Name: Generation von Zebrafischen Larval Xenografts und Tumorverhaltensanalyse (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-06-19T13:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 8 s
Description: Erfahren Sie die standardisierte Methode zur Erzeugung von Zebrafisch-Larven-Xenotransplantaten mit menschlichen Tumorzellen. Dieses Protokoll ermöglicht die Analyse von Tumorverhalten, Angiogenese und Metastasierung in vivo mit Einzelzellauflösung für Krebsforschung.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Wir danken der Champalimaud Foundation, Congento (LISBOA-01-0145-FEDER-022170, kofinanziert von FCT/Lisboa2020) für die Finanzierung. FCT-Stipendien für VP (SFRH/BD/118252/2016), MML (PD/BD/138203/2018). Alle Mitglieder des Fior Lab für kritische Diskussionen; B. Costa und C. Rebelo de Almeida für den Datenaustausch; und unsere Lab-Mitglieder C. Rebelo de Almeida, M. Barroso und L. Leite für ihre Teilnahme an dem Video. Wir danken der CF Fish Facility (C. Certal, J. Monteiro et al.) und dem Team von Champalimaud Communication, Events and Outreach insbesondere Alexandre Azinheira für die fantastische Filmproduktion und Catarina Ramos und Teresa Fernandes für ihre Hilfe.

<ol><li>Gut, P., Reischauer, S., Stainier, D. Y. R., Arnaout, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Little+Fish%2C+Big+Data%3A+Zebrafish+as+a+Model+for+Cardiovascular+and+Metabolic+Disease%5BTitle%5D)+AND+%22Physiological+Reviews%22%5BJournal%5D)">Little Fish, Big Data: Zebrafish as a Model for Cardiovascular and Metabolic Disease.</a> Physiological Reviews. 97, 889-938 (2017).</li>
<li>Howe, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+zebrafish+reference+genome+sequence+and+its+relationship+to+the+human+genome%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">The zebrafish reference genome sequence and its relationship to the human genome.</a> Nature. 496, 498-503 (2013).</li>
<li>Santoriello, C., Zon, L. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hooked%21+Modeling+human+disease+in+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Clinical+Investigation%22%5BJournal%5D)">Hooked! Modeling human disease in zebrafish.</a> Journal of Clinical Investigation. 122, 2337-2343 (2012).</li>
<li>Stoletov, K., Klemke, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Catch+of+the+day%3A+zebrafish+as+a+human+cancer+model%5BTitle%5D)+AND+%22Oncogene%22%5BJournal%5D)">Catch of the day: zebrafish as a human cancer model.</a> Oncogene. 27, 4509-4520 (2008).</li>
<li>Weintraub, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((All+eyes+on+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+Animals%22%5BJournal%5D)">All eyes on zebrafish.</a> Lab Animals. 46, 323-326 (2017).</li>
<li>Novoa, B., Figueras, A. Zebrafish: Model for the Study of Inflammation and the Innate Immune Response to Infectious Diseases. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aNovoa%2C+B+%22Current+Topics+in+Innate+Immunity+II%22">Current Topics in Innate Immunity II</a>. Lambris, J. D., Hajishengallis, G. , Springer. 253-275 (2012).</li>
<li>Fazio, M., Ablain, J., Chuan, Y., Langenau, D. M., Zon, L. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Zebrafish+patient+avatars+in+cancer+biology+and+precision+cancer+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Cancer%22%5BJournal%5D)">Zebrafish patient avatars in cancer biology and precision cancer therapy.</a> Nature Reviews Cancer. 20, 263-273 (2020).</li>
<li>Fior, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-cell+functional+and+chemosensitive+profiling+of+combinatorial+colorectal+therapy+in+zebrafish+xenografts%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Single-cell functional and chemosensitive profiling of combinatorial colorectal therapy in zebrafish xenografts.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 114, 8234-8243 (2017).</li>
<li>Póvoa, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Innate+immune+evasion+revealed+in+a+colorectal+zebrafish+xenograft+model%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Innate immune evasion revealed in a colorectal zebrafish xenograft model.</a> Nature Communications. 12, 1156(2021).</li>
<li>Galletti, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeting+Macrophages+Sensitizes+Chronic+Lymphocytic+Leukemia+to+Apoptosis+and+Inhibits+Disease+Progression%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">Targeting Macrophages Sensitizes Chronic Lymphocytic Leukemia to Apoptosis and Inhibits Disease Progression.</a> Cell Reports. 14, 1748-1760 (2016).</li>
<li>Rebelo de Almeida, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Zebrafish+xenografts+as+a+fast+screening+platform+for+bevacizumab+cancer+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Communications+Biology%22%5BJournal%5D)">Zebrafish xenografts as a fast screening platform for bevacizumab cancer therapy.</a> Communications Biology. 3, 1-13 (2020).</li>
<li>Varanda, A. B., Martins-Logrado, A., Godinho Ferreira, M., Fior, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Zebrafish+Xenografts+Unveil+Sensitivity+to+Olaparib+beyond+BRCA+Status%5BTitle%5D)+AND+%22Cancers%22%5BJournal%5D)">Zebrafish Xenografts Unveil Sensitivity to Olaparib beyond BRCA Status.</a> Cancers. 12, 1769(2020).</li>
<li>Osmani, N., Goetz, J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiscale+Imaging+of+Metastasis+in+Zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Cancer%22%5BJournal%5D)">Multiscale Imaging of Metastasis in Zebrafish.</a> Trends in Cancer. 5, 766-778 (2019).</li>
<li>Hyenne, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Studying+the+Fate+of+Tumor+Extracellular+Vesicles+at+High+Spatiotemporal+Resolution+Using+the+Zebrafish+Embryo%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Cell%22%5BJournal%5D)">Studying the Fate of Tumor Extracellular Vesicles at High Spatiotemporal Resolution Using the Zebrafish Embryo.</a> Developmental Cell. 48, 554-572 (2019).</li>
<li>Costa, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Developments+in+zebrafish+avatars+as+radiotherapy+sensitivity+reporters+-+towards+personalized+medicine%5BTitle%5D)+AND+%22EBioMedicine%22%5BJournal%5D)">Developments in zebrafish avatars as radiotherapy sensitivity reporters - towards personalized medicine.</a> EBioMedicine. 51, 102578(2020).</li>
<li>Costa, B., Estrada, M. F., Mendes, R. V., Fior, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Zebrafish+Avatars+towards+Personalized+Medicine-A+Comparative+Review+between+Avatar+Models%5BTitle%5D)+AND+%22Cells%22%5BJournal%5D)">Zebrafish Avatars towards Personalized Medicine-A Comparative Review between Avatar Models.</a> Cells. 9, 293(2020).</li>
<li>TRICAINE - Protocols. ZFIN Community Wiki. , Available from: 
 <a target="_blank" href="https://wiki.zfin.org/display/prot/TRICAINE">https://wiki.zfin.org/display/prot/TRICAINE</a> (2021).</li>
<li>Zhao, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Novel+Xenograft+Model+in+Zebrafish+for+High-Resolution+Investigating+Dynamics+of+Neovascularization+in+Tumors%5BTitle%5D)+AND+%22Plos+One%22%5BJournal%5D)">A Novel Xenograft Model in Zebrafish for High-Resolution Investigating Dynamics of Neovascularization in Tumors.</a> Plos One. , (2011).</li>
<li>Veinotte, C. J., Dellaire, G., Berman, J. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hooking+the+big+one%3A+the+potential+of+zebrafish+xenotransplantation+to+reform+cancer+drug+screening+in+the+genomic+era%5BTitle%5D)+AND+%22Disease+Models+%26+Mechanisms%22%5BJournal%5D)">Hooking the big one: the potential of zebrafish xenotransplantation to reform cancer drug screening in the genomic era.</a> Disease Models & Mechanisms. 7, 745-754 (2014).</li>
<li>Haldi, M., Ton, C., Seng, W. L., McGrath, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+melanoma+cells+transplanted+into+zebrafish+proliferate%2C+migrate%2C+produce+melanin%2C+form+masses+and+stimulate+angiogenesis+in+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Angiogenesis%22%5BJournal%5D)">Human melanoma cells transplanted into zebrafish proliferate, migrate, produce melanin, form masses and stimulate angiogenesis in zebrafish.</a> Angiogenesis. 9, 139-151 (2006).</li>
<li>Zon, L. I., Peterson, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+New+Age+of+Chemical+Screening+in+Zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Zebrafish%22%5BJournal%5D)">The New Age of Chemical Screening in Zebrafish.</a> Zebrafish. 7, 1(2010).</li>
<li>Mycoplasma Contamination of Cell Cultures. InvivoGen. , Available from: 
 <a target="_blank" href="https://www.invivogen.com/review-mycoplasma">https://www.invivogen.com/review-mycoplasma</a> (2016).</li>
<li>van Zijl, F., Krupitza, G., Mikulits, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Initial+steps+of+metastasis%3A+cell+invasion+and+endothelial+transmigration%5BTitle%5D)+AND+%22Mutation+Research%22%5BJournal%5D)">Initial steps of metastasis: cell invasion and endothelial transmigration.</a> Mutation Research. 728, 23-34 (2011).</li>
</ol>

Die zunehmende Bedeutung des Zebrafisches als Modell für die Krebsentwicklung und das Arzneimittelscreening hat zu zahlreichen Publikationen3,4,7,13,14,16,18,19,20,21geführt. Die Injektion von Krebszellen in Zebrafisch-Embryonen ist jedoch eine Technik, die ein hohes Maß an Geschicklichkeit erfordert, das für Forscher eine Herausforderung sein kann. In diesem Protokoll wollen wir praktische Informationen und einige Tipps geben, die helfen können, die anfänglichen Herausforderungen bei der Einrichtung von Zebrafisch-Embryo-Xenografts zu meistern.
Zellhandling vor der Injektion Dieses optimierte Protokoll für die Erzeugung von Zebrafisch-Xenografts mit Zelllinien kann an verschiedene Arten von (Krebs-)Zellen mit unterschiedlichen Morphologien angepasst werden. Wir empfehlen, dass alle Zelllinien, die für Zebrafisch-Xenografts verwendet werden, mykoplasmafrei sind. Im Gegensatz zu anderen bakteriellen Verunreinigungen erzeugt das Vorhandensein von Mykoplasmen in der Zellkultur keine Veränderungen, die leicht unter dem Mikroskop erkannt werden können22. Mykoplasmenkontamination kann das Transplantationspotenzial der Zelllinien, ihre Empfindlichkeit gegenüber Medikamenten sowie die Lebensfähigkeit der Zebrafischembryonen beeinträchtigen.
Obwohl sich Zellen über einen längeren Zeitraum weiter ausbreiten können, können ihr Phänotyp und Ihr Genotyp anfällig für Veränderungen sein. Es ist wichtig, sich mit der Morphologie und dem Verhalten der Zelllinien in der Kultur vertraut zu machen. Wir empfehlen, die Anzahl der Zellpassagen nach dem Auftauen zwischen 3-12 zu halten, um reproduzierbare Ergebnisse zu erhalten. Daher sollten regelmäßige Mykoplasmentests durchgeführt werden.
Die Zellen sollten sich in ihrer Logphase befinden (exponentielle Wachstumsphase vor Erreichen des Zusammenflusses von 70 %) am Tag der Injektion. Dies wird eine angemessene Transplantation und richtige Entwicklung der unverwechselbaren Merkmale des Tumors ermöglichen. Um Eine Variation des Phänotyps von Zellen innerhalb des Xenografts zu verhindern, ist es wichtig, den Zusammenfluss für Injektionskonstanten zwischen den Experimenten beizubehalten. Die Anzahl der injizierten Zellen kann an die Eigenschaften jeder Zelllinie angepasst werden, da einige höhere Injektionsdichten erfordern können, um in den Zebrafischembryonen gedeihen zu können.
Überlegungen zur Zellkennzeichnung Um menschliche Tumorzellen für die Injektion und zukünftige Analyse besser zu visualisieren, können Tumorzellen mit fluoreszierenden Farbstoffen gekennzeichnet werden. Aufgrund von Unterschieden in der Zellgröße variiert die Gesamtzahl der Zellen/cm2 in anhaftenden Kulturen zwischen den Zelllinien. Dies wirkt sich auf die Wirksamkeit des Färbeprotokolls sowie auf die Anzahl der zur Injektion geernteten Zellen aus. Große Zellen, die niedrige Zahlen pro Kolben (d. h. Hs578T) liefern oder in Clustern wachsen (d. h. BFTC905), erfordern das Zusammenführen mehrerer Kolben für ein einzelnes Experiment. In diesem Fall sollte die Färbung von Zellen nicht direkt im Kolben durchgeführt werden, da dies die Verwendung von übermäßigen Mengen an Farbstoff (hohe Kosten) verursachen wird. Andererseits können Zellen, die sehr empfindlich auf übermäßige Zentrifugationszyklen reagieren, sowie solche, die hohe Zahlen pro Kolben ergeben (d. h. HCT116), direkt im Kolben befleckt und dann mit EDTA/Zellschaber abgelöst werden (weitere Informationen siehe Tabelle 1).
Wenn möglich, verwenden Sie EDTA, anstatt einen enzymatischen Ansatz zu verwenden, um die Zellen am Tag der Injektion zu lösen, so dass Zellen ihre Zell-Zell-Verbindungen schneller wiederherstellen und weniger Zentrifugationsschritten ausgesetzt sind. Wenn die Zellen jedoch empfindlich auf EDTA reagieren, sehr haftend sind oder in Clustern wachsen , kann eine enzymatische Methode angewendet werden. Die Optimierung der idealen Injektionskonzentration sowie des Injektionsmediums hängt von den Eigenschaften jeder Zelllinie ab, so dass einige Anpassungen erforderlich sein könnten (Tabelle 1).
Mikroinjektionskalibrierung Im Gegensatz zur Abgabe von Oligonukleotiden oder Medikamenten in den Zebrafisch-Embryo wird ein Graticule nicht verwendet, um die Nadel bei der Arbeit mit Zelllinien für Xenografts zu kalibrieren. Nach einiger Zeit während der Injektion beginnen die Zellen zu verstopfen, und es ist notwendig, die Spitze der Nadel zu schneiden, um ihren Durchmesser zu erhöhen oder die Nadel vollständig zu ändern. Dieses Verfahren behindert die Gitterrifikulationskalibrierung.
Um dieses Problem zu lösen, wird die Anzahl der abgegebenen Zellen durch Auswurfdruck und Zeit, die benötigt wird, um eine Größe ähnlich dem Embryoauge innerhalb von 1-3 Impulsen zu erreichen, reguliert. Um die Tumorgröße weiter zu kontrollieren, werden bei 1 dpi Xenografts nach der Tumorgröße sortiert, wie in Abbildung 6 B-B"dargestellt. Wie in Abbildung 6C dargestellt, ist diese Methode der Sortierung effizient bei der Verringerung der Variation der Tumorgrößen: Wenn wir sie alle zusammen bündeln (+, ++, +++), ist der STEV das Doppelte der ++-Klasse (906 Zellen auf 422 Zellen) und die Koeffizientenvariation beträgt 31,9 % im Vergleich zu 14,5 % in der ++-Klasse. Da der Referenzwert für die Injektion Volumen ist, variiert die Gesamtzahl der Zellen stark zwischen den Zelltypen - abhängig von der Größe und Form der Zellen. Zum Beispiel produzieren große Zellen mit viel Zytoplasma wie Brustkrebs Hs578T viel kleinere Tumoren (ca. 600 Zellen). Außerdem erfordert jede Zelllinie eine unterschiedliche Anzahl von Zellen. Zum Beispiel haben die Harnblasenzelllinien HT29 CRC und RT112 gezeigt, dass je höher die Anzahl der injizierten Zellen, desto höher die Zebrafischsterblichkeit. Daher ist eine Phase der Optimierung während der Entwicklung der Xenografts erforderlich, um zu testen, ob die Zelllinie toxische Wirkungen im Embryo hat oder höhere/niedrigere Injektionsdichten erfordert.
Injektionsstelle Eine der häufigsten Diskrepanzen bei der Erzeugung von Zebrafisch-Embryo-Xenografts ist die Injektionsstelle. Das Eigelb ist in der Regel der Ort der Wahl für die Injektion aufgrund seiner einfachen Zugänglichkeit. Wir haben jedoch beobachtet, dass Zellen, die in das Eigelb injiziert werden, eine höhere Neigung zum Absterben haben. Obwohl technisch schwieriger, empfehlen wir, in die PVS und so weit wie möglich aus dem Herzen zu injizieren. Innerhalb der PVS können Zellen aggregieren, Gefäße und Immunzellen rekrutieren und migrieren, intravasieren, extravasatieren und Mikrometastasen bilden, wenn sie metastasierende Eigenschaften aufweisen8,11.
Effizienz der Transplantation Unterschiede in der Transplantationseffizienz und Tumorgröße zwischen Zelllinien bei 4 dpi werden aufgrund ihres unterschiedlichen Grades an Basalzelltod/-überleben/-proliferation, aber auch aufgrund der angeborenen Immunogenität erwartet, die jede Zelllinie9anzeigen kann.
Metastase Metastasen besteht aus einer mehrstufigen Kaskade von Ereignissen, die in zwei beliebige Stufen unterteilt werden kann. Im ersten Stadium müssen sich Tumorzellen von der primären Stelle lösen, in angrenzende Gewebe wandern und eindringen und dann in den Blutkreislauf intravasieren. Im zweiten Stadium müssen Tumorzellen im Kreislauf überleben, aus dem Blut oder den Lymphgefäßen extravasieren und schließlich an sekundären Stellen besiedeln23. Um zwischen diesen frühen und späten Ereignissen zu unterscheiden und das Potenzial/die Fähigkeit der verschiedenen Tumorzellen zu adressieren, diese Schritte durchzuführen, haben wir einen einfachen Assay entworfen.
Im Allgemeinen können Tumorzellen, wenn sie in das PVS injiziert werden, direkt in den Kreislauf eintreten und dann physisch im kaudalen hämatopoetischen Gewebe (CHT) (Schwanzbereich) gefangen werden. Jedoch, nach den Eigenschaften jeder Tumorzelle - wir haben gesehen, dass einige Tumorzellen am CHT 4 dpi bleiben und in der Lage sind, Mikrometastasen zu bilden, während andere Tumorzellen verschwinden (gelöscht, nachdem sie in der CHT gefangen wurden).
Daher können wir durch den Vergleich der Mikrometastaseneffizienz (bei 4 dpi), wenn Zellen direkt in den Kreislauf gebracht wurden - CIRC (Zellen müssen nur die späten Schritte der Metastasierung durchlaufen) vs. wenn nicht - NO CIRC (Zellen müssen frühe und späte Schritte durchlaufen, um eine Mikrometastasierung bilden zu können) ihr frühes oder spätes metastasiertes Potenzial bewerten. Wir haben Tumorzellen beobachtet, die in beiden Gruppen (CIRC und NO CIRC) effizient Mikrometastasen in der CHT bilden können, was darauf hindeutet, dass diese Zellen die Fähigkeit haben, alle Schritte der metastasierenden Kaskade (SW480 und MDA-MB-468 zum Beispiel)8,11zu durchlaufen. Im Gegensatz dazu haben andere Tumorzellen in beiden Gruppen ein sehr geringes metastasiertes Potenzial, das selbst bei injektionen Mikrometastasen kaum jemals mikrometastasiert (d.h. im CHT mit 24 PSi sichtbar ist, aber bei 4 dpi nicht mehr da ist, hs578T zum Beispiel)8. Wir haben jedoch eindeutig eine andere Gruppe gefunden - eine, die nur in der Lage ist, Mikrometastasen zu bilden, wenn sie in den Kreislauf injiziert wird (wir können nur Mikrometastasen in der CIRC-Gruppe beobachten). Dies deutet darauf hin, dass diese Zellen eine geringe Effizienz bei der Durchführung der ersten Schritte der metastasierenden Kaskade haben, aber auf der anderen Seite in der Lage sind, im Kreislauf zu überleben, zu extravasatisieren und eine entfernte Stelle zu kolonisieren.
Immunostaining und Imaging Vor der Fixierung kann dieses Injektionsprotokoll für andere Live-Imaging-Ansätze wie Live Differential Interference Contrast (DIC)-Mikroskopie, Spinnscheibenmikroskopie, hochauflösende Konfokalbild-Live-Bildgebung und Lichtbogenmikroskopie usw. verwendet werden.
Tote Zellen und zelluläre Trümmer erscheinen hell, wenn sie durch das fluoreszierende Stereomikroskop beobachtet werden, und können mit lebenden Zellen verwechselt werden, insbesondere wenn das Ziel der Studie darin besteht, das metastasierende Potenzial der Zelllinien zu bewerten. Wir möchten betonen, wie wichtig es ist, konfokale Bildgebung mit spezifischen Lebensfähigkeitsmarkern und DAPI durchzuführen, um den Überlebenszustand des Tumors und der Mikrometastasen zu bewerten. Auch ist es von grundlegender Bedeutung, spezifische menschliche Antikörper zu verwenden, um menschliche Zellen wie antihumane Mitochondrien oder antihumane HLA zu erkennen. Trainieren Sie bei der Implementierung des Protokolls die Experimentatoraugen, indem Sie die Färbung im Stereomikroskop mit den konfokalen Bildern vergleichen. Nach einiger Zeit können Experimentatoren Trümmer deutlich von lebenden Zellen im fluoreszierenden Stereomikroskop unterscheiden.
Obwohl andere Methoden zur Quantifizierung der Tumorbelastung, wie z. B. der gesamten Fluoreszenzbereich, weit verbreitet sind, empfehlen wir, eine ganze Mount-Immunostainierung und konfokale Bildgebung als genauere Methode durchzuführen. Nicht nur die Effizienz der lipophilen Farbstofffärbung ist sehr variabel (d.h. einige Zellen sind sehr gut gefärbt, während andere nicht -wahrscheinlich aufgrund des Lipidgehalts ihrer Membranen sind), sondern auch oft lipophile Farbstoffe bilden Aggregate, und abgestorbene Zellen neigen dazu, heller zu sein - und mehrere Artefakte zu schaffen, die mit lebenden Zellen verwechselt werden können.
Zellen können mit fluoreszierenden Proteinen transduziert werden, um bei ihrer Verfolgung zu helfen und die Zellkennzeichnung zu überspringen. Stellen Sie jedoch sicher, dass die transduzierten und nicht transduzierten Zellen die gleichen Ergebnisse in den Zebrafisch-Xenografts produzieren.
Darüber hinaus können Makrophagen diese fluoreszierenden Zellablagerungen phagozyten und fluoreszierend beschriftet werden und migrieren, wodurch falsch positive metastasierende Zellen erzeugt werden. Daher empfehlen wir eine Reihe von Analysewerkzeugen, die natürlich auf viele andere Auslesungen ausgedehnt werden können, um das Tumorverhalten genauer zu interpretieren:
<ul style="list-style-type: square;"><li>
Proliferation - Quantifizierung von mitotischen Zahlen mit DAPI oder Anti-PHH3Ser10 Antikörper (Merck Millipore Cat. #06-570),</li>
	<li>
Zelltod durch Apoptose- Antikörper-Anti-aktivierteCaspase3 Asp175 (Cell Signalling Technologies Cat. #9661) oder gleichwertig,</li>
	<li>
Tumorgröße - DAPI-Zählung - menschliche Tumorzellen zeigen eine sehr ausgeprägte Chromatin-Organisation, so dass sie leicht von den Zebrafischzellen unterschieden werden können und immer möglich sind, mit dem Farbstoff zu überprüfen (wenn Sie Ihr Auge trainieren),</li>
	<li>
Für metastasierende Studien,um menschliche Zellen eindeutig zu detektieren, - antihumane HLA (Abcam EP1395Y Cat. #ab52922), antihumane Mitochondrien (Merck Millipore Cat. #MAB1273- Clone 113-1).</li>
</ul>Für eine konfokale Erfassung mit einem Intervall von 5 m zwischen den Scheiben im Z-Stack der Kontrollkrebszellen HCT116 (durchschnittliche Kerngröße von 10-12 m Durchmesser) mit DAPI-Gegenfärbung haben wir beobachtet, dass 50 % der Zellen zwischen zwei aufeinanderfolgenden Scheiben aufgeteilt werden. Wenn also jedes Segment gezählt wird, besteht ein hohes Risiko, dass dieselben Zellen zweimal gezählt werden. Das Hin- und Hergehen zwischen Slices, um Probleme bei der Quantifizierung zu vermeiden, führt zu einer zeitaufwändigen und fehleranfälligen Technik. Um die Quantifizierung der Gesamtzahl der Zellen zu erleichtern und mehr Reproduzierbarkeit zwischen Forschern zu ermöglichen, haben wir die zuvor in diesem ProtokollbeschriebeneTumorgrößenformel erstellt 8 .
Wir haben eine Korrekturnummer (1.5) aufgenommen, um die 50 %-Zellen zu berücksichtigen, die zwischen Slices aufgeteilt werden. Wir fanden heraus, dass der durchschnittliche Fehler bei der manuellen Zählung des gesamten Tumors zwischen den Forschern 20% betrug. Zwei Forscher, die die Formel verwendet, hatten einen 2%-Fehler. Die Verwendung dieser Formel hat eine Genauigkeitsrate von 93 % und eine Reproduzierbarkeitsrate von 98 %. Wir haben auch automatisierte Methoden getestet, aber sie zeigten einen Fehler von mehr als 50 %, der durch Schwellenwerteinstellungen verursacht wurde.
Aufgrund der Eigenschaften apoptotischer Zellen ist die Quantifizierung aktivierter Caspase-3-Zellen schwieriger. Um die Anzahl der Fehler und Die Variation der Ergebnisse zu reduzieren, empfehlen wir, dass die Kontroll- und Versuchsproben vom selben Forscher gezählt werden. Darüber hinaus muss ein neuer Forscher beim Erlernen dieser Technik Bilder zählen, die bereits von erfahreneren Forschern quantifiziert wurden, um Ergebnisse zu vergleichen und zu trainieren.
Die Länge des Assays kann bei Bedarf verlängert werden. Es ist jedoch wichtig zu berücksichtigen, dass Zebrafischlarven ab 7 Tagen nach der Befruchtung (5 Tage nach der Injektion) eine lebende Fütterung benötigen. Darüber hinaus können die Tierschutzrichtlinien und -vorschriften für Larven, die älter als 6 Tage nach der Befruchtung sind, variieren.
Dieses Protokoll bietet nützliche Werkzeuge, die es einem einzelnen Forscher ermöglichen, etwa 200-300 Zebrafischlarven pro Stunde zu injizieren; und Ergebnisse für den vollständigen Assay, einschließlich Analyse und statistischer Interpretation, die in drei Wochen erzielt wurden. Wir hoffen, dass dieses Protokoll Forschern helfen kann, Experten bei der Erzeugung von Zebrafisch-Xenografts zu werden. Es ist nicht einfach; Sie müssen üben, aber Sie werden es erreichen. Viel Glück!

Zebrafische (Danio rerio) entwickeln sich zu einem mächtigen Wirbeltiermodell, um Entwicklung und Krankheit zu untersuchen. Zebrafish hat hochkonservierte genetische Merkmale (70 % genetische Homologie und 84 % krankheitsbedingte Gene) und grundlegende organmorphologische Merkmale mit dem Menschen1,2. Diese Konservierung ermöglicht die Verwendung von Zebrafischen, um mehrere menschliche Krankheiten zu modellieren, einschließlich Krebs3,4.
Die Handhabung und Wartung von Zebrafischen ist viel einfacher und kostengünstiger als Mäuse aufgrund ihrer geringen Größe, hohe Fruchtbarkeit das ganze Jahr über und externe Düngung3,5. Zebrafisch-Embryonen benötigen keine live-Fütterung während ihrer ersten 5-7 Tage des Lebens und wurden als effektives Modell für Entwicklung, Infektion und Krebsverwendet 1,4,6,7. Zebrafisch-Embryonen schlüpfen 48 Stunden nach der Befruchtung (hpf) und sind freischwimmende Tiere mit allen Organen gebildet, ein schlagendes Herz und funktionelles Kreislaufsystem, Leber, Gehirn, Nierenmark, etc.1,3. Auch in diesem Stadium der Entwicklung ist nur angeborene Immunität im Spiel, adaptive Immunität ist immer noch entwicklung, so dass eine allgemeine effiziente Transplantation von menschlichen Zellen ohne Notwendigkeit für die Verwendung von immungeschwächten Mutanten7,8. Dennoch ist es wichtig zu beachten, dass nicht alle menschlichen Zellen gleich9 engraft werden und dassz.B.bei Leukämiezellen gezeigt wurde, dass Phagozyten (Neutrophile und Makrophagen) für eine effiziente Engraftmentierung erschöpft werden müssen 10 .
Die genetische Traktionsfähigkeit des Zebrafischs und die optische Transparenz seiner frühen embryonalen Stadien ermöglichen eine intravitale Einzelzellbildgebung mit hoher Auflösung und damit die Etablierung modernster Bildgebungstechniken in verschiedenen Bereichen der Biologie. Darüber hinaus sind diese Merkmale im Zusammenhang mit Krebs nützlich für Echtzeitstudien der frühesten Stadien von Wirtstumor-Wechselwirkungen, wie die Untersuchung des angiogenen und metastasierenden Potenzials, sowie Interaktionen mit dem angeborenen Immunsystem8,9,11,12,13.
Obwohl im kurzen Xenograft-Test keine Zeit für metastasierende "Evolution" bleibt- ist es möglich, die metastasierende Kapazität der Tumorzellen zu analysieren (d.h. ihre Effizienz, durch metastasierende Schritte wie Invasion, Intravasation, Überleben im Kreislauf, Extravasation und Kolonisation zu gehen und daher diese Prozesse in vivo und in Echtzeit8,11,13,14)zu untersuchen.
Die Eigenschaften seines Lebenszyklus stellen den Zebrafisch als einzigartiges Modell für die personalisierte Medizin bei Krebs. Assays können in einer kürzeren Zeitspanne durchgeführt werden und Ergebnisse erhalten in ein paar Wochen7,8,9,11,12,15,16. Die Höhe und Durchführbarkeit dieser Assays bieten Ärzten und Forschern die Möglichkeit, translationale Ergebnisse zu erhalten, die für Krebspatienten nützlich sein können, für die Zeit ein wesentliches Bedürfnis ist.
Trotz der zunehmenden Versuche, erfolgreiche Zebrafisch-Embryo-Xenografts zu erzeugen, besteht nach wie vor Bedarf an der Standardisierung des Injektionsverfahrens sowie der Bewertung der Zelllebensfähigkeit und des Tumorverhaltens nach der Injektion.
In diesem Protokoll bieten wir Forschern eine klare und detaillierte Schritt-für-Schritt-Anleitung für die Injektion menschlicher Krebszelllinien in Zebrafischembryonen und anschließende Fixierung, Immunostainierung, Bildgebung und Quantifizierung des Tumorzellverhaltens.

<table><tbody><tr><td>Agar für die Bakteriologie</td><td>VWR</td><td>97064-336</td><td>Agarplatte</td></tr><tr><td>anti-Caspase3Asp175 (Kaninchen monoklonal)</td><td>Cell Signalling Technologies</td><td>9661</td><td>Primärer Antikörper für die Ganzmount-Immunfärbung (Verdünnung 1:100)</td></tr><tr><td>Anti-Human-HLA (Kaninchen monoklonal)</td><td>Abcam EP1395Y</td><td>ab52922</td><td>Primärer Antikörper für die Ganzmount-Immunfärbung (Verdünnung 1:100)</td></tr><tr><td>anti- 488 (Kaninchen monoklonal)</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>35552</td><td>Sekundärantikörper für die Ganzband-Immunfärbung (Verdünnung 1:200)</td></tr><tr><td>Anti-594 (Kaninchen monoklonal)</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>35560</td><td>Sekundärer Antikörper für die Ganzkaliber-Immunfärbung (Verdünnung 1:200)</td></tr><tr><td>CellTracker Deep Red Farbstoff</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>C34565</td><td>Lipophiler Farbstoff (Verdünnung 1:1000)</td></tr><tr><td>CellTracker Grüner CMFDA-Farbstoff</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>C2925</td><td>Lipophiler Farbstoff (Verdünnung 1:1000)</td></tr><tr><td>Konisches Zentrifugenröhrchen 50 mL</td><td>VWR</td><td>525-0610</td><td></td></tr><tr><td>Konisches Zentrifugenröhrchen 15 mL</td><td>VWR</td><td>525-0604</td><td></td></tr><tr><td>DAPI</td><td></td><td></td><td>Kern- und Chromosomen-Gegenfärbung</td></tr><tr><td>Laserbasierter Mikropipettenabzieher P-2000</td><td>Sutter-Instrument</td><td></td><td>Mikropipette Abzieher</td></tr><tr><td>Mikrozentrifugenröhrchen 1,5 mL</td><td>Abdos</td><td>P10202</td><td></td></tr><tr><td>Objektträger, Schnittkante</td><td>RS Frankreich</td><td>BPB016</td><td>Objektträger zur Montage</td></tr><tr><td>Mowiol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>81381</td><td>Eindeckmedium</td></tr><tr><td>Pneumatische Picopump</td><td>World Precision Instruments</td><td>PV820</td><td>Mikroinjektor</td></tr><tr><td>Rechteckige Deckgläser, Menzel Gl&auml; </td><td>ser ThermoFisher Scientific</td><td>631-9430</td><td>Deckgläser zur Montage</td></tr><tr><td>SeaKem LE Agarose</td><td>Lonza</td><td>50004</td><td>Agarplatte</td></tr><tr><td>Dünnwandige Glaskapillaren</td><td>World Precision Instruments</td><td>TW100-4</td><td>Borosilikatkapillaren</td></tr><tr><td>TrypLE</td><td>Gibco</td><td>12605036</td><td>Enzymatische Ablöselösung</td></tr><tr><td>Vaseline</td><td></td><td></td><td>Vaseline Vaseline für Objektträger Versiegelung</td></tr><tr><td>Vybrant CM-DiI Farbstoff</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>V22888</td><td>Lipophiler Farbstoff (Verdünnung 1:1000)</td></tr><tr><td>Vybrant DiO Zellmarkierungslösung</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>V22886</td><td>Lipophiler Farbstoff (Verdünnung 1:1000)</td></tr><tr><td>ZEISS Axio Zoom.V16 für Biologie</td><td>ZEISS</td><td></td><td>&nbsp; Fluoreszenz-Stereo-Zoom-Mikroskop</td></tr><tr><td>Zeiss LSM 710</td><td>ZEISS</td><td></td><td>Konfokales Mikroskop</td></tr></tbody></table>

generation von zebrafischen larval xenografts und tumorverhaltensanalyse

Generation of Zebrafish Larval Xenografts and Tumor Behavior Analysis

Zebrafisch Larven Xenografts sind weit verbreitet für die Krebsforschung verwendet, um in vivo und Echtzeit-Studien über menschlichen Krebs durchzuführen. Die Möglichkeit, die Reaktion auf Krebstherapien (Chemo, Strahlentherapie und BiologischeS), Angiogenese und Metastasen mit einzelliger Auflösung schnell zu visualisieren, stellt das Zebrafisch-Xenograft-Modell als Top-Wahl für die Entwicklung präklinischer Studien.

Der Zebrafisch Larven-Xenograft-Assay bietet mehrere experimentelle Vorteile im Vergleich zu anderen Modellen, aber wahrscheinlich ist der auffälligste die Reduzierung der Größe Skala und folglich Zeit. Diese Reduzierung der Skala ermöglicht einzellige Bildgebung, die Verwendung einer relativ geringen Anzahl von menschlichen Zellen (kompatibel mit Biopsien), mittel-hohen Durchsatz-Arzneimittel-Screenings, aber vor allem ermöglicht eine signifikante Verkürzung der Zeit des Assays. All diese Vorteile machen den Zebrafisch Xenograft Assay extrem attraktiv für zukünftige personalisierte Medizinanwendungen.

Viele Zebrafisch Xenograft Protokolle wurden mit einer großen Vielfalt von menschlichen Tumoren entwickelt; Ein allgemeines und standardisiertes Protokoll zur effizienten Erzeugung von Zebrafischlarven-Xenografts fehlt jedoch noch. Hier bieten wir ein Schritt-für-Schritt-Protokoll mit Tipps zur Generierung von Xenografts und Richtlinien für die Tumorverhaltensanalyse, die Immunfluoreszenz mit vollwertigen Modulen und die konfokale Bildgebungsquantifizierung.

Hier bieten wir ein Schritt-für-Schritt-Protokoll mit Tipps zur Generierung von Xenografts und Richtlinien für die Tumorverhaltensanalyse, die Immunfluoreszenz mit voller Montätralisierung und die konfokale Bildgebungsquantifizierung.

Generation von Zebrafischen Larval Xenografts und Tumorverhaltensanalyse

Zebrafish larval xenografts are being widely used for cancer research to perform in vivo and real-time studies of human cancer. The possibility of rapidly ...

Zebrafisch Xenografts sind weit verbreitet für die Krebsforschung verwendet. Sie können menschliche Tumorzellen nehmen und in kleine Larven Zebrafische injizieren, oder sogar in Erwachsene. Hier stellen wir ein Schritt-für-Schritt-Protokoll des Larvenmodells vor, in dem wir mehrere menschliche Krebsmerkmale bei einem lebenden Tier untersuchen können.Sie können Proliferation studieren, Sie können Angiogenese studieren, Sie können Metastasen und auch Wechselwirkungen innerhalb der Tumormikroumgebung untersuchen. Und ein großer Vorteil ist, dass Sie dies in einem sehr kurzen Zeitrahmen studieren können. Nur vier Tage zum Beispiel.Ein weiterer großer Vorteil ist, dass Sie dies live mit Einzelzellauflösung mit einem konfokalen oder einem Lichtbogenmikroskop studieren können. Sie können untersuchen, wie Zellen migrieren, wie Zellen miteinander interagieren oder sogar, wie sie miteinander sprechen. Es ist also ein wirklich mächtiges Modell, um Krebsbiologie zu studieren.Zebrafish Xenografts können verwendet werden, um Die Reaktion auf Anti-Krebs-Therapien zu studieren, wie Chemotherapie, Strahlentherapie, oder sogar gezielte Therapien mit Antikörpern. Und schließlich kann dieses Protokoll auch angepasst werden, um patientenabgeleitete Zellen aus einer chirurgischen Probe oder sogar aus Biopsien zu verwenden und dann die Zebrafisch-Avatare zu generieren. Einrichten der Injektion.Zwei Wochen vor der Injektion, erweitern Sie die Zellen in der Kultur. Beginnen Sie mit überschüssigen Zellen und überschüssigen Fischen, bis sie mit der Technik in Die Hand genommen werden, da viele Zellen und Fische während des Trainings verloren gehen. Tabelle 1 der begleitenden PDF-Datei enthält eine detaillierte Anleitung zu den optimalen Prozentsätzen des in-vitro-Konfluences zur Injektion mehrerer Zelllinien.Drei Tage vor der Injektion, überqueren Sie die Zebrafische des gewünschten Hintergrunds. 24 Stunden vor der Injektion. Reinigen Sie die Zebrafisch-Embryoplatten.Entsorgen Sie alle toten und nicht entwickelten Embryonen und erfrischen Sie E3-Medium. Entsorgen Sie im Zellenkulturraum das Zellkulturmedium. Einmal mit PBS 1X waschen, um die abgestorbenen Zellen zu entfernen und frisches Medium hinzuzufügen.Bereiten Sie die Werkzeuge für das Injektionsverfahren vor, wie Mikroinjektionsnadeln, Agaroseplatten und Haarnadeln, um die Embryonen für die Injektion auszurichten. Für die Plattenzubereitung eine Schicht gelöster 2%Agarose in den Deckel einer sauberen Petrischale geben. Lassen Sie es polymerisieren und mit Hilfe eines Lineals, machen drei bis vier gerade Agarose Linien für die Ausrichtung der Embryonen.Injektionstag. Trennen Sie die geschlüpften Embryonen von ungeschlüpften Eiern. Das Hinzufügen von Pronase zum Embryomedium in diesem Stadium kann das Schlüpfen ankurbeln.Legen Sie die Embryonen bis zur Injektion bei 28 Grad Celsius in den Inkubator. Zellbeschriftung zur Injektion. Um bei der Erstellung einer reproduzierbaren Zelletikettierungstechnik zu helfen, überprüfen Sie die Tabellen eins und zwei des geschriebenen Protokolls auf eine Zusammenstellung einer Liste von Zelllinien und mehreren Etikettierungslösungen.Entfernen Sie das Zellkulturmedium und waschen Sie den Kolben zweimal mit PBS 1X. Beschriften Sie die Zellen mit einem lipophilen Farbstoff, vermeiden Sie die Exposition gegenüber Licht, und bebrüten Sie den Kolben bei 37 Grad. Sie können die Zellen auch nach ablösender Ablösung in einem 1,5 ml Mikrozentrifugenrohr beschriften.Entfernen Sie die Zellbeschriftungslösung und waschen Sie die Zellen mit PBS 1X, um den überschüssigen Farbstoff herauszunehmen. Fügen Sie das entsprechende Trennmittel hinzu, und brüten Sie die Zellen bei 37 Grad Celsius. Erleichtern Sie den Ablösungsprozess, indem Sie den Kolben mit einem sterilen Zellschaber bürsten und die Zellen mit einer serologischen Pipette sammeln.Übertragen Sie die Zellen in 1,5 ml Mikrozentrifugenröhrchen und Zentrifuge. Überstand entsorgen und das Pellet mit Zellkulturmedium wieder aufhängen. Quantifizieren Sie die Zelllebensfähigkeit mit einer Neubauer-Kammer mit Trypan-Blau-Ausschluss oder einer anderen Methode der Wahl.Zentrifuge und re-suspendieren die Zellen im Injektionsmedium. Die empfohlenen Konzentrationen von Zellen im Medium finden Sie in Tabelle 1 des Manuskripts. Von diesem Zeitpunkt an müssen die Zellen auf Eis gehalten werden.Injektionsverfahren. Anästhetisieren Sie die Embryonen in Tricain 1X für 5 Minuten. Dann übertragen Sie eine kleine Menge anästhesierter Embryonen auf eine Agaroseplatte und richten Sie sie mit Hilfe einer Haarnadelschlaufe aus.Achten Sie darauf, den Abstand zwischen den Embryonen zu halten. Vor allem zwischen dem Eigelb eines und dem Kopf des nächsten. Um die Sterblichkeit zu vermeiden, stellen Sie sicher, dass die ausgerichteten Embryonen nicht in der Agaroseplatte austrocknen, indem Sie der Platte sorgfältig einen bis drei Tropfen Tricain 1X-Lösung hinzufügen.Tippen Sie leicht auf das Mikrozentrifugenrohr, um die Zellen wieder aufzuhängen. Laden Sie die Injektionsnadel mit einer Zellsuspension mit einer Microloader-Spitze zurück, um Luftblasen zu vermeiden, da sie die Integrität der Embryonen beeinträchtigen können. Öffnen Sie das Luftdruckventil, richten Sie den Mikroinjektor ein und legen Sie die Mikroinjektionsnadel vorsichtig in den Halter.Schneiden Sie die Mikroinjektionsnadel in der Nähe der Spitze. Durchbohren Sie vorsichtig das Eigelb des Embryos, senken Sie den Winkel der Nadel und drücken Sie vorsichtig, bis die Spitze der Nadel den Perivitelline-Raum erreicht. Sobald sich die Spitze im Perivitelline-Raum befindet, injizieren Sie die Zellen.Versuchen Sie, ein Volumen von Zellen ähnlich der Größe des Embryos Auge zu injizieren, und so weit wie möglich aus dem Herzen, um Herzödem zu verhindern. Passen Sie bei Bedarf den Mikroinjektordruck an. Übertragen Sie die injizierten Embryonen in eine saubere Petrischale mit Tricain 1X Lösung und lassen Sie sie für fünf bis 10 Minuten ruhen.Dies wird der Wunde Zeit geben, zu schließen. Entfernen Sie die Tricain 1X Lösung und fügen Sie frisches E3 Medium hinzu. Dann inkubieren Sie die Embryonen bei 34 Grad Celsius.Diese Temperatur ermöglicht das Überleben sowohl der Zebrafisch-Embryonen als auch der menschlichen Tumorzellen. Metastasierender Assay. Wenn Sie das metastasierende Potenzial Ihrer Zelllinien untersuchen möchten, werden die injizierten Embryonen nach der Injektion nach etwa einer Stunde auf einem Fluoreszenz-Stereomikroskop untersucht und entsprechend dem Fehlen oder Vorhandensein von Krebszellen im Kreislauf in zwei Gruppen sortiert.Ein Tag nach der Injektion. Analysieren Sie auf einem Fluoreszenz-Stereomikroskop jeden Embryo sorgfältig und wählen Sie diejenigen mit richtig injizierten Tumoren aus. Sortieren Sie die ausgewählten Xenografts nach der Tumorgröße.Verwenden Sie die Größe des Auges zum Vergleich. Entsorgen Sie Embryonen mit abnormaler Morphologie, Herz- oder Eigelbödem, Xenografts mit sehr wenigen Krebszellen oder Embryonen mit Krebszellen nur im Eigelb. Verteilen Sie die Xenografts nach dem gewünschten experimentellen Layout und starten Sie den Arzneimitteltest.Ersetzen Sie die Medikamente und E3 Medium täglich. Inkubieren Sie die Xenografts, wobei die Temperatur von 34 Grad Celsius bis zum Ende des Assays beibehalten wird. Vier Tage nach der Injektion.Am letzten Tag des Assays die Xenografts mit Tricain 1X Lösung anästheisieren und sorgfältig auf der Agarplatte ausrichten. Entsorgen Sie alle toten oder geschwollenen Xenografts. Diese Xenografts werden nicht für die Transplantationsquantifizierung berücksichtigt.Analysieren Sie auf einem Fluoreszenz-Stereomikroskop sorgfältig jedes Xenograft und bewerten Sie das Fehlen oder Vorhandensein von Tumoren im Perivitelline-Raum. Nach dem experimentellen Setup, wählen Sie die Xenografts von Interesse und einschläfern sie mit Tricain 25X. Fixieren Sie sie in 4%Formaldehyd für mindestens 4 Stunden bei Raumtemperatur, um mit der Immunfärbung fortzufahren.Ansonsten über Nacht bei vier Grad Celsius lagern und am nächsten Tag Formaldehyd durch 100% Methanol ersetzen. Xenografts, die in 100% Methanol fixiert sind, können bei 20 Grad unbegrenzt gelagert werden. Ganzer Mount Immunostaining für konfokale Bildgebung.Die gesamte Mount-Immunfluoreszenz-Technik dauert drei Tage, wie folgt aufgeteilt. Der erste Tag ist für die Permeabilisierung der Xenografts und primäre Antikörper-Inkubation. Am zweiten Tag zum Waschen und sekundären Antikörperinkubation.Und am dritten Tag, zum Waschen, Fixieren von Xenotransplantaten und Lagerung im Montagemedium. Weitere Informationen zu diesem Verfahren finden Sie im begleitenden PDF. Montage von Xenografts.Versiegeln Sie die Ränder eines Deckelschlupfes mit Petroleumgelee oder Silikonfett, damit das Montagemedium nicht austritt. Übertragen Sie die Xenografts mit einer Pasteur-Pipette auf den Deckbeleg. Richten Sie sie vorsichtig mit einer Haarnadel aus.Fügen Sie das Montagemedium zu einem anderen Deckbeleg hinzu. Verbinden Sie vorsichtig beide Deckschlipsundungen und legen Sie sie auf ein Mikroskopschlitten, um eine einfachere Manipulation zu ermöglichen. Konfokale Bildgebung.Eine apochromatische 25-fache Tauchobjektivlinse mit Wasserkorrektur ist optimal für bildgebende Tumoren mit einer Einzelzellauflösung. Erfassen Sie die Proben mit der Z-Stack-Funktion mit einem Intervall von fünf Mikrometern zwischen jedem Slice. Öffnen Sie die Rohdaten in Fidschi-Software.Wählen Sie drei repräsentative Scheiben des Tumors von oben, Mitte und Unten, pro Z-Stack, pro Xenograft. Öffnen Sie das Cell Counter Plugin von Fidschi-Software. Klicken Sie im Werkzeug Zellenzähler auf Initialisieren, wählen Sie einen Zählertyp aus, und klicken Sie auf das Bild, um den Zählmodus manuell zu starten.Bei jedem Klick fragt der Zähler, wie viele Zellen gezählt werden. Verwenden Sie die folgende Formel, um die Gesamtzahl der Zellen im Tumor zu erhalten. Um die Gesamtzahl oder den Prozentsatz der Marker, wie ZB-Immunzellen, mitotische Zahlen, aktivierte Caspase, zu bewerten, quantifizieren Sie unter anderem manuell die Zellen, die positiv auf die spezifische Beschriftung, Markierung oder Transgene von Interesse entlang aller Segmente des Z-Stacks mit dem Cell Counter Plugin sind.Beachten Sie, dass sich einige Zellen zwischen zwei Slices befinden. Gehen Sie im Z-Stack hin und her, um sicherzustellen, dass keine Zelle zweimal gezählt wird. Repräsentative Ergebnisse.HCT 116 Darmkrebszelllinien-Xenografts wurden wie im Protokoll beschrieben erzeugt. Xenografts wurden nach dem Zufallsprinzip in nicht behandelten Kontrollen und FOLFIRI Chemotherapie verteilt. Immunfluoreszenz wurde durchgeführt, um apoptotische Zellen zu detektieren, mit Anti-Cleaved Caspase-3-Antikörper und DAPI für nukleinige Gegenfärbung.Quantifizierung des mitotischen Index, Apoptose, und Tumorgröße, zeigte, dass FOLFIRI induziert eine signifikante Abnahme der Mitose und eine signifikante Induktion der Apoptose, begleitet von einer 54%igen Verringerung der Tumorgröße. Diese Eigenschaften sind nützlich in Hochdurchsatz phänotisch Drogen-Screens, sowie die Zelle intrinsische und physiologische Effekte von mehreren Krebsbehandlungen in einem kurzen Zeitrahmen zu testen. Ein weiterer großer Vorteil des Zebrafisch-Xenograft-Modells ist, dass es möglich ist, die Wechselwirkungen verschiedener Tumorzellen zu untersuchen und zu analysieren, wie jede Art von Zelle das Verhalten der anderen beeinflussen kann.Verschiedene menschliche Krebszellen, verschiedene Klone aus demselben Tumor oder aus verschiedenen Tumoren können mitinjiziert werden. In diesem Beispiel wurden zwei von demselben Patienten abgeleitete Darmkrebszelllinien mit unterschiedlichen lipophilen Farbstoffen beschriftet und in einem Verhältnis von eins zu eins zur Injektion gemischt. Wir hoffen, dass dieses Protokoll Forschern helfen kann, echte Experten bei der Erzeugung von Zebrafisch-Xenografts zu werden.Es ist nicht leicht. Sie müssen üben, üben. Gib nicht auf.Ich bin sicher, dass Sie es erreichen werden. Viel Glück.

generation-of-zebrafish-larval-xenografts-and-tumor-behavior-analysis

Research

Forschung

JoVE Journal

Cancer Research

Krebsforschung

Dieses Video beschreibt die Technik zur Erstellung eines von Zebrafisch-Patienten abgeleiteten Xenotransplantat-Modells. Im Probenprotokoll beurteilen wir die Wirksamkeit der Medikamente Gemcitabin und Navitoclax am Xenotransplantatmodell des Pankreastumors.

Zebrafisch-Xenotransplantat (zPDX): Ein Krebsmodell

Dieses Video beschreibt eine Mikroinjektionsmethode für die Verabreichung von Brustkrebszellen in den perivitellinischen Raum von transgenen Zebrafischembryonen. Nach der Inkubation visualisieren wir den Embryo unter einem Fluoreszenzmikroskop, um die Invasion, Verbreitung und Metastasierung von Krebszellen zu beobachten.

zPDX-Analyse der Invasivität: Untersuchung des invasiven Verhaltens von metastasierten Krebszellen in Zebrafischembryonen Xenotransplantaten

Dieses Video beschreibt den Zebrafisch-Xenotransplantat-Assay zur Beurteilung der in vivo Tumorbildung und zur Untersuchung der Wirkung von Therapeutika.

Zebrafisch-Xenotransplantat-Assay: Eine Methode zur Bewertung der krebshemmenden Wirksamkeit von Therapeutika auf die Tumorigenität bei Zebrafischen in vivo

Die Transplantation von Krebszellen ist ein wichtiges Instrument zur Identifizierung von Krebsmechanismen und therapeutischen Reaktionen. Aktuelle Techniken hängen von immune-inkompetenten Tieren ab. Hier beschreiben wir eine Methode zur Transplantation von Zebrafisch-Tumorzellen in immunkompetenten Embryonen zur Langzeitanalyse des Tumorzellverhaltens und in vivo- Arzneimittelwirkungen.

Transplantation von Zebrafisch-pädiatrischen Hirntumoren in immune-kompetente Wirte für die Langzeitstudie von Tumorzellverhalten und Drug Response

Dieses Protokoll beschreibt Optimierungsverfahren in einem virusbasierten Dual-Fluoreszenz-markierten Tumor-Xenograft-Modell unter Verwendung von Larvenzebrafischen als Wirte. Dieses heterogene Xenograft-Modell imitiert die Gewebezusammensetzung der Mikroumgebung von Bauchspeicheldrüsenkrebs in vivo und dient als präziseres Werkzeug zur Beurteilung von Arzneimittelreaktionen in personalisierten zPDX-Modellen (Zebrafish Patient-derived xenograft).

Patientenabgeleitetes heterogenes Xenograft-Modell von Bauchspeicheldrüsenkrebs mit Zebrafischlarven als Wirte für vergleichende Arzneimittelbewertung

Ziel dieser Methode ist es, ein In-vivo-Modell der Tumorangiogenese zu generieren, indem Säugetiertumorzellen in einen Zebrafisch-Embryo mit fluoreszierend gekennzeichneten Blutgefäßen gexlüftet werden. Durch die Abbildung des Xenografts und der zugehörigen Gefäße kann eine quantitative Messung der angiogenen Reaktion erreicht werden.

In Vivo Bildgebung und Quantifizierung der Angiogenreaktion des Wirts bei Zebrafischtumor Xenografts

Zebrafish Xenograft-Modelle ermöglichen ein hochdurchsatziges Arzneimittelscreening und eine fluoreszierende Bildgebung menschlicher Krebszellen in einer in vivo Mikroumgebung. Wir haben einen Workflow für großangelegte, automatisierte Arzneimitteluntersuchungen an von Patienten abgeleiteten Leukämieproben in Zebrafischen mit hilfe einer automatisierten Fluoreszenzmikroskop-Bildgebungseinheit entwickelt.

Arzneimittel-Screening von Primärpatienten abgeleitetTumor Xenografts in Zebrafischen

Präklinische Modelle zielen darauf ab, das Wissen über die Krebsbiologie zu erweitern und die Wirksamkeit der Behandlung vorherzusagen. Diese Arbeit beschreibt die Erzeugung von zebrafischbasierten patientenabgeleiteten Xenotransplantaten (zPDXs) mit Tumorgewebefragmenten. Die zPDXs wurden mit einer Chemotherapie behandelt, deren therapeutischer Effekt anhand der Zellapoptose des transplantierten Gewebes beurteilt wurde.

Etablierung von Zebrafisch-Xenotransplantaten aus Bauchspeicheldrüsenkrebs für Chemosensitivitätstests

Wir beschreiben ein Protokoll für die Xenotransplantation in das Eigelb von transparenten Zebrafischembryonen, das durch eine einfache, schnelle Staging-Methode optimiert wird. Die Analysen nach der Injektion umfassen das Überleben und die Beurteilung der Krankheitslast von xenotransplantierten Zellen durch Durchflusszytometrie.

Eine einfache, schnelle und effektive Methode zur Analyse der Tumor-Xenotransplantation in transparenten Zebrafischembryonen

Hier stellen wir ein detailliertes Protokoll für die automatisierte Implantation von Tumor-Xenotransplantaten in Zebrafischlarven mit Hilfe eines hochmodernen robotergestützten Injektionssystems vor. Darüber hinaus präsentieren wir Injektionsvideos und Validierungsdaten, die die erfolgreiche Leistung des Systems belegen.

Automatisierung der Tumorimplantation in Zebrafischlarven für Krebsforschung und Medizin

Erfahren Sie die standardisierte Methode zur Erzeugung von Zebrafisch-Larven-Xenotransplantaten mit menschlichen Tumorzellen. Dieses Protokoll ermöglicht die Analyse von Tumorverhalten, Angiogenese und Metastasierung in vivo mit Einzelzellauflösung für Krebsforschung.

Generation von Zebrafischen Larval Xenografts und Tumorverhaltensanalyse

Weitere Videos entdecken