Name: Loss-of-Function-Ansatz in der embryonalen Küken-Netzhaut unter Verwendung von Tol2-Transposon-vermittelter transgener Expression künstlicher microRNAs (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-05-18T14:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 58 s
Description: Erfahren Sie einen stabilen Loss-of-Function-Ansatz für die Netzhautentwicklung im Hühnerembryo mittels Tol2-Transposon-vermittelter künstlicher microRNA-Expression. Diese Methode ermöglicht effiziente und anhaltende Genunterdrückung.

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Die pT2K-CAGGS- und pCAGGS-T2TP-Vektoren wurden freundlicherweise von Yoshiko Takahashi (Kyoto University, Kyoto, Japan) bzw. Koichi Kawakami (National Institute of Genetics, Mishima, Japan) zur Verfügung gestellt. Wir danken Michael Berberoglu für die entscheidende Lektüre des Manuskripts. Diese Arbeit wurde durch Zuschüsse der Royal Society und des Biotechnology and Biological Sciences Research Council (BBSRC) (UK) an M.N.

1. Konstruktion von miRNA-Expressionsvektoren
ANMERKUNG: Die Verfahren zur Konstruktion von miRNA-Expressionsvektoren (Schritte 1.1-1.3, 1.5-1.6.) sind für das miRNA-Expressionskit Block-iT Pol II miR RNA-Expressionskit mit EmGFP optimiert, wie zuvorbeschrieben 15,16. Das Kit enthält den Expressionsvektor, der die miRNA-Expression ermöglicht (pcDNA6.2-GW/EmGFP-miRNA), einen Kontrollvektor (pcDNA6.2-GW/EmGFP-miRNA-negatives Kontrollplasmid), akzessorische Reagenzien und Anweisungen zur Herstellung von miRNA-Expressionsvektoren (siehe Materialtabelle)17.
<ol><li>Design von einzelsträngigen DNA-Oligos, die für prä-miRNAs gegen das Zielgen kodieren: Entwerfen Sie einzelsträngige DNA-Oligos ("Top-Strand"-Oligos (Ziel-Prä-miRNAs) und "Bottom-Strand"-Oligos (Komplemente von Top-Strang-Oligos)) mit dem Online-Tool RNAi Designer (siehe Materialtabelle). Abbildung 2 zeigt die erforderlichen Eigenschaften der einzelsträngigen Oligos (Abbildung 2A) und Beispiele für Zielsequenzen (Abbildung 2B). HINWEIS: Es wird empfohlen, 5-10 prä-miRNA-Sequenzen für ein bestimmtes Zielgen zu generieren und in vitro auf Knockdown-Aktivitäten zu untersuchen (Schritt 1.4).</li>
	<li>Tempern der Ober- und Unterstrangoligos zur Erzeugung eines doppelsträngigen Oligos<ol><li>Stellen Sie die folgende Glühreaktion (Tabelle 1) in einem sterilen 0,5-ml-Mikrozentrifugenröhrchen ein.</li>
		<li>Das Reaktionsgemisch wird bei 95 °C für 4 min inkubiert. Glühen Sie die Ober- und Unterstrangoligos, um ein doppelsträngiges Oligo zu erzeugen, indem Sie das Reaktionsgemisch 5-10 Minuten lang auf Raumtemperatur (RT) abkühlen lassen. Die Probe kurz zentrifugieren (~5 s). HINWEIS: Die geglühten Oligos können bei -20 °C ohne Degradation mindestens ein Jahr lang gelagert werden.</li>
	</ol></li>
	<li>Klonierung der doppelsträngigen Oligos in den miRNA-Expressionsvektor (pcDNA6.2-GW/EmGFP-miRNA (im miRNA-Expressionskit enthalten)): Klonieren einzelner doppelsträngiger Oligos in den linearisierten miRNA-Expressionsvektor gemäß dem Herstellerhandbuch17.</li>
	<li>Bewertung von Knockdown-Effekten HINWEIS: Es wird empfohlen, einzelne miRNA-Sequenzen in vitro auf ihre Gensuppressionseffizienz zu testen, bevor sie in ovo angewendet werden. Die Knockdown-Effizienz kann getestet werden, indem miRNA-Expressionsplasmide in eine Zelllinie transfiziert werden, die das Zielgen exprimiert. Alternativ können einzelne miRNA-Expressionsplasmide in Zelllinien mit einem Expressionskonstrukt für das Zielgen co-transfiziert werden. Für Zielgene, die Proteine kodieren, die in ihrem nativen Zustand nicht membranverankert sind (z. B. lösliche Proteine), kann ein alkalisches Phosphatase (AP)-Fusionsprotein zur Überwachung der Expression des Zielproteins verwendet werden. Eine cDNA-Sequenz, die für das Zielprotein kodiert, kann in AP-Tag-Vektoren (APtag-1- APtag-5; siehe Materialtabelle) mit der humanen plazentaren alkalischen Phosphatase fusioniert und in Zellen eingebrachtwerden 18. Bei der Expression in Kulturzellen (z. B. HEK293T Zellen) wird das AP-markierte Zielprotein in hohen Mengen in Kulturmedien sezerniert, so dass Knockdown-Effekte von miRNA-Sequenzen durch Messung der Abnahme der AP-Aktivität in den Kulturmedien von miRNA-transfizierten Zellen (Unterschritte 1.4.1-1.4.4) bewertet werden können.<ol><li>Kultur HEK293T Zellen in einer 24-Well-Platte (8 x 104 Zellen/Well) über Nacht. Transient werden die Zellen mit individuellen miRNA-Expressionskonstrukten mit einem Expressionsplasmid eines AP-markierten Zielproteins transfektiert. Verwenden Sie das pcDNA6.2-GW/EmGFP-miRNA-negative Kontrollplasmid (im miRNA-Expressionskit enthalten) als Kontrolle. (Wenn Zelllinien verwendet werden, die stabil ein AP-markiertes Zielprotein exprimieren, transfektieren Sie die Zellen nur mit individuellen miRNA-Expressionskonstrukten.) HINWEIS: Für die Transfektion wird ein herkömmliches Lipofektionsreagenz (siehe Materialtabelle) verwendet.</li>
		<li>Das konditionierte Medium 48-72 h nach der Transfektion auffangen und die endogene AP-Aktivität in einem 65 °C warmen Wasserbad für 5 min inaktivieren. Schleudern von Schmutz in einer Desktop-Mikrozentrifuge bei maximaler Geschwindigkeit für 5 Minuten.</li>
		<li>Puffern Sie den Überstand mit 10 mM HEPES, pH 7,0 und leiten Sie ihn durch einen 0,45 μm-Filter.</li>
		<li>Nehmen Sie 100 μl (für die Messung in einem Plattenlesegerät) oder 500 μl (für ein Spektralphotometer) des Überstandes und fügen Sie eine gleiche Menge 2x AP-Substratpuffer hinzu (Tabelle 2). Überprüfen Sie die AP-Aktivität, indem Sie OD405 in einem Plattenlesegerät oder einem Spektralphotometer messen. HINWEIS: Wenn die AP-Aktivität des konditionierten Mediums für eine genaue Messung zu hoch ist, verdünnen Sie es mit HBAH-Puffer (Hanks' Balanced Salt Solution (HBSS), 0,5 mg/ml Rinderserumalbumin, 20 mM HEPES (pH 7,0)) oder einem anderen Puffer, der ein Trägerprotein enthält. Verwenden Sie keine phosphathaltigen Puffer (z. B. PBS), da anorganisches Phosphat als kompetitiver Inhibitor von AP wirkt.</li>
	</ol></li>
	<li>Verkettung der miRNA-Sequenz HINWEIS: Knockdown-Effekte können verstärkt werden, indem verschiedene miRNAs gegen dasselbe Zielgen verkettet oder dieselbe miRNA wiederholt werden. Der miRNA-Expressionsvektor unterstützt die Verkettung mehrerer prä-miRNA-Sequenzen und deren co-cistronische Expression17.<ol><li>Verketten Sie zwei verschiedene prä-miRNA-Sequenzen (gegen dasselbe Zielgen), die in In-vitro-Assays die höchsten Knockdown-Aktivitäten aufweisen (Schritt 1.4), gemäß den Anweisungen des Herstellers17.</li>
		<li>Bewerten Sie die Gensuppressionseffizienz der verketteten Konstrukte mit Hilfe von In-vitro-Assays , wie in Schritt 1.4 beschrieben. Wenn drei oder mehr prä-miRNA-Sequenzen ähnlich hohe Knockdown-Aktivitäten aufweisen, testen Sie verschiedene Kombinationen von zwei Sequenzen und verwenden Sie die Kombinationen, die die höchste Knockdown-Aktivität aufweisen (siehe Repräsentative Ergebnisse).</li>
	</ol></li>
	<li>Übertragung der EmGFP-pre-miRNA-Expressionskassette auf den Tol2-Transposon-Vektor HINWEIS: Die Expressionskassette mit EmGFP-cDNA und zwei prä-miRNA-Sequenzen wird in den Tol2-Transposon-Vektor (pT2K-CAGGS-Vektor, siehe Materialtabelle) überführt. Zu diesem Zweck wird die Expressionskassette (die vom 3'-Ende des CMV-Promotors bis zur miRNA-Reverse-Sequencing-Primerstelle des miRNA-Expressionsvektors reicht) unter Verwendung von Primern mit einer künstlichen Restriktionsenzymstelle PCR-amplifiziert, und das PCR-Produkt wird in den Tol2-Transposon-Vektor kloniert. Der Tol2-Transposon-Vektor enthält den ubiquitären CAGGS-Promotor, der die Expression der eingefügten Expressionskassette steuert. Der CAGGS-Promotor und die Expressionskassette werden von den Tol2-Sequenzen flankiert (Abbildung 1).<ol><li>PCR-Amplifikation der EmGFP-prä-miRNA-Expressionskassette: Befolgen Sie den Reaktionsaufbau und die in Tabelle 3 beschriebenen Thermozyklenbedingungen.</li>
		<li>Ligatieren Sie das gelgereinigte PCR-Produkt (ca. 1,3 kb) in den Restriktionsenzym-verdauten Tol2-Transposon-Vektor. Elektropolieren Sie das Plasmid in kompetente E. coli-Zellen (siehe Materialtabelle) und wählen Sie die Rekombinanten (pT2K-CAGGS-EmGFP-2x miRNA-Konstrukte) aus.</li>
		<li>Bereiten Sie das Plasmid mit einem herkömmlichen Maxiprep-Kit vor (siehe Materialtabelle). Überprüfen Sie die Struktur und Sequenz des Plasmids durch Restriktionskartierung bzw. durch Verwendung der für die PCR verwendeten Primer.</li>
	</ol></li>
</ol>2. Lagerung und Bebrütung der Eier
<ol><li>Kaufen Sie befruchtete Eier des Weißen Leghorns (Gallus gallus) von lokalen Bauernhöfen oder kommerziellen Anbietern. HINWEIS: Eier können bis zu 1 Woche vor der Inkubation bei 12-16 °C oder bei 4 °C aufbewahrt werden, ohne dass es zu einem signifikanten Verlust der Lebensfähigkeit oder einer Verzögerung der Entwicklung während der Inkubation kommt.</li>
	<li>Beschriften Sie die Eier mit dem Startdatum der Inkubation und markieren Sie die Oberseite der Eizelle (wo der Embryo positioniert wird). Befruchtete Eizellen werden in horizontaler Position bei 38 °C bebrütet, bis die Embryonen die Stadien 10 (33-38 h) -11 (40-45 h)19 erreicht haben.</li>
</ol>3. In-ovo-Elektroporation
<ol><li>Vorbereitung für die In-ovo-Elektroporation <ol><li>Herstellung einer 0,25%igen schnellen grünen Lösung: 25 mg Fast Green FCF in 10 ml PBS auflösen. Die Lösung wird mit einem 0,2 μm Spritzenvorsatzfilter filtriert. Die Lösung kann bei RT gespeichert werden.</li>
		<li>DNA-Cocktail: Bereiten Sie die Injektionslösung vor, indem Sie die einzelnen pT2K-CAGGS-EmGFP-2x-miRNA-Plasmide (Unterschritt 1.6.3) mit dem Tol2-Transposase-Expressionsplasmid (pCAGGS-T2TP-Vektor; siehe Materialtabelle) (je 5 μg/μl) im Verhältnis 2:1 mischen. Fügen Sie 1/10 Volumen einer 0,25%igen schnellen grünen Lösung hinzu, um den injizierten Bereich zu visualisieren. HINWEIS: Die optimale DNA-Konzentration kann je nach Konstrukt variieren.</li>
		<li>Aufbau des Mikroinjektionsgeräts (Abbildung 3A,B): Das Mikroinjektionsgerät besteht aus Folgendem (siehe Materialtabelle): Hamilton-Spritze, 18-G-Nadel (Nadellänge = 2"), PVC-Schlauch (Polyvinylchlorid) (2 cm Länge), Mikropipettennadel (Kann durch Ziehen von Kapillarröhrchen mit Omega-Punktfaser (1 mm Außendurchmesser x 0,75 mm Innendurchmesser) mit einem Mikropipettenzieher hergestellt werden).<ol><li>Füllen Sie eine Hamilton-Spritze mit schwerem Mineralöl. Befestigen Sie eine 18-G-Nadel an der Spritze und füllen Sie den Innenraum der Nadel mit Öl, indem Sie den Spritzenkolben drücken.</li>
			<li>Befestigen Sie ein Stück 2 cm langen PVC-Schlauch am Ende der Nadel und füllen Sie den Schlauch mit dem Öl.</li>
			<li>Befestigen Sie eine gezogene Mikropipettennadel am Schlauch. Brechen Sie die Spitze der Mikropipettennadel mit einer feinen Pinzette auf einen Durchmesser von 10-20 μm ab, um eine kleine Öffnung zu machen. Füllen Sie die gesamte Nadel mit Öl. HINWEIS: Es sollte darauf geachtet werden, dass keine Luftblasen im System eingeschlossen werden, da diese den Fluss der DNA-Lösung behindern würden.</li>
		</ol></li>
		<li>5 μl des farbigen DNA-Cocktails (Unterschritt 3.1.2) auf eine sterile Petrischale geben. Stecken Sie unter dem Präpariermikroskop die Spitze der Mikropipettennadel in die DNA-Lösung auf der sterilen Petrischale und ziehen Sie die Lösung langsam in die Nadel.</li>
		<li>Warten Sie, bis sich der Druck innerhalb und außerhalb der Nadel ausgleicht (um zu vermeiden, dass Luft in die Nadel gelangt) und nehmen Sie die Spitze der Nadel aus der DNA-Lösung. Halten Sie die Spitze der Nadel bis zur Injektion in steriles PBS in einem kleinen Becherglas.</li>
		<li>Aufbau der Elektroporationsapparatur (Abbildung 3A,C):<ol><li>Setzen Sie ein Paar Platinelektroden mit einem Elektrodenhalter auf einen Mikromanipulator. Stellen Sie den Abstand zwischen den Spitzen der Elektroden auf 2 mm ein (Abbildung 3C,E).</li>
			<li>Verbinden Sie die Elektroden mit Kabeln mit einem Rechteckimpulsgenerator (siehe Materialtabelle).</li>
		</ol></li>
	</ol></li>
	<li>Mikroinjektion von DNA-Lösung (Abbildung 3D)<ol><li>Nehmen Sie ein Hühnerei aus dem Inkubator und wischen Sie die Oberfläche des Eis mit einem in 70%igem Ethanol getränkten Seidenpapier ab.</li>
		<li>Befestigen Sie eine 18-g-Nadel an einer 10-ml-Spritze. Stechen Sie die Nadel schräg nach unten (45°) durch das stumpfe Ende des Eies, um das Eigelb nicht zu beschädigen.</li>
		<li>Entnehmen Sie 2-3 ml Albumin aus dem Ei. Verschließe das Loch mit einem Stück Tesafilm. Vergewissern Sie sich, dass sich der Embryo und die Vitellinmembran von der Schale lösen, indem Sie die Eizelle mit Licht "benetzen".</li>
		<li>Entfernen Sie ein Stück Eierschale (Kreis mit einem Durchmesser von 2-3 cm) mit einer Schere und einer Pinzette von der Oberseite des Eies, um den Embryo freizulegen. Nicht mehr als fünf Eizellen gleichzeitig öffnen, um das Austrocknen der Embryonen während der Elektroporation zu verhindern. HINWEIS: Wenn es schwierig ist, ein Fenster zu öffnen, ohne das Ei zu zerbrechen, kann die gesamte Oberseite des Eies mit Klebeband oder Tesafilm abgedeckt werden, bevor ein Stück Eierschale entfernt wird.</li>
		<li>Führen Sie die Spitze der Nadel von ihrer proximalen Seite in einem Winkel von 45° in das optische Vesikel ein und injizieren Sie den DNA-Cocktail, indem Sie den Kolben langsam drücken (oder darauf klopfen), bis die blau gefärbte Lösung das Lumen ausfüllt (Abbildung 3D). HINWEIS: Alternativ kann für die Injektion von DNA-Lösungen ein Druck-Mikroinjektionssystem (siehe Materialtabelle) verwendet werden.</li>
		<li>Ziehen Sie die Nadel zurück und setzen Sie ihre Spitze wieder in PBS ein.</li>
	</ol></li>
	<li>Elektroporation (Abbildung 3E)<ol><li>Stellen Sie die Impulsparameter des Elektroporators wie folgt ein: Spannung: 15 V, Impulslänge: 50 ms, Impulsintervall: 950 ms, Impulszahl: 5</li>
		<li>Geben Sie ein paar Tropfen HBSS auf die Vitellinmembran über dem Embryo. Senken Sie die Elektroden mit dem Mikromanipulator senkrecht zur vorderen und hinteren Achse des Embryos in das HBSS ab. HINWEIS: Alternativ kann dieses Verfahren ohne Zugabe von HBSS durchgeführt werden, da Albumin ein guter elektrischer Leiter ist, der eine effiziente Elektroporation ermöglicht.</li>
		<li>Platzieren Sie die Elektroden auf beiden Seiten (vordere (nasale) und hintere (temporale) Seite) des Sehblasens (Abbildung 3E). Achten Sie darauf, dass die Elektroden den Embryo oder die Blutgefäße nicht berühren. Wenden Sie gepulste elektrische Felder an.</li>
		<li>Entfernen Sie die Elektroden und reinigen Sie die Elektroden vorsichtig mit einem wassergetränkten, sterilen Wattestäbchen, um die Ansammlung von Albumin zu vermeiden.</li>
		<li>Versiegeln Sie das Fenster mit Tesafilm und inkubieren Sie den Embryo bis zum gewünschten Entwicklungsstadium.</li>
	</ol></li>
</ol>

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<li>Nakamura, R., Nakamoto, C., Obama, H., Durward, E., Nakamoto, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structure-function+analysis+of+Nel%2C+a+Thrombospondin-1-like+glycoprotein+involved+in+neural+development+and+functions%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Structure-function analysis of Nel, a Thrombospondin-1-like glycoprotein involved in neural development and functions.</a> Journal of Biological Chemistry. 287 (5), 3282-3291 (2012).</li>
<li>Nakamoto, C., Durward, E., Horie, M., Nakamoto, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nell2+regulates+the+contralateral-versus-ipsilateral+visual+projection+as+a+domain-specific+positional+cue%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Nell2 regulates the contralateral-versus-ipsilateral visual projection as a domain-specific positional cue.</a> Development. 146 (4), (2019).</li>
<li>Yee, J. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gene+expression+from+transcriptionally+disabled+retroviral+vectors%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Gene expression from transcriptionally disabled retroviral vectors.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 84 (15), 5197-5201 (1987).</li>
</ol>

Die Autoren haben nichts zu verraten.

Dieses Protokoll bietet einen detaillierten Leitfaden für das Gen-Silencing in der sich entwickelnden Netzhaut von Küken durch transgene Expression künstlicher miRNAs unter Verwendung der In-Ovo-Elektroporation und des Tol2-Transposon-Systems.
Die folgenden Faktoren sind für die erfolgreiche Durchführung dieser Technik von entscheidender Bedeutung. Erstens ist es wichtig, miRNA-Sequenzen zu verwenden, von denen bestätigt wurde, dass sie robuste Knockdown-Effekte ausüben. Bevor Sie sie...

Die Netzhaut von Wirbeltieren ist ein wichtiges Modellsystem für die Erforschung der neuronalen Entwicklung. Trotz ihrer peripheren Lage ist die Netzhaut anatomisch und entwicklungsbedingt eine Erweiterung des zentralen Nervensystems, und der Sehnerv, der aus Axonen retinaler Ganglienzellen besteht, stellt einen Trakt innerhalb des zentralen Nervensystems dar. Die Netzhaut von Küken hat als Modellsystem zur Untersuchung des molekularen Mechanismus der neuronalen Entwicklung erhebliche Vorteile: Sie ist groß und entwickelt sich schnell; Es hat strukturelle und funktionelle Ähnlichkeiten mit der menschlichen Netzhaut; Es ist für Visualisierungen und experimentelle Manipulationen leicht zugänglich. Molekulare Mechanismen der Zellproliferation und -differenzierung, der Morphogenese und der Axonführung während der neuronalen Entwicklung wurden mit Hilfe der Hühnerretina umfassend untersucht.
Die In-ovo-Elektroporation wurde in den letzten zwei Jahrzehnten erfolgreich eingesetzt, um ektopische Gene in Zellen des sich entwickelnden Kükenembryos einzuschleusen. Diese Technik ermöglicht die Markierung von sich entwickelnden Zellen, die Verfolgung des Zellschicksals und die Rückverfolgung von Zellmigration und Axonbahnen sowie die ektopische Genexpression für die In-vivo-Analyse der Genfunktion. Die Bedingungen der in ovo Elektroporation für eine effiziente ektopische Genexpression in Kükenembryonen sind gut etabliert 1,2,3.
Trotz dieser Vorteile war das Fehlen einer stabilen Loss-of-Function-Technik für die Untersuchung der Genfunktion eine wesentliche technische Einschränkung des Kükenembryos. Während Kükenembryonen, die mit kleinen interferierenden RNAs (siRNAs)4 oder Expressionsvektoren für kurze Haarnadel-RNAs (shRNAs)5 elektroporiert wurden, einen Knockdown des Zielgens zeigen, ist die Gensuppression bei diesen Ansätzen vorübergehend, da die Effekte verschwinden, sobald die Zellen die eingeführten RNAs oder DNAs verlieren. Eine stabilere Gensuppression kann durch die Verabreichung von siRNAs in Kükenembryonen durch ein RCAS-Retrovirussystem (R eplication Competent Avian sarcoma-leukosis virus (ASLV) long terminal repeat (LTR) with a S pliceacceptor) erreicht werden6. Der virale Vektor integriert sich in das Wirtsgenom und die ektopischen Gene werden stabil exprimiert. Das Retrovirus kann sich jedoch nur während der mitotischen (M)-Phase des Zellzyklus in das Genom sich teilender Zellen integrieren, was die Entwicklungsstadien und/oder Zelltypen, für die dieser Loss-of-Function-Ansatz angewendet werden kann, einschränken kann. Darüber hinaus scheint die Expression von Transgenen durch RCAS langsamer und weniger robust zu sein als diejenige, die durch In-ovo-Elektroporation induziert wird7.
Transposons sind genetische Elemente, die sich von einer Stelle im Genom zu einer anderen bewegen. Das Tol2-Element ist ein Mitglied der Familie der hAT-transponierbaren Elemente und enthält ein internes Gen, das für eine Transposase kodiert, die die Transposon-Reaktion des Tol2-Elements8 katalysiert. Wenn ein Plasmidvektor, der eine Genexpressionskassette trägt, die von den Sequenzen des linken und rechten Endes der Tol2-Elemente (200 bp bzw. 150 bp) flankiert wird, mit einem Tol2-Transposase-Expressionskonstrukt in Wirbeltierzellen eingeführt wird, wird die Expressionskassette aus dem Plasmid herausgeschnitten und in das Wirtsgenom integriert, das eine stabile Expression des ektopischen Gens unterstützt (Abbildung 1). Es wurde gezeigt, dass das transponierbare Element Tol2 die Gentransposition in verschiedenen Wirbeltierarten, einschließlich Zebrafisch 9,10, Frösche 11, Küken12 und Mäuse13, sehr effizient induzieren kann und somit eine nützliche Methode der Transgenese und Insertionsmutagenese ist. Das Tol2-Transposon-System wurde erfolgreich für den konditionalen Knockdown eines Zielgens durch genomische Integration von siRNA eingesetzt, die aus langer doppelsträngiger RNA14 prozessiert wird.
Dieses Protokoll beschreibt einen Loss-of-Function-Ansatz im Kükenembryo, bei dem künstliche microRNAs (miRNAs) durch das Tol2-Transposon-System eingeführt werden15,16. Bei diesem Ansatz wird eine Expressionskassette für den EmGFP-Marker (smaragdgrün fluoreszierendes Protein) und künstliche miRNAs gegen ein Zielgen in einen Tol2-Transposon-Vektor kloniert. Das Tol2-Transposon-Konstrukt wird dann mit einem Tol2-Transposase-Expressionskonstrukt durch In-ovo-Elektroporation in die embryonale Kükennetzhaut eingeführt. In den transfizierten Netzhautzellen katalysiert die Transposase die Exzision der Expressionskassette aus dem Transposon-Vektor und deren Integration in die Wirtschromosomen, was zu einer stabilen Expression von miRNAs und des EmGFP-Proteins führt. In unseren früheren Studien ist es uns gelungen, die Expression von Nel, einem extrazellulären Glykoprotein, das hauptsächlich im Nervensystem exprimiert wird, in der sich entwickelnden Netzhaut von Küken zu reduzieren (siehe Repräsentative Ergebnisse). Unsere Ergebnisse deuten darauf hin, dass mit dieser Technik eine stabile und effiziente Gensuppression in ovo erreicht werden kann.

<table><tbody><tr><td>18 G Nadel, 2"</td> <td>VWR</td><td>89219-320</td><td></td></tr><tr><td>AP-TAG Kit A und AP-TAG Kit B</td><td>GenHunter Corp</td><td>Q201 und Q202</td><td>Plasmidvektoren zur Herstellung von AP-Fusionsproteinen (https://www.genhunter.com/products/ap-tag-kit-a.html, https://www.genhunter.com/products/ap-tag-kit-b.html)</td></tr><tr><td>Block-iT RNAi Designer</td><td>Invitrogen</td><td></td><td>Ein Online-Tool zur Auswahl von Zielsequenzen und zum Design von prä-miRNA-Sequenzen (https://rnaidesigner.thermofisher.com/rnaiexpress/)</td></tr><tr><td>BSA 10 mg</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A2153</td><td></td></tr><tr><td>C115CB Kabel</td><td>Sonidel</td><td>C115CB</td><td>https://www.sonidel.com/product_info.php?products_id&frac14;254</td></tr><tr><td>C117 Kabel</td><td>Sonidel</td><td>C117</td><td>https://www.sonidel.com/product_info.php?products_id&frac14;252</td></tr><tr><td>Kapillarröhrchen mit Omega-Punktfaser (Mikropipettennadeln)</td><td>FHC</td><td>30-30-1</td><td>1 mm Außendurchmesser 0,75 mm Innendurchmesser</td></tr><tr><td>CUY21 Rechteck-Elektroporator</td><td>Nepa Gene</td><td>CUY21</td><td></td></tr><tr><td>Diethanolamin (pH 9,8)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D8885</td><td></td></tr><tr><td>Präpariermikroskop</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Ei Inkubator</td><td>Kurl</td><td>B-Lab-600-110</td><td>https://www.flemingoutdoors.com/kuhl%2D%2D-600-egglaboratory-incubator%2D%2D-b-lab-600-110.html</td></tr><tr><td>Elektrodenhalter</td><td>Sonidel</td><td>CUY580</td><td>https://www.sonidel.com/product_info.php?products_id&frac14;85</td></tr><tr><td>Elektroden</td><td>Nepa Gene</td><td>CUY611P3-1</td><td>https://www.sonidel.com/product_info.php?products_id&frac14;94</td></tr><tr><td>Electromax DH10B</td><td>Invitrogen</td><td>18290-015</td><td>Elektrokompetente E. coli-Zellen</td></tr><tr><td>Fast green</td><td>FCF Sigma-Aldrich</td><td>F7258</td><td></td></tr><tr><td>Befruchtete Hühnereier (Gallus gallus)</td><td>Bezogen von kommerziellen Anbietern (z.B. Charles River) oder lokalen Landwirten</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Schwanenhalsfaser-Lichtquelle</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>FuGene 6 Transfektionsreagenz</td><td>Promega</td><td>E2691</td><td></td></tr><tr><td>Hamilton-Spritze (50 &mu; L)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>20715</td><td>Hamilton Cat No&nbsp; 80901</td></tr><tr><td>Hanks' ausgewogene Salzlösung</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H6648</td><td></td></tr><tr><td>Schweres Mineralöl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>330760</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>GIBCO</td><td>15630080</td><td></td></tr><tr><td>L-Homoarginin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H10007</td><td></td></tr><tr><td>MgCl2</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>13112</td><td></td></tr><tr><td>Mikromanipulator</td><td>Narishige (Japan)</td><td>MM3</td><td>http://products.narishige-group.com/group1/MM-3/electro/english.html</td></tr><tr><td>Mikropipettenabzieher</td><td>Shutter Instrument</td><td>P97</td><td></td></tr><tr><td>p-Nitrophenylphosphat</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>20-106</td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D8662</td><td></td></tr><tr><td>pCAGGS-T2TP Vektor</td><td></td><td></td><td>Tol2-Transposase-Expressionsplasmid. Ein großzügiges freundliches Geschenk von Koichi Kawakami (Nationales Institut für Genetik, Japan). Auch bei Addgene erhältlich.</td></tr><tr><td>Pfu</td><td>ThermoFisher</td><td>F566S</td><td></td></tr><tr><td>Picospritzer (optional)</td><td>Parker</td><td></td><td>Druck-Mikroinjektionssystem</td></tr><tr><td>Plasmid maxi kit</td><td>Qiagen</td><td>12163</td><td>Plasmid maxiprep kit</td></tr><tr><td>pT2K-CAGGS Vektor</td><td></td><td></td><td>Tol2 Transposon Vektor. Mit freundlicher Verfügung von Yoshiko Takahashi (Kyoto University, Japan)</td></tr><tr><td>PVC-Schlauch</td><td>VWR (UK)</td><td>228-3830</td><td></td></tr><tr><td>Spectinomycin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S9007-5</td><td></td></tr><tr><td>T4 DNA-Ligase</td><td>Promega</td><td>M1801</td><td></td></tr><tr><td>Das BLOCK-iT Pol II miR RNA-Expressionskit mit EmGFP</td><td>Invitrogen</td><td>K493600</td><td>Enthält den miRNA-Expressionsvektor (pcDNA6.2-GW/EmGFP-miRNA), einen Kontrollvektor (pcDNA6.2-GW/EmGFP-miRNA-negatives Kontrollplasmid), Zubehörreagenzien und Anweisungen (https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/K493600?SID.srch-hj-K4936-00</td></tr><tr><td>)Thermocycler</td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

loss-of-function-ansatz in der embryonalen küken-netzhaut unter verwendung von tol2-transposon-vermittelter transgener expression künstlicher micrornas

Loss-of-Function Approach in the Embryonic Chick Retina by Using Tol2 Transposon-Mediated Transgenic Expression of Artificial microRNAs

Die Netzhaut von Küken ist seit langem ein wichtiges Modellsystem in der Entwicklungsneurobiologie, mit Vorteilen wie ihrer Größe, ihrer schnellen Entwicklung und ihrer Zugänglichkeit für Visualisierungen und experimentelle Manipulationen. Seine größte technische Einschränkung war jedoch das Fehlen robuster Loss-of-Function-Ansätze für Genfunktionsanalysen. Dieses Protokoll beschreibt eine Methode des Gen-Silencings in der sich entwickelnden Netzhaut von Küken, die die transgene Expression künstlicher microRNAs (miRNAs) unter Verwendung des Tol2-Transposon-Systems beinhaltet. Bei diesem Ansatz wird ein Tol2-Transposon-Plasmid, das eine Expressionskassette für den EmGFP-Marker (smaragdgrün fluoreszierendes Protein) und künstliche prä-miRNA-Sequenzen gegen ein Zielgen enthält, mit einem Tol2-Transposase-Expressionskonstrukt durch In-ovo-Elektroporation in die embryonale Kükennetzhaut eingeführt. In den transfizierten Netzhautzellen katalysiert die Transposase die Exzision der Expressionskassette aus dem Transposon-Vektor und deren Integration in die Wirtschromosomen, was zu einer stabilen Expression von miRNAs und des EmGFP-Proteins führt. In unserer früheren Studie haben wir gezeigt, dass die Expression von Nel, einem Glykoprotein, das mehrere Funktionen in der neuronalen Entwicklung ausübt, durch diese Technik in der sich entwickelnden Netzhaut von Küken signifikant unterdrückt werden kann. Unsere Ergebnisse deuten darauf hin, dass diese Methodik eine stabile und robuste Unterdrückung der Genexpression induziert und somit einen effizienten Loss-of-Function-Ansatz für Studien zur Netzhautentwicklung bietet.

Aufbau von Tol2-Transposon-Konstrukten zur Expression künstlicher miRNAs gegen Nel Nel (Neural Epidermal growth factor (EGF)-Like; auch bekannt als Nell2) ist ein extrazelluläres Glykoprotein. Es weist strukturelle Ähnlichkeiten mit Thrombospondin-1 auf und wird überwiegend im Nervensystem exprimiert20,21. Wir haben bereits gezeigt, dass Nel die Differenzierung und das Überleben von retinalen Ganglienzellen<sup class="xref...

Wir haben einen neuartigen Loss-of-Function-Ansatz entwickelt, der die Einführung und genomische Integration künstlicher Mikro-RNA-Sequenzen in Kükenembryonen unter Verwendung der In-ovo-Elektroporation und des Tol2-Transposon-Systems beinhaltet. Diese Technik bietet eine robuste und stabile Gen-Knockdown-Methode für Studien der Genfunktion während der Entwicklung.

Loss-of-Function-Ansatz in der embryonalen Küken-Netzhaut unter Verwendung von Tol2-Transposon-vermittelter transgener Expression künstlicher microRNAs

The chick retina has long been an important model system in developmental neurobiology, with advantages including its large size, rapid development, and ...

Diese Methodik bietet einen Loss-of-Function-Ansatz für Studien zur Netzhautentwicklung beim Küken. Diese Technik unterstützt die schnelle und anhaltende Unterdrückung von Zielgenen in einem bestimmten Bereich der Netzhaut. Dieser Ansatz kann auch auf andere Teile des Kükenembryos angewendet werden, einschließlich des neuronalen und nicht-neuronalen Gewebes.Für die In-ovo-Elektroporation wird eine 0,25%ige Fast Green-Lösung hergestellt, indem 25 Milligramm Fast Green FCF in 10 Millilitern PBS aufgelöst und dann mit einem 0,2-Mikron-Spritzenfilter filtriert wird. Als nächstes wird die DNA-Cocktail-Injektionslösung hergestellt, indem das microRNA-Smaragd-GFP-Plasmid mit dem Tol2-Transposase-Expressionsplasmid in einem Verhältnis von zwei zu eins gemischt wird. Dann wird die vorbereitete Fast Green-Lösung im Verhältnis eins zu 10 zum DNA-Cocktail gegeben, um den injizierten Bereich sichtbar zu machen.Als nächstes richten Sie das Mikroinjektionsgerät ein. Das Gerät besteht aus einer Hamilton-Spritze, einer 18-Gauge-Zwei-Zoll-Nadel, einem zwei Zentimeter langen Polyvinylchlorid-Schlauch und einer Mikropipettennadel. Füllen Sie die Hamilton-Spritze mit schwerem Mineralöl, befestigen Sie

loss-function-approach-embryonic-chick-retina-using-tol2-transposon

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Forschung

JoVE Journal

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Neurowissenschaften

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In-vivo-Elektroporation von Entwicklung Maus Retina

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Embryonale Küken Netzhautzellkulturen stellen wertvolle Werkzeuge für das Studium der Photorezeptorbiologie. Wir haben ein effizientes Gentransfertechnik, die auf ex ovo Elektroporation von Plasmid der Netzhaut vor der Kultur entwickelt. Diese Technik wesentlich erhöht Transfektionseffizienzen über derzeit verfügbaren Protokolle, was die genetische Manipulation möglich für dieses System.

Effizienten Gentransfer in Küken Netzhäute für primäre Zellkulturstudien: Eine Ex-ovo Elektroporation Ansatz

Das Ziel dieses Protokolls ist es, ein Verlust- zu beschreiben und zu gewinnen-Funktionsmethode, die zur Identifizierung Neogenin als stufenspezifischen Rezeptor anwendbar ist, die und die innere Zellmasse Differenzierung in preimplantation Maus-Embryonen zu Trophektoderm führt.

Verlust- und Gewinn-of-function-Ansatz Frühe Zellschicksal Bestimmungsfaktoren in Preimplantation Maus Embryonen zur Untersuchung

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In - vivo - Bildgebung von Expression Transgene Gene in einzelnen Retinal Vorläufern in Chimäre Zebrabärblingembryonen Studie Zellnichtautonome Einflüsse

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Kombination von Optogenetik mit künstlichen Mikro-RNAs, die Effekte gen Knockdown präsynaptischen Funktion innerhalb intakte neuronale Schaltkreise zu charakterisieren

Dieses Protokollpapier beschreibt die Methodik der Mikroinjektion eines RCAS(A)-Retrovirus in embryonale Hühnerlinsen als Werkzeug zur Untersuchung der In-situ-Funktion und Expression von Proteinen während der Linsenentwicklung.

Mikroinjektion von rekombinantem RCAS(A)-Retrovirus in embryonale Hühnerlinse

Erfahren Sie einen stabilen Loss-of-Function-Ansatz für die Netzhautentwicklung im Hühnerembryo mittels Tol2-Transposon-vermittelter künstlicher microRNA-Expression. Diese Methode ermöglicht effiziente und anhaltende Genunterdrückung.

Loss-of-Function-Ansatz in der embryonalen Küken-Netzhaut unter Verwendung von Tol2-Transposon-vermittelter transgener Expression künstlicher microRNAs (Video) | JoVE Journal

Loss-of-Function-Ansatz in der embryonalen Küken-Netzhaut unter Verwendung von Tol2-Transposon-vermittelter transgener Expression künstlicher microRNAs

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