige den Status OK zum Trennen anzeigt. Bringen Sie das Shuttle zum CTS-Bad zurück und drücken Sie Open Shuttle Valve, um das Shuttle zu evakuieren, bevor Sie den nächsten Probenblock laden. Sobald die Ampel grün ist und die Meldung OK to move rod erscheint, kann der nächste Transferblock in das Shuttle eingeführt werden.

Um den nächsten Transferblock vorzubereiten, drehen Sie den Blockpuck im Bad. Drücken Sie den eingebauten Rotationsschlüssel auf der Oberseite des Acryldeckels nach unten in das Schloss in der Mitte des Blockpucks. Halten Sie ihn gedrückt, drehen Sie den Schlüssel, um den gewünschten Übertragungsblock in der Aufnahmeposition zu positionieren.

Sobald alle Blöcke übertragen wurden, stellen Sie sicher, dass das Shuttle-Ventil geöffnet ist, drücken Sie die Bake-Taste auf dem Touchscreen, wählen Sie sowohl Bath als auch Shuttle aus und drücken Sie dann Backen starten. Die langwellige makromolekulare Kristallographie-Beamline I23 an der Diamond Light Source kann auf die Absorptionskanten von Elementen von hoher biologischer Bedeutung wie Kalzium, Kalium, Chlor, Schwefel und Phosphor zugreifen und ein verbessertes anomales Signal liefern, das für die Phaseneinteilung oder Lokalisierung dieser Elemente in Makromolekülen verwendet werden kann. Beugungsdaten wurden von einem einzelnen Thaumatinkristall bei der Wellenlänge 2,75 Angström gesammelt, der als Kompromiss zwischen erhöhtem anomalem Signal und Probenabsorptionseffekten bei längeren Wellenlängen gewählt wurde.

Der Vakuumaufbau stellt sicher, dass nur die von der Probe gestreuten Röntgenstrahlen den Detektor erreichen, was einen geringen Hintergrund um die Bragg-Reflexionen liefert. Der Datensatz lieferte ein sehr starkes anomales Signal, das die Strukturlösung durch die automatische Phasing-Pipeline CRANK2 erleichterte. Die hohe Qualität der resultierenden Elektronendichtekarte ermöglichte eine erfolgreiche automatische Modellbildung mit korrekter Platzierung für 100% der Aminosäuresequenz von Thaumatin.

Die 16 Cysteinreste in Thaumatin bilden acht Disulfidbrücken, die alle in der Elektronendichtekarte deutlich sichtbar sind. Da die In-Vakuum-Langwellenproteinkristallographie ein neues Gebiet ist, haben wir neue Werkzeuge und Geräte für die Probenhandhabung entwickelt. Dieses Protokoll führt Benutzer dazu, Proben sicher in die Vakuumendstation auf der Beamline I23 an der Diamond Light Source zu übertragen.

Die Vakuumumgebung eröffnet einzigartige Möglichkeiten, Beugungsexperimente in einem Wellenlängenbereich durchzuführen, der an anderen Strahllinien nicht zugänglich ist. Die langwellige Röntgenkristallographie ermöglicht die experimentelle Phasenbildung von Makromolekülen direkt aus nativen Kristallen. Es ermöglicht auch die eindeutige Identifizierung von Ionen, die an die Moleküle gebunden sind.