Analyse der Lipidzusammensetzung von Mykobakterien mittels Dünnschichtchromatographie

Mykobakterien Lipide sind ein wichtiges Merkmal der Gattung und entscheidend für die Interaktionen der Wirte Mykobakterien. Geschwindigkeit und Vielseitigkeit sind die Hauptvorteile dieses Verfahrens. Diese Methode kann verwendet werden, um die Rolle von Lipiden und die Pathogenität von Mykobakterien und ihre immunstimulierende Wirkung zu verstehen.

Für die Extraktion nicht-kovalenter verknüpfter Lipide werden 15 Milliliter ein bis zwei Chloroform zu Methanollösung in ein Glasrohr mit einem PTFE-Liner-Schraubverschluss unter einer laminaren Strömungshaube gegeben. Dann kratzen Sie 200 Milligramm Mykobakterien aus einem festen Medium und fügen Sie die Mykobakterien in die Glasröhre hinzu. Inkubieren Sie das Röhrchen über Nacht unter ständigem Rühren.

Am nächsten Tag filtern Sie die organischen Lösungsmittel durch einen mit Filterpapier ausgekleideten Glastrichter in ein Glasrohr. Nach der Verwendung von Stickstoffgasfluss, um die flüssige Phase im Rohr zu verdampfen, füllen Sie das Rohr mit Stickstoffgas, um das Rohr bei vier Grad Celsius zu speichern. Dann fügen Sie 15 Milliliter eines Zwei-zu-Eins-Chloroforms zu Methanollösung zu den Zelltrümmern hinzu und inkubieren Sie das Röhrchen über Nacht unter ständigem Rühren.

Lassen Sie die Mischung am nächsten Morgen eine Stunde ruhen, bevor Sie mit einer Pasteur-Pipette die organischen Lösungsmittel in einen mit Filterpapier ausgekleideten Glastrichter in dasselbe Glassammelrohr überführen. Anschließend verdampfen Sie die flüssige Phase wie gezeigt, bevor Sie das Rohr für eine Lagerung von vier Grad Celsius mit Stickstoffgas auffüllen. Für die Mykolsäureextraktion zwei bis fünf Milliliter einer Rührlösung und 200 Milligramm Mykobakterien-Biomasse in ein hermetisches Glasrohr mit einem PTFE-Liner-Schraubverschluss geben und den Inhalt durch Wirbeln mischen.

Inkubieren Sie die Mischung in einem trockenen Bad bei 80 Grad Celsius über Nacht. Am nächsten Tag, wenn das Rohr Raumtemperatur abgekühlt hat, fügen Sie zwei Milliliter N-Hexan hinzu und mischen Sie den Inhalt für 30 Sekunden durch Wirbeln. Lassen Sie das Rohr sich absetzen, bis zwei klare Phasen auftreten, und übertragen Sie die obere N-Hexanphase auf ein neues Rohr.

Mischen Sie zwei zusätzliche Milliliter N-Hexan mit dem Röhrcheninhalt und sammeln Sie die obere Schicht wieder auf. Dann verdampfen Sie den Rohrinhalt durch Stickstofffluss und lagern Sie die mit Stickstoff bedeckte Probe bei vier Grad Celsius, wie gezeigt. Um die Proben mit TLC zu analysieren, bedecken Sie eine Wand der TLC-Kammer mit einem Stück Filterpapier, fügen Sie Vaseline auf die Kammerecken hinzu, um die Kammer zu versiegeln, um die Lösungsmittelmischung über das Filterpapier zu geben und das verbleibende Volumen des Lösungsmittels auf den Boden der TLC-Kammer zu geben.

Schließen Sie die TLC-Kammer für mindestens 20 Minuten bis gesättigt. In der Zwischenzeit die Lipide im Glasrohr in 200 bis 1000 Mikroliter Chloroform auflösen und mit einem Kapillarglasrohr 10 Mikroliter der Lipidchloroformsuspension direkt auf die TLC-Platte auftragen. Nachdem Sie die Probe fünf Minuten trocknen lassen, legen Sie die Platte in die gesättigte TLC-Kammer ein und lassen Sie die mobile Phase durch den TLC laufen.

Wenn das Lösungsmittel einen Zentimeter vom oberen Ende der Platte entfernt ist, legen Sie die Platte unter laminares Flussmittel, bis die Kieselsäure vollständig trocken ist. Dann besprühen Sie die getrocknete Platte mit 15 bis 20 Millilitern 10% molarer Datenphosphorsäurehydrat in Ethanol, bis die Platte hellgelb ist, und erhitzen Sie die Platte für zwei bis fünf Minuten bei 120 Grad Celsius. In dieser repräsentativen Analyse wurde die aus verschiedenen Mykobakterienarten extrahierte Mykolsäure durch eindimensionale TLC mit zwei verschiedenen Elutionssystemen und zweidimensionalem TLC analysiert.

Zwei Arten von Methylierungsverfahren wurden ebenfalls durchgeführt, um das Vorhandensein von Typ-Fünf-Mykolsäure zu bestätigen. In beiden Elutionssystemen befanden sich die Mykolsäuren ungefähr in der Mitte der Platte, obwohl der Punkt, der der Mykolsäure typ fünf entspricht, erst nach der Verseifung beobachtet wurde. Zweidimensionales TLC ermöglicht auch die Identifizierung einzelner Mykolsäuretypen.

Zum Beispiel exprimiert Mycobacterium brumae nur Mykolsäuren vom Typ eins, Mycobacterium bovis BCG exprimiert Typ eins und vier, Mycobacterium fortuitum exprimiert Typ eins und fünf und Mycobacterium abcessus exprimiert Typ eins und zwei Mykolsäureprofile. Die Gesamtlipidextrakte verschiedener Mykobakterienarten wurden in Abhängigkeit von ihrer Polarität und Größe analysiert. Es zeigt sich, dass die meisten A-polaren Lipide, wie PDIMs, in Mycobacterium bovis BCG vorhanden sind, aber nicht in Mycobacterium fortuitum, Mycobacterium brumae und dem glatten Morphotyp von M abzessus.

Phenolische Glykolipide sind nur in Mycobacterium bovis BCG vorhanden, während Glykopeptidolipide nur in Proben von Mycobacterium abcessus beobachtet werden. Ähnlich wie Mykolsäuren können auch Acylglycerole und PDIMs, PIMs, durch eindimensionale TLC- oder 2D-TLC-Analyse leicht visualisiert werden. Zwei Arten von Flecken wurden verwendet, um PIMs in eindimensionalem TLC aufzudecken.

Das Wichtigste, woran Sie sich bei diesem Protokoll erinnern sollten, ist, während des gesamten Verfahrens keine Kunststoffinstrumente zu verwenden.