Loss-of-Function-Ansatz in der embryonalen Küken-Netzhaut unter Verwendung von Tol2-Transposon-vermittelter transgener Expression künstlicher microRNAs

Diese Methodik bietet einen Loss-of-Function-Ansatz für Studien zur Netzhautentwicklung beim Küken. Diese Technik unterstützt die schnelle und anhaltende Unterdrückung von Zielgenen in einem bestimmten Bereich der Netzhaut. Dieser Ansatz kann auch auf andere Teile des Kükenembryos angewendet werden, einschließlich des neuronalen und nicht-neuronalen Gewebes.

Für die In-ovo-Elektroporation wird eine 0,25%ige Fast Green-Lösung hergestellt, indem 25 Milligramm Fast Green FCF in 10 Millilitern PBS aufgelöst und dann mit einem 0,2-Mikron-Spritzenfilter filtriert wird. Als nächstes wird die DNA-Cocktail-Injektionslösung hergestellt, indem das microRNA-Smaragd-GFP-Plasmid mit dem Tol2-Transposase-Expressionsplasmid in einem Verhältnis von zwei zu eins gemischt wird. Dann wird die vorbereitete Fast Green-Lösung im Verhältnis eins zu 10 zum DNA-Cocktail gegeben, um den injizierten Bereich sichtbar zu machen.

Als nächstes richten Sie das Mikroinjektionsgerät ein. Das Gerät besteht aus einer Hamilton-Spritze, einer 18-Gauge-Zwei-Zoll-Nadel, einem zwei Zentimeter langen Polyvinylchlorid-Schlauch und einer Mikropipettennadel. Füllen Sie die Hamilton-Spritze mit schwerem Mineralöl, befestigen Sie dann die 18-Gauge-Nadel an der Spritze und füllen Sie den Innenraum der Nadel mit Öl, indem Sie den Spritzenkolben drücken.

Befestigen Sie als Nächstes den Polyvinylchloridschlauch am Ende der Nadel und füllen Sie den Schlauch mit dem Öl. Befestigen Sie die gezogene Mikropipettennadel am Schlauch. Brechen Sie dann unter dem Präpariermikroskop mit einer feinen Pinzette die Spitze der Nadel auf einen Durchmesser von 10 bis 20 Mikrometern ab, um eine kleine Öffnung zu machen.

Füllen Sie die gesamte Nadel mit Öl. Als nächstes gibst du fünf Mikroliter des farbigen DNA-Cocktails auf eine Petrischale. Legen Sie unter dem Präpariermikroskop die Spitze der Mikropipettennadel in die DNA-Lösung auf der Petrischale und ziehen Sie die Lösung langsam in die Nadel.

Nachdem sich der Druck innerhalb und außerhalb der Nadel ausgeglichen hat, wird die Spitze der Nadel aus der DNA-Lösung genommen und bis zur Injektion in steriles PBS in einem kleinen Becherglas getaucht. Um dann die Elektroporationsapparatur einzurichten, setzen Sie ein Paar Platinelektroden mit einem Elektrodenhalter fest auf einen Mikromanipulator. Stellen Sie den Abstand zwischen den Elektrodenspitzen auf zwei Millimeter ein und verbinden Sie die Elektroden mit Kabeln mit einem Rechteckimpulsgenerator.

Als nächstes entnehmen Sie für die DNA-Mikroinjektion ein befruchtetes weißes Leghorn-Ei aus dem Inkubator und wischen die Oberfläche des Eies mit Seidenpapier ab, das mit 70%igem Ethanol getränkt ist. Befestigen Sie dann eine 18-Gauge-Nadel an einer 10-Milliliter-Spritze und führen Sie die Nadel durch das stumpfe Ende des Eies, wobei es nach unten abgewinkelt ist, um das Eigelb nicht zu beschädigen. Nachdem Sie zwei bis drei Milliliter Albumin aus dem Ei entnommen haben, verschließen Sie das Loch mit einem Stück Tesafilm und kerzen Sie das Ei mit Licht, um sicherzustellen, dass sich der Embryo und die Vitellinmembran von der Schale lösen.

Als nächstes entfernst du mit einer Pinzette ein Stück Eierschale von der Oberseite der Eizelle und legst den Embryo frei. Nicht mehr als fünf Eizellen gleichzeitig öffnen, um das Austrocknen der Embryonen während der Elektroporation zu verhindern. Führen Sie die Spitze der Nadel von ihrer proximalen Seite in einem 45-Grad-Winkel in das optische Vesikel ein und injizieren Sie den DNA-Cocktail, indem Sie den Kolben langsam drücken, bis die blau gefärbte Lösung das Lumen ausfüllt.

Ziehen Sie die Nadel zurück und setzen Sie ihre Spitze wieder in PBS ein. Stellen Sie für die Elektroporation die Impulsspannung auf 15 Volt, die Impulslänge auf 15 Millisekunden, das Impulsintervall auf 915 Millisekunden und die Impulszahl auf fünf ein. Nachdem Sie einige Tropfen HBSS auf die Vitellinmembran über dem Embryo gegeben haben, verwenden Sie den Mikromanipulator, um die Elektroden senkrecht zur vorder-posterioren Achse des Embryos in die HBSS abzusenken.

Platzieren Sie die Elektroden auf beiden Seiten des Sehvesikels und stellen Sie sicher, dass die Elektroden den Embryo oder die Blutgefäße nicht berühren, und legen Sie dann gepulste elektrische Felder an. Entfernen Sie nach Abschluss der Elektroporation die Elektroden und reinigen Sie die Elektroden vorsichtig mit einem mit Wasser getränkten, sterilen Wattestäbchen, um eine Ansammlung von Albumin zu vermeiden. Versiegeln Sie das Fenster mit Tesafilm und rekubieren Sie den Embryo bis zum gewünschten Entwicklungsstadium.

Die Transfektion einzelner prä-microRNA-Sequenzen in Nel AP exprimierende HEK293T Zellen führte zu einer signifikanten Unterdrückung der Nel-Expression durch Konstrukte gegen die Nukleotide 482 bis 502, 910 bis 930 und 2461 bis 2481. Die Verkettung von zwei microRNA-Sequenzen verbesserte die Knockdown-Effizienz signifikant. Alle drei Kombinationen zeigten eine erhöhte Suppressionsaktivität im Vergleich zu unverketteten einzelnen prä-microRNA-Sequenzen.

Eine robuste Suppression wurde mindestens 13 Tage nach der Transfektion beobachtet. Wenn ein Nel-prä-microRNA-Konstrukt, das auf die Nukleotide 482 bis 502 und 2461 bis 2481 abzielt, mit dem Transposase-Expressionsvektor in die Netzhaut der Küken transfiziert wurde, war die Nel-Expression im retinalen Pigmentepithel in smaragdgrünen GFP-exprimierenden Zellen am Embryonaltag 4.5 signifikant reduziert. In acht Tage alten Embryonen nahm die Nel-Expression auch in retinalen Ganglienzellen ab.

Im Gegensatz dazu wurde die Nel-Expression in der Netzhaut durch die Einführung von Kontroll-microRNA nicht beeinflusst. Im Anschluss an dieses Verfahren können die Auswirkungen auf die Zielgensuppression mit verschiedenen Methoden untersucht werden, wie z. B. Untersuchungen der Zellproliferation und -differenzierung, des Zelltods sowie der Zell- und Axonverfolgung.