Swabbing the Urban Environment - Eine Pipeline zur Probenahme und zum Nachweis von SARS-CoV-2 aus Umweltreservoirs
9. April 2021
Ein Citizen-Science-Projekt wurde entwickelt, um Einwohner von San Diego zu rekrutieren, um Umweltproben für SARS-CoV-2 zu sammeln. Für die Datenübermittlung über eine benutzerfreundliche Oberfläche für mobile Geräte wurde eine mehrsprachige webbasierte Plattform geschaffen. Ein Laborinformationsmanagementsystem erleichterte die Entnahme von Tausenden von geografisch unterschiedlichen Proben mit Echtzeit-Ergebnisverfolgung.
Diese Studie stellt einen neuartigen Workflow zum Nachweis von SARS-CoV-2 auf Oberflächen vor, die in der städtischen Umgebung selten gereinigt werden, wie z. B. Zapfsäulengriffe, Spielplätze und Geldautomaten. In einer Pandemie sind die Vorräte knapp. Wir verwenden leicht erhältliche Materialien und Reagenzien und Geräte, die in grundlegenden Laborumgebungen verfügbar sind.
Wir verwenden eine Extraktionsmethode, die die RNA ohne Kühlkette konserviert, und eine Nachweismethode, die gegen Inhibitoren resistent ist. Dieses Protokoll ist von Interesse für die öffentliche Gesundheit. Es bietet einen Rahmen für die Bewertung von umweltbedingten Virusreservoirs für die aktuelle COVID-19-Pandemie und andere Infektionserreger bei zukünftigen globalen Ausbrüchen.
Rekrutieren Sie Citizen Scientists mit einem direkten und klaren Aufruf zum Handeln, der über lokale und soziale Medien veröffentlicht wird. Erstellen Sie ein Social-Media-Handle, um das Thema über Social-Media-Inhalte hinweg zu verbinden. Erstellen Sie einen Link zum SMP und stellen Sie ein mehrsprachiges Plug-In bereit, um einzelpersonen die Navigation in mehreren Sprachen zu ermöglichen, indem sie Fragen zur biologischen Sicherheit beantworten, die in einem Online-Formular angegeben sind.
Fügen Sie im Sampling-Abschnitt grafische und audiovisuelle Protokolle in Englisch und Spanisch ein. Visualisieren Sie Geodaten mithilfe einer Geodaten-Anwendungsprogrammierschnittstelle, die von einem Cloud-Computerdienstanbieter unterstützt wird. Speichern Sie die über das SMP an das LIMS übermittelten Daten, um die zentrale Speicherung, die Verfolgung von Verarbeitungsworkflows und die Verwaltung der Logistik zu erleichtern.
Laden Sie Informationen wie Sample Kit ID, Sample ID, Datum, Uhrzeit und Koordinaten des globalen Positionierungssystems vor, um die Datentypkonformität zu ermöglichen und den Fehler zu minimieren. Fügen Sie einen Link zur Musterabholungsanforderung für die Teilnehmer ein, den sie verwenden können, sobald sie alle Proben gesammelt haben. Erstellen Sie ein Kit, das alle Probenahmematerialien enthält, einschließlich der erforderlichen persönlichen Schutzausrüstung wie Maske und Handschuhe, eines Probenahmeprotokolls und für die biologische Sicherheit relevanter Informationen.
Tupfer desinfizierte selten Oberflächen in Haushalten und der städtischen Umgebung, indem ein ein Zentimeter quadratisch polyesterabsorbierender Tupfer mit einem Reinigungsmittel benetzt und eine Oberfläche von 10 Zentimetern im Quadrat abgetupfert wurde. Tauchen Sie mit Hilfe eines Zahnstochers jeden Probentupfer in das vormarkierte Röhrchen mit 200 Mikrolitern Guanidiniumthiocyanat. Tragen Sie die mitgelieferte Maske und ein neues Paar Handschuhe für die Entnahme jeder Probe, um Kreuzkontaminationen zu vermeiden.
Nachdem Sie die Probenahme abgeschlossen haben, verwenden Sie das mitgelieferte Händedesinfektionsmittel. Lagern Sie die Röhrchen bei vier Grad Celsius, bis sie ins Labor transportiert werden. Sobald die Proben im Labor angekommen sind, lagern Sie sie bei minus 80 Grad Celsius.
Um die Geschwindigkeit des Screenings zu erhöhen, verarbeiten Sie die Proben in Pools. Wenn ein Pool positiv ist, extrahieren Sie die RNA jeder Probe unabhängig voneinander. Kombinieren Sie die Proben aus jedem Probenahmekit zu zwei Pools, indem Sie 50 Mikroliter jeder der acht Proben in einem Mikrozentrifugenröhrchen zusammenfassen und die verbleibenden Proben bei minus 80 Grad Celsius speichern.
Fügen Sie 80 Mikroliter Chloroform und Wirbel für 15 Sekunden hinzu. Anschließend 20 Minuten bei vier Grad Celsius inkubieren. Zentrifuge bei 13.000 mal G für 20 Minuten bei vier Grad Celsius.
Die wässrige Schicht in ein neues Mikrozentrifugenröhrchen überführen. Bewahren Sie die restliche Schnittstelle und die rosa Flüssigkeit im minus 80 Grad Celsius warmen Gefrierschrank auf. Diese Fraktionen enthalten DNA und Proteine.
Extrahieren Sie RNA aus der wiederhergestellten wässrigen Schicht mit einem Guanidiniumthiocyanat-basierten RNA-Rohextraktionsprotokoll. Bereiten Sie die RT-LAMP-Reaktionsmischung bei Raumtemperatur mit 10% Übervolumen vor, um den Pipettierverlust zu berücksichtigen. Fügen Sie der Probenreaktion fünf Mikroliter RNA und der Spiked-Reaktion fünf Mikroliter RNA plus 2,5 Mikroliter synthetische SARS-CoV-2-RNA hinzu.
Fügen Sie 2,5 Mikroliter synthetische SARS-CoV-2-RNA zur Positivkontrolle und fünf Mikroliter Wasser zur Negativkontrolle hinzu. Mischen Sie gut und drehen Sie die Reaktionen herunter. Für die kolorimetrische Beobachtung wird ein negatives Ergebnis durch Rosa und ein positives Ergebnis durch Gelb angezeigt.
Führen Sie nach RT-LAMP eine Gelelektrophorese durch. Die Verteilung der Beispielsammelstellen ist hier dargestellt. Ein Großteil der Kits war vollständig und die entsprechenden Daten wurden in das LIMS hochgeladen.
Die Nachweisgrenze bei einer Frequenz von 100% betrug 500 Kopien pro 25 Mikroliter Reaktion. Im kolorimetrischen RT-LAMP änderten positive Proben aufgrund einer pH-Verschiebung von acht auf 5,5 die Farbe von rosa zu gelb. Bei niedrigen Kopienzahlen wurden Proben auf einem Agarosegel durchgeführt, um die Positiven mit dem resultierenden leiterartigen Muster zu bestätigen.
RT QPCR-Methoden wurden mit Umweltproben getestet. Alle Master-Mischungen waren empfindlich gegenüber Inhibitoren bei niedrigen Kopienzahlkonzentrationen der Positivkontrolle. Bei niedrigen Konzentrationen der Vorlage zeigten traditionelle RT-PCR-Methoden falsch positive und falsch negative Ergebnisse.
Schließlich erkannte eine Technik namens Rollkreisverstärkung kleine Mengen der Zielsequenz. Es zeigte jedoch eine Amplifikation der Sonde in Abwesenheit einer RNA-Vorlage. Es ist wichtig, einen Aufruf zum Handeln zu veröffentlichen, der alle Sektoren der Gemeinschaft erreicht, so dass die Stichprobe wirklich das Risiko der Exposition aller Mitglieder dieser Gemeinschaft darstellt.
Dieses Framework detektiert SARS-CoV-2 genetisches Material. Studien zum Testen der viralen Lebensfähigkeit sind der nächste Schritt.
Übersicht
In diesem Artikel wird ein auf Bürgerwissenschaft basierender Arbeitsablauf zur Detektion von SARS-CoV-2 auf selten gereinigten urbanen Oberflächen während der COVID-19-Pandemie vorgestellt. Das Protokoll nutzt leicht verfügbare Materialien und Reagenzien und ermöglicht eine umfangreiche Umweltprobennahme sowie den empfindlichen Nachweis viraler RNA, selbst unter Bedingungen eingeschränkter Verfügbarkeit von Materialien. Die Methode ist so konzipiert, dass sie robust gegenüber Hemmstoffen ist, die in Umweltproben häufig vorkommen, und kann für künftige öffentliche Gesundheitsüberwachung anderer Viren angepasst werden.
Wesentliche Studienkomponenten
Bereich der Wissenschaft
- Umweltvirologie
- Gesundheitsüberwachung
- Molekulare Diagnostik
Hintergrund
- Die Oberflächenübertragung von SARS-CoV-2 war während der COVID-19-Pandemie eine Besorgnis erregende Angelegenheit.
- Die meiste Umweltüberwachung konzentrierte sich auf Orte mit hoher Prävalenz wie Krankenhäuser und öffentliche Verkehrsmittel.
- Städtische Oberflächen, die selten gereinigt werden, können als virale Reservoire dienen.
- Versorgungsmangel während der Pandemie erforderte alternative Strategien zur Probenahme und Detektion.
Zweck der Studie
- Entwicklung und Validierung eines Workflows zum Nachweis von SARS-CoV-2 auf selten desinfizierten urbanen Oberflächen.
- Einbindung von Bürgerwissenschaftlern in großangelegte Umweltprobenahmen.
- Erstellung eines Protokolls, das robust gegenüber Lieferengpässen und Umweltinhibitoren ist.
Verwendete Methoden
- Rekrutierung von 350 Bürgerwissenschaftlern über lokale und soziale Medien mit mehrsprachiger Unterstützung.
- Verteilung von Abnahmekits, die Schutzausrüstung, Tupfer und Protokolle enthalten.
- Abstrich von 10 cm2 großen Oberflächen mithilfe mit Reinigungsmittel benetzter Polyester-Tupfer.
- Probenerhaltung in Guanidiniumthiocyanat ohne Kühlkettenanforderungen.
- Zusammenfassung von Proben zur Erstuntersuchung, gefolgt von individueller RNA-Extraktion, falls die Pools positiv getestet wurden.
- RNA-Extraktion mittels eines auf Guanidiniumthiocyanat basierenden Protokolls.
- Nachweis über farbmetrische RT-LAMP, bestätigt durch Gelelektrophorese.
- Vergleich mit RT-qPCR- und Rolling-Circle-Amplifikationsmethoden.
- Zentrales Datenmanagement unter Verwendung eines Laborinformationssystems (LIMS) und geospatialer Visualisierungswerkzeuge.
Hauptergebnisse
- Über 4.000 Proben wurden von verschiedenen urbanen Oberflächen gesammelt.
- Der RT-LAMP-Assay wies eine Nachweisgrenze von 500 Kopien pro 25 µL Reaktion mit klarem farbimetrischem Ergebnis auf.
- Das Pooling erhöhte die Screening-Effizienz; positive Pools wurden zur individuellen Analyse aufgelöst.
- Die RT-qPCR war bei geringer Kopienzahl anfällig für Inhibitoren, was zu falsch-positiven bzw. falsch-negativen Ergebnissen führte.
- Die Rolling-Circle-Amplifikation zeigte unspezifische Amplifikation in Abwesenheit einer RNA-Vorlage.
- Der Arbeitsablauf ermöglichte eine erfolgreiche Einbindung der Gemeinschaft und eine umfassende Umweltüberwachung.
Schlussfolgerungen
- Das beschriebene Protokoll ermöglicht einen empfindlichen Nachweis von SARS-CoV-2-RNA auf urbanen Oberflächen unter Verwendung leicht zugänglicher Materialien und mit Einbindung von Bürgerwissenschaftlern.
- Der Arbeitsablauf ist robust gegenüber Umweltinhibitoren und anpassbar für zukünftige Ausbrüche anderer Viren.
- Weitere Studien sind erforderlich, um die Virulenz auf nachgewiesenen Oberflächen zu bewerten.
Häufig gestellte Fragen
Aussagekräftige Bedeutung für die Industrie
Die Umweltüberwachung von viraler RNA auf urbanen Oberflächen bietet einen skalierbaren Rahmen zur Früherkennung von Übertragungsrisiken in der Bevölkerung und von Umweltreservoiren. Dieser Arbeitsablauf ermöglicht eine schnelle, verteilte Probenahme und eine zuverlässige Detektion, selbst unter Bedingungen eingeschränkter Versorgungsketten, und stärkt so das Vorhersagevertrauen in Bezug auf öffentliche Gesundheit und biopharmazeutische Forschung und Entwicklung. Der Ansatz ist anpassungsfähig für zukünftige Pathogenüberwachung und trägt zur Risikobewertung sowie zu Interventionsstrategien entlang des gesamten Spektrums von der Entdeckung bis zur Überwachung bei.
Strategische Anwendungen in der Biopharma-Forschung und -Entwicklung
Frühe Entdeckung und Zielvalidierung
- Ermöglicht eine hypothesengeleitete Bewertung von umweltbedingten viralen Reservoiren, die für die Übertragungsdynamik relevant sind.
- Unterstützt die biologische Risikominderung, indem die Präsenz und Verteilung von viraler RNA auf verschiedenen Oberflächen geklärt wird.
- Erleichtert eine vorhersagbare Zuverlässigkeit von Umweltexpositionsmodellen für infektiöse Agenten.
Screening und Assay-Entwicklung
- Bietet validierte Protokolle für den empfindlichen Nachweis von viraler RNA in komplexen Umweltmatrizes.
- Standardisiert die Probenahme und -aufbereitung für reproduzierbare, quantitative Ergebnisse in großen Kohorten.
- Zeigt die Robustheit des Assays gegenüber Inhibitoren und ermöglicht eine zuverlässige Untersuchung unter realen Bedingungen.
Translationale und präklinische Forschung
- Koppelt Umweltüberwachungsdaten mit Biomarker-Strategien der öffentlichen Gesundheit zur Ausbruchsvorbereitung.
- Ermöglicht einen nahtlosen Übergang von der Umweltüberwachung zur präklinischen Risikomodellierung und Planung von Interventionen.
- Unterstützt die risikoadjustierte Weiterentwicklung von Überwachungswerkzeugen für neu auftretende Krankheitserreger.
Pipeline- und Workflow-Integration
Dieser Arbeitsablauf verbindet Umweltprobenahme, molekulare Detektion und zentrale Datenverwaltung und positioniert sich so von der frühen Entdeckung bis hin zur translationsbasierten Überwachung.
- Entdeckungsbiologie: Unterstützt die Hypothesenprüfung zur Umweltübertragung und Reservoirkartierung.
- Screening: Ermöglicht die reproduzierbare, quantitative Detektion viraler RNA aus gepoolten und individuellen Proben.
- Analytik: Integriert geospatiale und LIMS-basierte Daten für vergleichende Analysen und Compliance.
- Translationale Forschung: Leitet die Abstimmung öffentlicher Gesundheits-Biomarker und Strategien zur Ausbruchsreaktion ab.
- Unternehmensweite Wiederverwendung: Schafft eine skalierbare, anpassungsfähige Plattform für zukünftige Pathogen-Überwachungsinitiativen.
Operative und unternehmerische Auswirkungen
- Wissenschaftlicher Wert: Erhöht die Vorhersagesicherheit bei der Bewertung von Umweltrisiken und der Validierung von Zielstrukturen.
- Operationaler Wert: Ermöglicht standardisierte, skalierbare Probenahme und Detektion unter begrenzten Ressourcen.
- Strategischer Wert: Verbessert die Entscheidungsfindung hinsichtlich Einsatz von Überwachungsmaßnahmen und Priorisierung von Interventionen.
- Portfolio-Wirkung: Unterstützt die risikoadjustierte Priorisierung der Entwicklung von Überwachungs- und Diagnosetools.
Durchführungsüberlegungen
- Erfordert Fachkenntnisse in molekulardiagnostischen Verfahren und Umweltprobenahmeprotokollen.
- Benötigt Zugang zu grundlegender Laborinfrastruktur und einem LIMS für das Datenmanagement.
- Setzt eine standardisierte Vorgehensweise über Teamgrenzen hinweg bei der Probenahme, Probenvorbereitung und Datenberichterstattung voraus.
- Kann mit minimalem Bedarf an Materialien an verschiedene städtische und kommunale Umgebungen angepasst werden.
- Die Detektion beschränkt sich auf virale RNA; Untersuchungen zur Infektiosität sind der notwendige nächste Schritt.
