Name: A Modified Surgical Model of Hind Limb Ischemia in ApoE-/- Mäuse mit einem Miniaturschnitt (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-05-13T12:30:00.000+00:00
Duration: 5 min 47 s
Description: Erfahren Sie eine minimalinvasive chirurgische Methode zur Induktion von Gliedmaßenischämie bei ApoE-Mäusen. Diese Technik ermöglicht die Untersuchung von Ischämie-Reperfusionsverletzungen und vaskulärer Pathologie mit geringem Trauma.

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Die Autoren danken Viktoria Skude, Alexander Schlund und Felix Hörner für die hervorragende technische Unterstützung.

HINWEIS: Alle experimentellen Verfahren wurden gemäß der EG-Richtlinie EG 2010/63/EU durchgeführt und sind durch die lokale deutsche Gesetzgebung (35-9185.81/G[1]239/18) zugelassen. Zehn männliche ApoE-/- Mäuse mit dem C57BL/6J-Hintergrund mit einem Gewicht von 29,6-38,0 g wurden in einem 12-stündigen Hell-Dunkel-Zyklus untergebracht und mit einer westlichen Ernährung (1,25% Cholesterin und 21% Fett) und Wasser ad libitum für 12 Wochen ab dem Alter von 8 Wochen gefüttert. HLI wurde an 20 Wochen alten Mäusen durchgeführt, wie unten beschrieben.
1. Induktion von HLI in ApoE-/- Mäusen
<ol><li>Bereiten Sie die erforderlichen Geräte und Werkzeuge für die Operation vor (siehe Materialtabelle und Abbildung 1). Sterilisieren Sie die chirurgischen Instrumente vor Gebrauch durch Autoklavieren und verwenden Sie während der Operation einen Glasperlensterilisator.</li>
	<li>Betäuben Sie die Maus vor allen chirurgischen Eingriffen mit einer subkutanen Injektion (S.C.) einer Mischung aus Midazolam (5 mg/kg), Medetomidin (0,05 mg/ml/kg) und Fentanyl (0,5 mg/kg).<ol>
<li>Verwenden Sie nach Beginn der Anästhesie die Tiersalbe auf den Augen, um Trockenheit zu verhindern, und bestätigen Sie das Fehlen des Pedalentzugreflexes im Vorderbein und in der Hintergliedmaße.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Anschließend die Maus auf ein Heizkissen legen, um die Körperkerntemperatur bei ca. 37 °C zu halten. Entfernen Sie mit Wattestäbchen und Haarentfernungscreme vorsichtig haare von der Hintergliedmaßenhaut auf der rechten Seite. HINWEIS: Die Haarentfernungscreme sollte in ausreichender Menge verwendet werden, um den Hinterteil zu bedecken, insbesondere den Leistenbereich, in dem der Schnitt gemacht wird. Die Haarentfernungscreme sollte für eine Dauer von weniger als 3 Minuten verwendet werden und anschließend 2 bis 3 Mal mit angefeuchteten Wattestäbchen entfernt werden.</li>
	<li>Legen Sie die Maus in Rückenlage unter ein Seziermikroskop auf das Heizkissen. Verwenden Sie ein Hautantiseptikum (siehe Materialtabelle),um die Haut der Maus zu desinfizieren. Anschließend machen Sie mit einer spitzen Pinzette und einer chirurgischen Schere einen ca. 3-4 mm langen Schnitt in der Mitte der Leistengegend. In Abbildung 2 finden Sie ein Schema der Prozedur.</li>
	<li>Entfernen Sie das Unterhautfettgewebe vorsichtig mit Hilfe einer feinen spitzen Pinzette, um das proximale neurovaskuläre Femoralbündel freizulegen. Verwenden Sie vorsichtig die feine spitze Pinzette, um die Membran der Oberschenkelscheide zu durchbohren. Verwenden Sie ein mit Kochsalzlösung angefeuchtetes Wattestäbchen, um die Oberschenkelarterie (FA) vorsichtig vom Oberschenkelnerv (FN) und der Oberschenkelvene (FV) wegzubewegen.</li>
	<li>Führen Sie zwei resorbierbare 7-0-Nähte durch die proximale FA und machen Sie doppelte Knoten mit einer Federschere, um die FA zwischen den beiden Bindungen zu transektieren.</li>
	<li>Um die distale FA freizulegen, führen Sie eine resorbierbare 7-0-Naht durch den unteren Rand des Schnitts und ziehen Sie den Schnitt vorsichtig in den Bereich der rechten Seite des Knies der Hintergliedmaße.</li>
	<li>Bewegen Sie das Unterhautgewebe vorsichtig zur Seite, um das neurovaskuläre Bündel freizulegen. Verwenden Sie eine feine spitze Pinzette, um die Membran der Oberschenkelscheide zu durchbohren, und sezieren Sie die FA von FV und FN.</li>
	<li>Führen Sie zwei 7-0 resorbierbare Nähte durch die distale FA und machen Sie doppelte Knoten. Verwenden Sie eine Federschere, um die FA zwischen den beiden Bindungen zu transektieren. HINWEIS: Am linken Glied, das bei jeder Maus als Kontrolle diente, wurde keine Ligatur durchgeführt.</li>
	<li>Verwenden Sie anschließend 6-0 resorbierbare Nähte, um den Schnitt zu nähen. Legen Sie die Maus auf ein Heizkissen in einem sauberen Käfig und überwachen Sie ihre Vitalparameter bis zur Genesung. Postoperative Analgetika: Buprenorphin s.c. (0,1 mg/kg Körpergewicht alle 8 Stunden für 48 h). 48 h nach der Operation Metamizol im Trinkwasser verabreichen (24 mg/5 ml Wasser entsprechen einer Dosis von 200 mg/kg 4 mal täglich).</li>
</ol>2. Magnetresonanztomographie
HINWEIS: Einen Tag nach DLFA müssen sich die Mäuse MRT-Scans unterziehen, um die FA-Blockade zu beurteilen.
<ol><li>Legen Sie die Maus in eine transparente Induktionskammer und betäuben Sie die Maus mit 1,5-2% Isofluran in der Umgebungsluft bis zum Verlust des Aufrichtungsreflexes.</li>
	<li>Legen Sie die Maus auf ein beheiztes Tierbett, das mit einem Bisshalter ausgestattet ist und mit einem lasergesteuerten System zum Magneten hin positioniert ist. Halten Sie die Körpertemperatur bei 37±1 °C.</li>
	<li>Halten Sie während der Bildaufnahme die Anästhesie mit 1,5-2% Isofluran in der Umgebungsluft aufrecht und überwachen Sie die Atmung mit einer Drucksonde.</li>
	<li>Erfassen Sie Bilder in der Querschnittausrichtung mit einer dreidimensionalen (3D) Time of Flight (TOF) Angiographiesequenz mit Parameter Echozeit (TE)/Wiederholungszeit (TR)/Flip angle (FA) = 2 ms/12 ms/13°, vier Mittelwerten, einer Erfassungsmatrix von 178 x 144 rekonstruiert auf 256 x 192 und 121 Scheiben, was zu einer isotropen Auflösung von 0,15 mm3führt. Um das Signal von den Venen zu unterdrücken, legen Sie eine Sättigungsscheibe distal zu den Hintergliedmaßen.</li>
</ol>3. Klinische Bewertung und Follow-up
<ol><li>Schätzen Sie die funktionelle Erholung in den1.,3.,5.und7. Tagen nach der Operation unter Verwendung der funktionellen Scoring-Tarlov-Skala18,19 ( Tabelle1).</li>
</ol>4. Histologische Bewertung
<ol><li>Sieben Tage nach der Operation eine Pentobarbital-Injektion (115 mg/kg) anwenden, um die Mäuse einzuschläfern.</li>
	<li>Perfuse phosphatgepufferte Kochsalzlösung (PBS) mit 1% Paraformaldehyd (PFA) durch den linken Herzventrikel (100 ml pro Maus). Fixieren Sie den bilateralen Gastrocnemius (Gm) der Mäuse in 4% PFA über Nacht bei 4 °C.</li>
	<li>Die Probe wird gemäß dem zuvor beschriebenen Protokoll 20 in Paraffineingebettet.<ol>
<li>Schneiden Sie 4-5 μm dicke Abschnitte des in Paraffin eingebetteten Gewebeblocks auf ein Mikrotom. Mit Hilfe eines runden Pinsels die geschnittenen Gewebeabschnitte in das bei 42°C gehaltene Wasserbad legen.</li>
		<li>Führen Sie den Objektträger in einem Winkel von 45° in das Wasser ein und positionieren Sie ihn vorsichtig unter der Gruppe der zu sammelnden Abschnitte.</li>
		<li>Heben Sie die Rutsche vorsichtig aus dem Wasser und lassen Sie die Abschnitte an der Rutsche befestigen und über Nacht im Tischinkubator bei 37 ° C trocknen.</li>
	</ol></li>
	<li>Führen Sie eine Hämatoxylin/ Eosin (HE) -Färbung der Paraffinabschnitte durch.<ol>
<li>Legen Sie die Dias, die die Schnitte enthalten, in Schieberhalter. Bereiten Sie 3 Behälter mit frischem Xylol vor und legen Sie die Folien für 5 Minuten in jeden Behälter, um die Abschnitte zu entparaffinisieren.</li>
		<li>Rehydrieren Sie die Abschnitte, indem Sie die Scheiben nacheinander in 96%, 80%, 70%, 50%, 30% Ethanol und entionisiertes Wasser für jeweils 5 Minuten tauchen.</li>
		<li>Färben Sie in Hämatoxylinlösung für 10 min.</li>
		<li>Geben Sie die Scheiben in einen Behälter mit entionisiertem Wasser und spülen Sie sie ab, indem Sie sie 5 Minuten lang unter fließendes Leitungswasser legen.</li>
		<li>Überprüfen Sie mit einem Mikroskop die Intensität der Hämatoxylinfärbung. Wenn die Färbung eine eindeutige Identifizierung der Zellkerne ermöglicht, fahren Sie mit dem nächsten Schritt fort. Wenn die Färbeintensität die Identifizierung von Zellkernen nicht erleichtert oder wenn die Intensität der Färbung schwach ist, legen Sie den Objektträger für 1 Minute in die Hämatoxylinlösung, wiederholen Sie das Waschen mit Wasser (Schritt 4.4.4) und überprüfen Sie es dann erneut.</li>
		<li>Gegenfleck in Eosin-Y-Lösung für 5 min.</li>
		<li>Dehydrieren Sie die Abschnitte, indem Sie die Scheiben nacheinander für eine Dauer von jeweils 10 s in Behälter mit entionisiertem Wasser und 30%, 50%, 70%, 80% und 96% Ethanol tauchen. Als nächstes legen Sie die Abschnitte nacheinander in drei Behälter mit frischem Xylol für jeweils 10 s.</li>
		<li>Platzieren Sie die Objektträger horizontal auf mikroskopischen Objektträger-Speicherkarten mit den Abschnitten nach oben. Fügen Sie genügend Montagemedium auf dem Dia hinzu und montieren Sie die Dias mit Deckgläsern.</li>
	</ol></li>
	<li>Führen Sie die immunhistochemische (IHC) Färbung der Paraffinabschnitte durch.<ol>
<li>Wiederholen Sie die Deparaffinisierungs- und Rehydratisierungsschritte 4.4.1-4.4.2. Tauchen Sie dann die Abschnitte in einen Behälter mit 10 mM Natriumcitratpuffer, pH 6, und bringen Sie die Probe in einer Mikrowelle zum Kochen. HINWEIS: Da eine Über- oder Unterhitzung der Proben zu einer inkonsistenten Färbung führen kann, halten Sie die Temperatur 10 Minuten lang knapp unter dem Siedepunkt.</li>
		<li>Als nächstes kühlen Sie die Abschnitte auf einer Tischplatte für 30 Minuten. Danach waschen Sie die Abschnitte dreimal für 5 min in PBS. Trocknen Sie den Bereich um die Probe sorgfältig ab und zeichnen Sie mit einem hydrophoben Stift einen großen Kreis um die Probe. . HINWEIS: Berühren Sie niemals die Probe. Die Markierung mit einem hydrophoben Pen bildet eine hydrophobe Grenze, die die Verwendung eines kleineren Volumens der Antikörperlösung erleichtert.</li>
		<li>Abschreckung der endogenen Peroxidaseaktivität durch Platzieren des Abschnitts in 0,3%H2O2in PBS für 10 min. Blockschnitte mit 400 μL Blockpuffer (PBS enthalten 3% Rinderserumalbumin und 0,3% nichtionisches Reinigungsmittel) für 1 h bei Raumtemperatur in einer befeuchteten Kammer.</li>
		<li>Waschen Sie die Abschnitte in PBS für 5 min. Als nächstes fügen Sie 100-400 μL verdünnten Anti-CD31-Antikörper (1:250) hinzu, um den Abschnitt abzudecken. Anschließend brüten Sie Abschnitte über Nacht bei 4 °C in einer befeuchteten Kammer aus. HINWEIS: Stellen Sie sicher, dass der Abschnitt vollständig mit der Antikörperlösung bedeckt ist.</li>
		<li>Entfernen Sie den primären Antikörper und waschen Sie die Abschnitte dreimal in PBS für eine Dauer von jeweils 5 minuten.</li>
		<li>Bereiten Sie die 3, 3 '-Diaminobenzidin (DAB) -Mischung vor, indem Sie 1 Tropfen des DAB-Konzentrats zu 1 ml des DAB-Verdünnungsmittels geben und gut mischen. Anschließend 100-400 μL DAB-Gemisch in die Schnitte geben und 2 min lang mit dem Auge genau überwachen, bis eine akzeptable Färbeintensität beobachtet wird. HINWEIS: Stellen Sie sicher, dass der Abschnitt vollständig mit der DAB-Mischung bedeckt ist.</li>
		<li>Anschließend 5 min unter fließendem Leitungswasser abspülen. Führen Sie die Hämatoxylinfärbung wie in den Schritten 4.4.3-4.4.5 beschrieben durch.</li>
		<li>Führen Sie die in Schritt 4.4.6 beschriebene Eosin-Y-Färbung durch. Führen Sie die in Schritt 4.4.7 beschriebenen Dehydratisierungsschritte durch.</li>
		<li>Montage der Abschnitte mit Deckgläsern unter Verwendung des Montagemediums. Verwenden Sie ImageJ, um den Prozentsatz der positiven CD31-Fläche (%) in 5 zufällig ausgewählten Feldern (40x) zu schätzen, die wie zuvor beschrieben als mikrovaskuläre Dichte angesehen werden können21.</li>
	</ol></li>
</ol>5. Statistische Auswertung
<ol><li>Verwenden Sie eine statistische Analysesoftware, um die Ergebnisse als Mittelwert ± Standardabweichung auszudrücken und einen ungepaarten t-Testan den Vergleichen durchzuführen. Betrachten Sie P < 0,05 als statistisch signifikant.</li>
</ol>

Die Autoren erklären, dass der Artikelinhalt in Ermangelung kommerzieller oder finanzieller Beziehungen verfasst wurde, die als potenzieller Interessenkonflikt ausgelegt werden könnten.

Diese Studie berichtet über einen modifizierten, vereinfachten und chirurgisch effizienten Ansatz zur Etablierung eines HLI-Modells inApoE-/-Mäusen mit Doppeltligatur in den proximalen und distalen Regionen des FA durch einen 3-4 mm-Schnitt ohne erforderliche Labor-Upgrades. Das Hauptmerkmal dieser Methode ist die geringere Größe der Inzision im Vergleich zu zuvor berichteten Studien, die die Maus-HLI-Modelle8,9,10<su...

Es besteht ein ungedeckter Bedarf an präklinischen Tiermodellen für die Erforschung von Gefäßerkrankungen wie der peripheren arteriellen Verschlusskrankheit (PAVK). Trotz der fortgeschrittenen Entwicklungen in Diagnose und Behandlung gab es im Jahr 2018 mehr als 200 Millionen Patienten mit PAD1, und ihre Zahl steigt ständig. Obwohl mehrere neuartige Therapieansätze2,3,4,5,6,7 beschrieben wurden, bleibt die erfolgreiche Translation dieser therapeutischen Modalitäten in die klinische Anwendung eine gewaltige Aufgabe. Daher sind zuverlässige und relevante experimentelle In-vivo-Modelle erforderlich, die den menschlichen Krankheitszustand simulieren, um den potenziellen Mechanismus und die Effizienz dieser neuen therapeutischen Ansätze zur Behandlung von PAD6zu untersuchen,7.
Hyperlipidämie und Atherosklerose (AS) sind die Hauptrisikofaktoren für die Entwicklung von PAD. ApoE-/- Mäuse (auf einer fettreichen Diät) zeigen einen abnormalen Fettstoffwechsel und Hyperlipidämie und entwickeln anschließend atherosklerotische Plaques, was ApoE-/- Mäuse zur besten Wahl macht, um das klinisch relevante PAD zu simulieren. Präklinische HLI-Tiermodelle werden durch Doppelligatur der Oberschenkelarterie (DLFA) erzeugt, was der am weitesten verbreitete Ansatz in Labors auf der ganzen Welt ist8,9,10,11,12,13,14,15 zur Simulation einer akuten chronischen Ischämie. Dieser Ansatz erfordert jedoch in der Regel einen relativ großen und invasiven Schnitt. Weiterhin führt es unweigerlich dazu, dass die Tiere (insbesondere Mäuse) unter vermehrten Schmerzverletzungen und Entzündungen leiden, was auch die nachfolgenden Experimentellen Ergebnissebeeinflusst 5,6,16,17. Diese Arbeit beschreibt ein akutes auf chronisches HLI-Modell in APOE-/- Mäusen unter Verwendung eines sehr kleinen Schnitts.

<table><tbody><tr><td>10x Phosphatpuffer Kochsalzlösung</td><td>Roth</td><td>9143.1</td><td>Zur Färbung von Hämatoxylin und Eosin und immunhistochemischer Färbung</td></tr><tr><td>30% H2O2</td><td>Roth</td><td>9681.2</td><td>Zur immunhistochemischen Färbung</td></tr><tr><td>von 6-0 resorbierbaren Nähten</td><td>PROLENE</td><td>8776H</td><td>Zur Naht der Haut</td></tr><tr><td>6-0 absroable Nahtmaterial</td><td>PROLENE</td><td>EP8706</td><td>Wird in der Chirurgie</td></tr><tr><td>verwendet 7-0 resorbierbare Nähte</td><td>PROLENE</td><td>EH8021E</td><td>Wird zur Ligatur der Arterie</td></tr><tr><td>7-0 absroable Naht</td><td>PROLENE</td><td>EP8755</td><td>Verwendet in der Chirurgie</td></tr><tr><td>Essigsäure</td><td>Roth</td><td>6755.1</td><td>Wird verwendet für Hämatoxylin- und Eosin-Färbung</td></tr><tr><td>Albumin Fraktion V</td><td>Roth</td><td>8076.2</td><td>Wird für immunhistochemische Färbung</td></tr><tr><td>Autoklav</td> <td>verwendetSystec GmbH</td><td>Systec VX-150</td><td>Wird für die Sterilisation der chirurgischen Instrumente</td></tr><tr><td>verwendet Axio vert A1 Mikroskop Carl</td><td>Zeiss</td><td>ZEISS Axio Vert.A1</td><td>Dient zum Betrachten und Aufnehmen der Bilder von Hämatoxylin- und Eosin-Färbungen und immunhistochemischen Flecken</td></tr><tr><td>Bruker BioSpec 94/20 AVIII</td><td>Bruker Biospin MRI GmbH</td><td>N/A</td><td>Scan der Blockade der Oberschenkelarterie</td></tr><tr><td>Buprenovet Sine 0,3mg/ml</td><td>Bayer AG</td><td>2542 (WDT)</td><td>Wird in der postoperativen Schmerztherapie verwendet. Dosis - 0,1 mg/kg Körpergewicht alle 8 Stunden für 48 h nach der Operation</td></tr><tr><td>CD31 Antikörper</td><td>Abcam</td><td>ab28364</td><td>Zur immunhistochemischen Färbung</td></tr><tr><td>Eosin Y Lösung 0,5 % in Wasser</td><td>Roth</td><td>X883.1</td><td>Zur Färbung von Hämatoxylin und Eosin</td></tr><tr><td>Epitope Retrieval Solution pH 6</td><td>Leica Biosystems</td><td>6046945</td><td>Zur immunhistochemischen Färbung</td></tr><tr><td>Ethanol > 99,5 %</td><td>Roth</td><td>5054.1</td><td>Zur Färbung von Hämatoxylin- und Eosin-Färbungen und immunhistochemischen Färbungen</td></tr><tr><td>Fentanyl</td><td>Cayman Chemical</td><td>437-38-7</td><td>Zur Anästhesie</td></tr><tr><td>Fine-Point-Pinzette</td><td>Medixplus</td><td>93-4505S</td><td>Zur Trennung der Arterie von Nerv und Vene</td></tr><tr><td>Glasperlen-Sterilisator</td><td>Simon Keller</td><td>Typ 250</td><td>Zur Sterilisation der chirurgischen Instrumente</td></tr><tr><td>Graefe Iris Pinzette gebogen</td><td>VUBU</td><td>VUBU-02-72207</td><td>Wird zur stumpfen Trennung von Haut und Unterhautgewebe verwendet</td></tr><tr><td>Haarentfernercreme, Veet (mit Aloe Vera)</td><td>Reckitt Benckiser</td><td>108972</td><td>Entfernen Sie Haare von Mäusen Hintergliedmaßen Heizplatte</td></tr><tr><td></td><td>ST&Ouml; RK-TRONIC</td><td>7042092</td><td>Halten Sie die sattliche Temperatur von Mäusen</td></tr><tr><td>Hämatoxylin</td><td>Roth</td><td>T865.2</td><td>Wird für Hämatoxylin- und Eosin-Färbungen und immunhistochemische Färbungen</td></tr><tr><td>verwendet Leica Operationsmikroskop</td><td>Leica</td><td>M651</td><td>Vergrößern Sie das Sichtfeld, um die Operation zu erleichtern</td></tr><tr><td>Flüssiges DAB+Substrat Chromogen System</td><td>Dako</td><td>K3468</td><td>Wird für immunhistochemische Färbung verwendet</td></tr><tr><td>Männliche ApoE-/- Mäuse</td><td>Charles River Laboratories</td><td>N/A</td><td>Wird für die Etablierung der peripheren arteriellen Verschlusskrankheit Mäusemodell</td></tr><tr><td>Medetomidin</td><td>Cayman Chemical</td><td>128366-50-7</td><td>Verwendet für die Anästhesie</td></tr><tr><td>Mikronadelhalter</td><td>Schwarz & Black Surgical</td><td>B3B-18-8</td><td>Halten der Nadel</td></tr><tr><td>Mikro-Nahtbindezange</td><td>Life Saver Surgical Industries</td><td>PS-MSF-145</td><td>Zur Unterstützung des Knotens während der Operation</td></tr><tr><td>Mikrotom</td><td>Biobase</td><td>Bk-Mt268m</td><td>Wird für Gewebeschnitte</td></tr><tr><td>verwendet Midazolam</td><td>Ratiopharm</td><td>44856.01.00</td><td>Wird für die Anästhesie</td></tr><tr><td>verwendet MRT-kompatibles Überwachungs- und Anschnittsystem für Kleintiere Modell 1025</td><td>SA Instruments</td><td>N/a</td><td>Überwachung der Vitalparameter von Tieren während der MRT-Untersuchung</td></tr><tr><td>Octeniderm farblos</td><td>Sch&uuml; LKE & Mayr GmbH</td><td>180212</td><td>zur Desinfektion der Haut</td></tr><tr><td>verwendet Salbe für Augen und Nase</td><td>Bayer AG</td><td>1578675</td><td>Halten Sie die Augen unter Narkose feucht</td></tr><tr><td>Paraformaldehyd</td><td>Roth</td><td>0335.1</td><td>Zur Fixierung des Gewebes</td></tr><tr><td>Pentobarbital</td><td>Nembutal</td><td>76-74-4</td><td>Zur Anästhesie</td></tr><tr><td>Kochsalzlösung</td><td>DeltaSelect</td><td>1299.99.99</td><td>Verwendet für Anästhesie</td></tr><tr><td>Federgriffschere mit feinen, scharfen Spitzen</td><td>Schwarz & Schwarz Surgical</td><td>B66167</td><td>Wird zum Schneiden der Arterie</td></tr><tr><td>verwendet SuperCut Schere</td><td>Schwarz & Black Surgical</td><td>B55992</td><td>Wird zum Schneiden der Haut</td></tr><tr><td>verwendet Triton X-100</td><td>Roth</td><td>9002-93-1</td><td>Verwendet für immunhistochemische Färbung</td></tr><tr><td>Westliche Ernährung, 1,25% Cholesterin</td><td>schnüffelt Spezialdi&auml; ten GmbH</td><td>E15723-34</td><td>Futter für die Mäuse</td></tr><tr><td>Xylol</td><td>Roth</td><td>4436.3</td><td>Zur Färbung von Hämatoxylin und Eosin und Immunhistochemie</td></tr></tbody></table>

a modified surgical model of hind limb ischemia in apoe-/- mäuse mit einem miniaturschnitt

A Modified Surgical Model of Hind Limb Ischemia in ApoE-/- Mice using a Miniature Incision

Ziel dieser Studie ist es, einen modifizierten chirurgischen Ansatz zur Induktion einer akuten Ischämie bei Mäusen einzuführen und zu bewerten, der in den meisten Tierlabors eingesetzt werden kann. Im Gegensatz zum herkömmlichen Ansatz für die Doppelligatur der Oberschenkelarterie (DLFA) wurde ein kleinerer Schnitt an der rechten Leistenregion vorgenommen, um die proximale Oberschenkelarterie (FA) für die Durchführung von DLFA freizusetzen. Dann wurde der Schnitt mit einer 7-0-Naht in die Knieregion gezogen, um den distalen FA freizulegen. Magnetresonanztomographie (MRT) an bilateralen Hintergliedmaßen wurde verwendet, um FA-Okklusion nach der Operation zu erkennen. 0, 1, 3, 5 und 7 Tage nach der Operation wurde die funktionelle Erholung der Hintergliedmaßen visuell beurteilt und mit der Tarlov-Skala bewertet. Die histologische Untersuchung wurde nach der Einschläferung der Tiere 7 Tage nach DLFA durchgeführt. Die Eingriffe wurden bei zehnApoE-/- Mäusen erfolgreich am rechten Bein durchgeführt, und bei der anschließenden Beobachtung starben keine Mäuse. Die Schnittgrößen bei allen 10 Mäusen betrugen weniger als 5 mm (4,2 ± 0,63 mm). MRT-Ergebnisse zeigten, dass der FA-Blutfluss auf der ischämischen Seite deutlich blockiert war. Die Ergebnisse der Tarlov-Skala zeigten, dass die Hintergliedmaßenfunktion nach dem Eingriff signifikant abnahm und sich in den folgenden 7 Tagen langsam erholte. Die histologische Untersuchung zeigte eine signifikante Entzündungsreaktion auf der ischämischen Seite und eine reduzierte mikrovaskuläre Dichte in der ischämischen Hintergliedmaße. Zusammenfassend lässt sich sagen, dass diese Studie eine modifizierte Technik mit einem Miniaturschnitt einführt, um eine Hintergliedmaßenischämie (HLI) unter Verwendung von DLFA durchzuführen.

Eigenschaften von ApoE-/- Mäusen DLFA-Operationen wurden erfolgreich an 10 Mäusen durchgeführt, um das HLI-Modell zu etablieren, und keine der Mäuse starb nach dem Eingriff. Um Veränderungen des Körpergewichts zu verfolgen, wurden Mäuse vor dem DLFA-Verfahren (Pre-DLFA) und 7 Tage nach der DLFA-Operation (Post-DLFA) gewogen. Die Gewichte vor DLFA lagen zwischen 29,6 und 38,0 g (Mittelwert 34,74 ± 2,47 g), und die Gewichte nach DLFA lagen zwischen 26,5 und ...

Dieser Artikel zeigt einen effizienten chirurgischen Ansatz zur Feststellung einer akuten Ischämie bei Mäusen mit einem kleinen Schnitt. Dieser Ansatz kann von den meisten Forschungsgruppen ohne Labor-Upgrades angewendet werden.

A Modified Surgical Model of Hind Limb Ischemia in ApoE-/- Mäuse mit einem Miniaturschnitt

The purpose of this study is to introduce and evaluate a modified surgical approach to induce acute ischemia in mice that can be implemented in most ...

Was wir heute vorgestellt haben, ist eine vereinfachte modifizierte und chirurgisch effiziente Methode, um die Hintergliedmaßen-Ischämie bei ApoE-Mäusen zu etablieren. Diese Methode kann in jeder Tieranlage eingesetzt werden. Der Hauptvorteil der Synovialmethode ist eine geringe Invasivität mit einem Schnitt von weniger als fünf Millimetern.Die Methode hat einen Lernhof. Wir empfehlen daher, vor der Arbeit an den Tieren, die in die endgültige Analyse einbezogen werden, an mikrochirurgischen Modellen zu üben. Die Methode wird von Kaixuan Yan, einem Doktor der Medizin und dem Studenten aus meinem Labor, demonstriert.Beginnen Sie mit der Vorbereitung der erforderlichen Ausrüstung und Werkzeuge für die Operation. Nachdem Sie der Maus die Anästhesie verabreicht haben, tragen Sie diese Salbe auf die Augen auf, um Trockenheit zu verhindern. Legen Sie dann die Maus auf ein Heizkissen, um die Körperkerntemperatur bei etwa 37 Grad Celsius zu halten.Entfernen Sie mit einem Wattestäbchen und einer Haarentfernungscreme vorsichtig die Haare von der Hinterhaut auf der rechten Seite. Legen Sie die Maus in Rückenlage unter ein Seziermikroskop auf das Heizkissen. Verwenden Sie Alkohol, um die Haut zu desinfizieren und wischen Sie mit der Baumwolle von der Pflanzenseite des Schnitts weg.Machen Sie mit der spitzen Pinzette und der Chirurgischen Schere einen Schnitt von etwa drei bis vier Millimetern in der Mitte der Leistengegend. Entfernen Sie vorsichtig das Unterhautfettgewebe mit Hilfe einer feinen spitzen Pinzette, um das proximale femorale neurovaskuläre Bündel freizulegen. Bewegen Sie mit einem mit Kochsalzlösung angefeuchteten Wattestäbchen die Oberschenkelarterie vorsichtig vom Oberschenkelnerv und der Oberschenkelvene weg.Dann mit der Spitze einer 7.0-Naht vorsichtig die Membran der Femurscheide durchbohren. Gehen Sie dann zu 7-0 resorbierbaren Nähten durch die proximale Oberschenkelarterie und machen Sie doppelte Knoten mit der Federschere. Anschließend durchschneiden Sie die Oberschenkelarterie zwischen den beiden Bindungen.Führen Sie die resorbierbare 6-0-Naht durch den unteren Rand des Schnitts und ziehen Sie den Schnitt vorsichtig in den Bereich der rechten Seite des Knies der Hintergliedmaße, um die distale Oberschenkelarterie freizulegen. Bewegen Sie das Unterhautgewebe vorsichtig zur Seite, um das neurovaskuläre Bündel freizulegen. Sezieren Sie die Oberschenkelarterie von der Oberschenkelvene und dem Oberschenkelnerv und verwenden Sie Baumwolle, um den Nerv zu schützen.Dann mit der Spitze einer 7.0-Naht die Membran der Femurscheide durchbohren. Führen Sie zwei 7-0 resorbierbare Nähte durch die distale Oberschenkelarterie und machen Sie doppelte Knoten mit der Federschere, um die Oberschenkelarterie zwischen zwei Bindungen zu durchschneiden. Anschließend nähen Sie den Schnitt mit den 6-0 resorbierbaren Nähten.Legen Sie die Maus auf ein Heizkissen in einem sauberen Käfig und überwachen Sie ihre Vitalparameter bis zur Genesung. Bestimmen Sie den Erfolg der Doppelligatur der Oberschenkelarterie oder DLFA am nächsten Tag über MRT. Vor dem DLFA-Verfahren lagen die Gewichte der Mäuse zwischen 29,6 und 38,0 Gramm.Sieben Tage nach der DLFA-Operation lagen die Gewichte zwischen 26,5 und 34,1 Gramm, deutlich niedriger als die Gewichte vor DLFA. Die proximalen und distalen Regionen der rechten FA zeigten keine Perfusion. Die Ergebnisse der Tarlov-Skala waren einen Tag nach der Operation signifikant erniedrigt.Obwohl sie in den folgenden Tagen langsam zunahmen, waren sie bis zum siebten Tag immer noch niedriger als der Ausgangswert. Die Pfoten der ischämischen Hinterbeine bei sieben Mäusen konnten sich im Vergleich zur kontralateralen Seite nicht auf natürliche Weise dehnen. Darüber hinaus zeigten vier der Mäuse eine leichte Verfärbung der Pfoten im Vergleich zur kontralateralen Seite.Die H & E-Färbung des rechten GM-Muskels zeigte Myofiber, die eine unregelmäßige ischämische Nekrose aufwiesen, bei der proliferierende Satellitenzellen die nekrotischen Myofiber ersetzt hatten und in einer Masse oder mit einer regelmäßigen Dispersion verteilt waren. Myofiber, die eine entzündliche Infiltration durch mehrkernige Makrophagen aufwiesen, hatten ihre normalen morphologischen Eigenschaften verloren, wobei nur sehr wenige regenerierte Myofiber vorhanden waren. Querteile dieser regenerierten Myofiber waren rund.Das Zytoplasma war rot gefärbt und ein kleiner Kern oder mehrere Kerne befanden sich in der Mitte. Diese Art von Entzündungsmuster wurde jedoch bei der linken GM nicht beobachtet. Die CD31-Antikörperfärbung, die zur Beobachtung der mikrovaskulären Dichte durchgeführt wurde, zeigte, dass ischämische Hintergliedmaßen signifikant mehr mikrovaskuläre Dichte aufwiesen als die nicht-ischämische Seite. Das Wichtigste ist die Dissektion der Oberschenkelarterie.Der Bediener muss Erfahrung in mikrochirurgischen Techniken haben und mit der Anatomie der Maus im Hinterteil vertraut sein. Prinzipiell könnte diese Methode auch zur Untersuchung von Ischämie-Reperfusionsverletzungen im Bein eingesetzt werden. Dabei kann die Arterie mit einer weichen Gefäßklemme verschlossen werden, bevor eine Reperfusion zugelassen wird.

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Research

Forschung

JoVE Journal

Biology

Biologie

Das chirurgische Verfahren zur Induktion einer einseitigen Hinterlauf Ischämie nachgewiesen wird, mit der Bestätigung der Ischämie durch Laser-Doppler-Perfusion.

Mausmodell der hinteren Gliedmaßen Ischämie

Zahlreiche genetische Manipulationen und / oder intramyokardialen Injektionen von Genen, Proteinen, Zellen und / oder Biomaterialien basieren auf die Dimension der Zeit in Studien zur akuten Ischämie / Reperfusion und chronischer Umbau in Mäusen überlagert. Dieses Video zeigt die mikrochirurgische Verfahren für die Ischämie / Reperfusion, permanent koronare Ligation und intramyokardialen Injektion Studien.

Koronare Ligation und intramyokardialen Injection in einem Mausmodell der Infarkt

Wir stellen ein chirurgisches Verfahren, experimentelle Ischämie / Reperfusions (I / R) Schädigung induzieren Myokardinfarkt (MI) in Mausmodellen, die für mehr Klarheit in der Positionierung der Ligation an der linken vorderen absteigenden Arterie (LAD) simulieren können, um die Reproduzierbarkeit zu erhöhen MI Experimente in Mäusen.

Einem Mausmodell der myokardialen Ischämie-Reperfusion Injury durch Ligation des linken vorderen absteigenden Arterie

Ein hochgradig reproduzierbares Modell für Myokardinfarkt bei Mäusen mit minimalinvasiven Manipulationen wird beschrieben. Das Modell kann einfach durchgeführt werden, was zu einer hohen Reproduzierbarkeit und Überlebensrate führt. Somit wird das beschriebene Modell die Anzahl der benötigten Tiere reduzieren, wie es das 3R-Prinzip (Replacement, Refinement and Reduction) verlangt.

Minimal-invasive chirurgische Verfahren zur Induktion Myokardinfarkt in Mice

Die chirurgische Induktion der Ischämie der Hintergliedmaßen bei der Maus ist nützlich, um die Angiogenese zu untersuchen, jedoch ist dies bei bestimmten Inzucht-Mausstämmen, die eine ausgeprägte Ischämie-induzierte Gewebenekrose aufweisen, beeinträchtigt. Es werden Methoden zur Induktion einer subakuten Ischämie der Gliedmaßen unter Verwendung von Ameroid-Konstriktoren beschrieben, um dieses Problem durch die Induktion eines allmählichen arteriellen Verschlusses zu umgehen.

Methoden für die akute und subakute Murine hindlimb Ischemia

Wir beschreiben ein Mausmodell für einen Schlaganfall, der durch den Verschluss der mittleren Hirnarterie mit einer silikonbeschichteten Naht induziert wird. Das Protokoll kann angewendet werden, um einen dauerhaften Verschluss oder eine vorübergehende Ischämie mit anschließender Reperfusion zu induzieren.

Die Induktion von ischämischem Schlaganfall und Ischämie-Reperfusion bei Mäusen die Mittel Artery Occlusion Technik und Visualisierung von Infarktbereich verwenden

Ein Maus-Modell der zerebralen Ischämie-Reperfusion wird gegründet, um die Pathophysiologie des Schlaganfalls zu untersuchen. Wir nach distal verbinden rechts mittlere zerebrale Arterie und rechts gemeinsame Halsschlagader und Blutfluss nach 10 oder 40 min der Ischämie wiederherstellen.

Zwei-Schiff Okklusion Mausmodell der zerebralen Ischämie-reperfusion

Hier wird ein kritisches Hinterlimb Ischämie-Experimentalmodell vorgestellt, gefolgt von einer Batterie funktioneller, histologischer und molekularer Tests zur Beurteilung der Wirksamkeit angiogener Therapien.

Beurteilung der therapeutischen Angiogenese in einem Murine-Modell von Hindlimb Ischemia

Hierin beschreiben wir ein chirurgisches Verfahren, das zeigt, wie eine dauerhafte Ligation der links-vorderen absteigenden Herzkranzgefäße bei Mäusen erreicht werden kann. Dieses Modell ist von hoher Relevanz für die Untersuchung der Pathophysiologie des Myokardinfarkts und der damit einhergehenden biologischen Prozesse.

Murine Myokardinfarkt Modell mit permanenten Ligation der linken Anterior absteigende Koronararterie

Das vorliegende Protokoll beschreibt ein einzigartiges, klinisch relevantes Modell der peripheren arteriellen Verschlusskrankheit, das die Elektrokoagulation der Oberschenkelarterie und der Venen mit der Verabreichung eines Stickstoffmonoxid-Synthase-Inhibitors kombiniert, um bei FVB-Mäusen Gangrän der Hintergliedmaßen zu induzieren. Die intrakardiale DiI-Perfusion wird dann für die hochauflösende, dreidimensionale Bildgebung des Gefäßes des Fußpolsters verwendet.

Hochauflösende dreidimensionale Abbildung der Fußpolstervaskulatur in einem murinen Hinterbein-Gangränmodell

Dieses Protokoll beschreibt die Entnahme, das Nähen und die Überwachung von fasziokutanen Lappen bei Ratten, die eine gute Visualisierung und Manipulation des Blutflusses durch die oberflächlichen unteren epigastrischen Gefäße durch Klemmen und Ligieren der Oberschenkelgefäße ermöglichen. Dies ist entscheidend für Studien mit ischämischer Präkonditionierung.

Der oberflächliche axiale Lappen der Arteria epigastrica inferior zur Untersuchung ischämischer Präkonditionierungseffekte in einem Rattenmodell

Erfahren Sie eine minimalinvasive chirurgische Methode zur Induktion von Gliedmaßenischämie bei ApoE-Mäusen. Diese Technik ermöglicht die Untersuchung von Ischämie-Reperfusionsverletzungen und vaskulärer Pathologie mit geringem Trauma.

A Modified Surgical Model of Hind Limb Ischemia in ApoE^-/- Mäuse mit einem Miniaturschnitt

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