Name: Immunfluoreszierende Färbung zur Visualisierung von Heterochromatin-assoziierten Proteinen in Drosophila Speicheldrüsen (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-08-21T14:30:00.000+00:00
Duration: 10 min 13 s
Description: Lernen Sie immunfluoreszente Färbung zur Visualisierung von Heterochromatin-Aggregaten in Drosophila-Speicheldrüsen. Diese Methode ermöglicht die Analyse chromatindynamischer Veränderungen in verschiedenen genetischen Hintergründen.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Wir danken Marco Antonio Rosales Vega und Abel Segura für die Aufnahme einiger der konfokalen Bilder, Carmen Muñoz für die Medienvorbereitung und Dr. Arturo Pimentel, M.C. Andrés Saralegui und Dr. Chris Wood von der LMNA für Ratschläge zur Verwendung der Mikroskope.

1. Dritte Instar-Larvenkultur
<ol><li>Bereiten Sie 1 Liter Standardmedien vor, indem Sie 100 g Hefe, 100 g unraffinierten Vollrohrzucker, 16 g Agar, 10 ml Propionsäure und 14 g Gelatine hinzufügen. Alle Zutaten außer der Hefe in 800 ml Leitungswasser auflösen und dann die Hefe auflösen. Autoklaven Sofort für 30 Minuten.<ol>
<li>Danach das Medium auf 60 °C abkühlen lassen und Propionsäure zu einer Endkonzentration von 0,01% hinzufügen. Lassen Sie die Flasche stehen, bis sich die Gelatine gebildet hat.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Um die 3o-Instar-Larvenkultur zu optimieren, sammeln Sie zunächst 5 bis 10 Tage alte Erwachsene und legen Sie 50 (25 Männchen und 25 Weibchen) in eine breite Halsflasche mit Standardmedien.</li>
	<li>Stellen Sie die Flasche mit den Fliegen in einen kontrollierten Temperaturinkubator bei 25 ° C, bis die Anzahl der gelegten Eier 50 beträgt (ca. 12 Stunden für den Wildtypstamm).</li>
	<li>Nachdem die Inkubationszeit vorbei ist, entfernen Sie die Erwachsenen und übertragen Sie sie in eine neue Flasche, um den Vorgang zu wiederholen. Lassen Sie die Embryonen 72 Stunden lang bei 18 °C wachsen HINWEIS: Weitere Informationen zu den Lagerhaltungsbedingungen für Drosophila finden Sie unter Tennessen & Thymmel13.</li>
</ol>2. Larvensammlung
<ol><li>Für die Larvensammlung wählen Sie die wandernden Larven, die keine everted Spiracles haben. Nach der Eversion der Spiralen tritt die Larve in das Vorbereitungsstadium ein, während sie ausgezeichnete Polytenchromosomen behält, die für die Analyse geeignet sind. Erst nach 12 Stunden beginnen sich die Zellen der Speicheldrüse auf den programmierten Zelltod vorzubereiten14,15.</li>
	<li>Nehmen Sie fünfzehn 3° Instar-Larven und legen Sie sie in ein Wachglas, um sie zu waschen. Anschließend in eine eiskalte Kochsalzlösung oder PBS überführen (1x PBS: 137 mM NaCl, 2,7 mM KCl, 10 mM Na2HPO4,2 mM KH2PO4,pH auf 7,4 einstellen).</li>
	<li>Sezieren Sie 15 bis 30 Speicheldrüsenpaare (oder so viele wie möglich in 30 Minuten) in kaltem PBS mit Proteasehemmern unter dem stereoskopischen Mikroskop. Die Speicheldrüsen in ein 1,5 ml Röhrchen mit eiskaltem PBS überführen.</li>
	<li>Einmal mit 1 ml PBS plus Proteasehemmer waschen. Warten Sie, bis das Gewebe den Boden der Röhre erreicht hat.</li>
	<li>Nach dem Waschen das PBS mit einer 1000 μL Pipette entfernen. Achten Sie darauf, das Gewebe nicht zu berühren.<ol>
<li>Alternativ sezieren Sie die Speicheldrüsen in 5 ml PBS, um diesen Waschschritt zu eliminieren, und fahren Sie mit Schritt 3 fort, indem Sie die Speicheldrüsen auf 0,5 ml des unten beschriebenen Ruvkun-Fixierpuffers übertragen.</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. Fixierung von Speicheldrüsengewebe
<ol><li>Nachdem Sie das PBS aus dem letzten Schritt entfernt haben, fügen Sie direkt 0,5 ml 1x Ruvkun-Fixierpuffer mit 50% Methanol (0,5 ml Methanol hinzufügen) und 2% Formaldehyd hinzu. HINWEIS: 2x Ruvkun Lösung ist 160 mM KCl, 40 mM NaCl, 20 mM EGTA, 30 mM PIPES bei pH 7,4.</li>
	<li>2 Stunden bei 4 °C bei leichter Rotation inkubieren.</li>
</ol>4. Speicheldrüsengewebe waschen
<ol><li>Führen Sie eine 5-minütige Rotationswäsche mit 1 ml Tris/Triton-Puffer durch (100 mM Tris pH 7,4, 1% Triton X-100 und 1 mM EDTA). HINWEIS: Warten Sie, bis das Gewebe den Boden der Röhre erreicht hat.</li>
</ol>5. Permeabilisierung
<ol><li>Inkubieren Sie die Speicheldrüsen in 1 ml Tris / Triton X-100 (das gleiche wie oben). Für einige Proteine kann es notwendig sein, 1% β-Mercaptoethanol hinzuzufügen.</li>
	<li>2 Stunden bei 37°C bei leichtem Schütteln (300 U/min) inkubieren.</li>
</ol>6. Konservierungsschritt (optional)
HINWEIS: Wenn Sie nicht sofort mit der Inkubation mit dem Antikörper fortfahren, bewahren Sie das Gewebe wie folgt auf.
<ol><li>Mit 1 mLBO3 Puffer (0,01 M H3BO3 pH 9,2 + 0,01 M NaOH) waschen und dann in BO3 /10mM DTT bei 37°C unter leichtem Schütteln (300 U/min) für 15 Minuten inkubieren.</li>
	<li>Am Ende der Inkubationszeit eine Wäsche mit 1 mlBO3-Puffer allein durchführen. HINWEIS: Warten Sie, bis das Gewebe den Boden der Röhre erreicht hat.</li>
	<li>Fügen Sie 1 ml PBS hinzu. Bewahren Sie das Gewebe in dieser Lösung bei 4 °C für bis zu 72 Stunden auf und fahren Sie dann mit dem nächsten Schritt fort. Dieser Schritt ist besonders hilfreich bei der Arbeit mit verschiedenen mutierten Stämmen, die einen verzögerten Lebenszyklus aufweisen können, so dass die Immundetektion gleichzeitig mit den Kontrollen durchgeführt werden kann.</li>
</ol>7. Gewebeblockierung
<ol><li>Inkubieren Sie die Speicheldrüsen in 1 ml Puffer B (PBS + 0,1% BSA + 0,5% Triton X-100 + 1 mM EDTA) für 2 Stunden bei Raumtemperatur mit Rotation.</li>
</ol>8. Immunfärbung
<ol><li>Entfernen Sie alle Puffer B und fügen Sie Puffer A (PBS + 0,1% BSA) plus Antikörper von Interesse hinzu. HINWEIS: Wir verwenden den HP1a C1A9c (konzentrierter Antikörper) von Hybridoma Bank bis zu 1:3000. Bei der Verwendung des C1A9s (Überstand) haben wir versucht, von 1:100 bis zu einer 1:500 Verdünnung zu gehen und jede Verdünnung zwischen diesem Rang funktioniert gut) über Nacht bei 4 oC mit Rotation. An dieser Stelle ist es wichtig, dass das Schütteln keine Blasen aufwirft, die den Antikörper schädigen könnten.</li>
</ol>9. Immunhaltiges Waschen
<ol><li>Führen Sie 3 x 15-minütige Wäschen mit Puffer B unter Rühren bei Raumtemperatur mit jeweils 1 ml durch.</li>
	<li>Übertragen Sie die Drüsen zusammen mit dem sekundären Antikörper, der an ein Fluorophor gekoppelt ist, für 2 Stunden unter Rotation bei 4 oC in Puffer B (sekundärer Antikörper Alexa Fluor 568 Invitrogen wurde 1:3000 verwendet).<ol>
<li>Bedecken Sie das Röhrchen mit Aluminiumpapierfolie, um den sekundären Antikörper vor dem Licht zu schützen.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Führen Sie 2 x 15-minütige Waschungen bei Raumtemperatur während der Rotation mit 1 ml Puffer B durch.</li>
	<li>Mit einem DNA-Marker wie Sytox (2 μL von 5 mM Stamm nehmen und in 1 ml Puffer B auflösen) oder Hoechst (1 μL 10 mg/ml Stamm nehmen und in 1 ml Puffer B auflösen) für 10 Minuten bei Raumtemperatur mit Rotation inkubieren.</li>
	<li>Führen Sie eine Wäsche mit Buffer B und einmal mit PBS durch, wobei jede Wäsche 10 Minuten dauert, während Sie bei Raumtemperatur rotieren. HINWEIS: Denken Sie daran, es vor dem Licht zu schützen.</li>
</ol>10. Bildgebung
<ol><li>Montieren Sie die Speicheldrüsen auf einer Rutsche und machen Sie einen Pool mit einem Coverlip.</li>
	<li>Legen Sie die Speicheldrüsen in die Mitte des Pools und bedecken Sie sie mit AF1 Citifluor, um die Bildung von Blasen zu vermeiden, die die viskose Flüssigkeit überall ausdehnen. Dann versiegeln Sie alle Seiten mit klarem Nagellack.</li>
	<li>Unter einem Fluoreszenz- oder Konfokalmikroskop beobachten. Wenn die Probe nicht am selben Tag beobachtet wird, lagern Sie sie lichthalb bei 4 °C.</li>
	<li>Verwenden Sie GraphPad Prism 6, um alle Diagramme und statistischen Analysen zu generieren.</li>
	<li>Analysieren Sie die Daten der HP1a-Verteilung in Speicheldrüsen mit dem Kruskal-Wallis-Test. Die statistische Signifikanz wurde auf (p < 0,05*, < 0,01 **, < 0,001***, < 0,0001****) festgelegt.</li>
</ol>

<ol><li>Berger, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Emil+Heitz%2C+a+true+epigenetics+pioneer%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Molecular+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Emil Heitz, a true epigenetics pioneer.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 20 (10), 572(2019).</li>
<li>Irick, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+new+function+for+heterochromatin%5BTitle%5D)+AND+%22Chromosoma%22%5BJournal%5D)">A new function for heterochromatin.</a> Chromosoma. 103 (1), 1-3 (1994).</li>
<li>Kasinathan, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Innovation+of+heterochromatin+functions+drives+rapid+evolution+of+essential+ZAD-ZNF+genes+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Elife%22%5BJournal%5D)">Innovation of heterochromatin functions drives rapid evolution of essential ZAD-ZNF genes in Drosophila.</a> Elife. , 1-31 (2020).</li>
<li>Lifschytz, E., Hareven, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Heterochromatin+markers%3A+Arrangement+of+obligatory+heterochromatin%2C+histone+genes+and+multisite+gene+families+in+the+interphase+nucleus+of+D.+melanogaster%5BTitle%5D)+AND+%22Chromosoma%22%5BJournal%5D)">Heterochromatin markers: Arrangement of obligatory heterochromatin, histone genes and multisite gene families in the interphase nucleus of D. melanogaster.</a> Chromosoma. 86 (4), 443-455 (1982).</li>
<li>Eissenberg, J. C., Elgin, S. C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((HP1a%3A+A+structural+chromosomal+protein+regulating+transcription%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Genetics%22%5BJournal%5D)">HP1a: A structural chromosomal protein regulating transcription.</a> Trends in Genetics. 30 (3), 103-110 (2014).</li>
<li>Lee, Y. C. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pericentromeric+heterochromatin+is+hierarchically+organized+and+spatially+contacts+H3K9me2+islands+in+euchromatin%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Genetics%22%5BJournal%5D)">Pericentromeric heterochromatin is hierarchically organized and spatially contacts H3K9me2 islands in euchromatin.</a> PLoS Genetics. 16 (3), 1-27 (2020).</li>
<li>Koryakov, D. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+SUUR+protein+is+involved+in+binding+of+SU+%28VAR%293-9+and+methylation+of+H3K9+and+H3K27+in+chromosomes+of+Drosophila+melanogaster%5BTitle%5D)+AND+%22Chromosome+Research%22%5BJournal%5D)">The SUUR protein is involved in binding of SU (VAR)3-9 and methylation of H3K9 and H3K27 in chromosomes of Drosophila melanogaster.</a> Chromosome Research. 19 (2), 235-249 (2011).</li>
<li>Cao, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+of+Histone+H3+Lysine+27+Methylation+in+Polycomb-Group+Silencing%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Role of Histone H3 Lysine 27 Methylation in Polycomb-Group Silencing.</a> Science. 298 (5595), 1039(2002).</li>
<li>Hines, K. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Domains+of+heterochromatin+protein+1+required+for+Drosophila+melanogaster+heterochromatin+spreading%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">Domains of heterochromatin protein 1 required for Drosophila melanogaster heterochromatin spreading.</a> Genetics. 182 (4), 967-977 (2009).</li>
<li>Elgin, S. C. R., Reuter, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Position-effect+variegation%2C+heterochromatin+formation%2C+and+gene+silencing+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harbor+Perspectives+in+Biology%22%5BJournal%5D)">Position-effect variegation, heterochromatin formation, and gene silencing in Drosophila.</a> Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 5 (8), 1-26 (2013).</li>
<li>Eissenberg, J. C., Elgin, S. C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((HP1a%3A+A+structural+chromosomal+protein+regulating+transcription%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Genetics%22%5BJournal%5D)">HP1a: A structural chromosomal protein regulating transcription.</a> Trends in Genetics. 30 (3), 103-110 (2014).</li>
<li>Meyer-Nava, S., Torres, A., Zurita, M., Valadez-graham, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+effects+of+dADD1+misexpression+in+chromatin+organization+and+transcription%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Molecular+and+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Molecular effects of dADD1 misexpression in chromatin organization and transcription.</a> BMC Molecular and Cell Biology. 2, 1-17 (2020).</li>
<li>Tennessen, J. M., Thummel, C. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Coordinating+growth+and+maturation+-+Insights+from+drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Biology%22%5BJournal%5D)">Coordinating growth and maturation - Insights from drosophila.</a> Current Biology. 21 (18), 750-757 (2011).</li>
<li>Cai, W., Jin, Y., Girton, J., Johansen, J., Johansen, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preparation+of+drosophila+polytene+chromosome+squashes+for+antibody+labeling%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Preparation of drosophila polytene chromosome squashes for antibody labeling.</a> Journal of Visualized Experiments. (36), 1-4 (2010).</li>
<li>Bainbridge, S. P., Bownes, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Staging+the+metamorphosis+of+Drosophila+melanogaster%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Embryology+and+Experimental+Morphology%22%5BJournal%5D)">Staging the metamorphosis of Drosophila melanogaster.</a> Journal of Embryology and Experimental Morphology. 66 (1967), 57-80 (1981).</li>
<li>Larson, A. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Liquid+droplet+formation+by+HP1%CE%B1+suggests+a+role+for+phase+separation+in+heterochromatin%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Liquid droplet formation by HP1α suggests a role for phase separation in heterochromatin.</a> Nature. 547 (7662), 236-240 (2017).</li>
<li>Larson, A. G., Narlikar, G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Role+of+Phase+Separation+in+Heterochromatin+Formation%2C+Function%2C+and+Regulation%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry%22%5BJournal%5D)">The Role of Phase Separation in Heterochromatin Formation, Function, and Regulation.</a> Biochemistry. 57 (17), 2540-2548 (2018).</li>
<li>Keenen, M. M., Larson, A. G., Narlikar, G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Visualization+and+Quantitation+of+Phase-Separated+Droplet+Formation+by+Human+HP1%CE%B1%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Enzymology%22%5BJournal%5D)">Visualization and Quantitation of Phase-Separated Droplet Formation by Human HP1α.</a> Methods in Enzymology. , (2018).</li>
<li>Lu, B. Y., Emtage, P. C., Duyf, B. J., Hilliker, aJ., Eissenberg, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Heterochromatin+protein+1+is+required+for+the+normal+expression+of+two+heterochromatin+genes+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">Heterochromatin protein 1 is required for the normal expression of two heterochromatin genes in Drosophila.</a> Genetics. 155 (2), 699-708 (2000).</li>
<li>Marsano, R. M., Giordano, E., Messina, G., Dimitri, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+New+Portrait+of+Constitutive+Heterochromatin%3A+Lessons+from+Drosophila+melanogaster%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Genetics%22%5BJournal%5D)">A New Portrait of Constitutive Heterochromatin: Lessons from Drosophila melanogaster.</a> Trends in Genetics. , (2019).</li>
<li>Strom, A. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phase+separation+drives+heterochromatin+domain+formation%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Phase separation drives heterochromatin domain formation.</a> Nature. 547 (7662), 241-245 (2017).</li>
<li>Sanulli, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((HP1+reshapes+nucleosome+core+to+promote+phase+separation+of+heterochromatin%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">HP1 reshapes nucleosome core to promote phase separation of heterochromatin.</a> Nature. 575 (7782), 390-394 (2019).</li>
<li>Dialynas, G., Delabaere, L., Chiolo, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Arp2%2F3+and+Unc45+maintain+heterochromatin+stability+in+Drosophila+polytene+chromosomes%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+Biology+and+Medicine%22%5BJournal%5D)">Arp2/3 and Unc45 maintain heterochromatin stability in Drosophila polytene chromosomes.</a> Experimental Biology and Medicine. 244 (15), 1362-1371 (2019).</li>
<li>Kolesnikova, T. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induced+decondensation+of+heterochromatin+in+drosophila+melanogaster+polytene+chromosomes+under+condition+of+ectopic+expression+of+the+supressor+of+underreplication+gene%5BTitle%5D)+AND+%22Fly%22%5BJournal%5D)">Induced decondensation of heterochromatin in drosophila melanogaster polytene chromosomes under condition of ectopic expression of the supressor of underreplication gene.</a> Fly. 5 (3), Austin. 181-190 (2011).</li>
<li>Bettinger, J. C., Lee, K., Rougvie, A. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stage-specific+accumulation+of+the+terminal+differentiation+factor+LIN-29+during+Caenorhabditis+elegans+development%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Stage-specific accumulation of the terminal differentiation factor LIN-29 during Caenorhabditis elegans development.</a> Development. 122 (8), 2517-2527 (1996).</li>
<li>Messina, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Yeti%2C+an+essential+Drosophila+melanogaster+gene%2C+encodes+a+protein+required+for+chromatin+organization%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Science%22%5BJournal%5D)">Yeti, an essential Drosophila melanogaster gene, encodes a protein required for chromatin organization.</a> Journal of Cell Science. 127 (11), 2577-2588 (2014).</li>
<li>Aguilar-Fuentes, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((p8%2FTTDA+overexpression+enhances+UV-irradiation+resistance+and+suppresses+TFIIH+mutations+in+a+Drosophila+trichothiodystrophy+model%5BTitle%5D)+AND+%22PLOS+Genetics%22%5BJournal%5D)">p8/TTDA overexpression enhances UV-irradiation resistance and suppresses TFIIH mutations in a Drosophila trichothiodystrophy model.</a> PLOS Genetics. 4 (11), 1-9 (2008).</li>
<li>Reynaud, E., Lomeli, H., Vazquez, M., Zurita, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Drosophila+melanogaster+Homologue+of+the+Xeroderma+Pigmentosum+D+Gene+Product+Is+Located+in+Euchromatic+Regions+and+Has+a+Dynamic+Response+to+UV+Light-induced+Lesions+in+Polytene+Chromosomes%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Biology+of+the+Cell%22%5BJournal%5D)">The Drosophila melanogaster Homologue of the Xeroderma Pigmentosum D Gene Product Is Located in Euchromatic Regions and Has a Dynamic Response to UV Light-induced Lesions in Polytene Chromosomes.</a> Molecular Biology of the Cell. 10 (4), 1191-1203 (1999).</li>
<li>Farkaš, R., Mechler, B. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+timing+of+Drosophila+salivary+gland+apoptosis+displays+an+I+%282%29gl-dose+response%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Death+%26+Differentiation%22%5BJournal%5D)">The timing of Drosophila salivary gland apoptosis displays an I (2)gl-dose response.</a> Cell Death & Differentiation. 7 (1), 89-101 (2000).</li>
<li>Zhang, P., Spradling, A. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Drosophila+salivary+gland+chromocenter+contains+highly+polytenized+subdomains+of+mitotic+heterochromatin%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">The Drosophila salivary gland chromocenter contains highly polytenized subdomains of mitotic heterochromatin.</a> Genetics. 139 (2), 659-670 (1995).</li>
<li>Stormo, B. M., Fox, D. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Polyteny%3A+still+a+giant+player+in+chromosome+research%5BTitle%5D)+AND+%22Chromosome+Research%22%5BJournal%5D)">Polyteny: still a giant player in chromosome research.</a> Chromosome Research. 25 (3-4), 201-214 (2017).</li>
</ol>

Die Autoren erklären, dass sie keine interessenkonflikte haben.

Die zelluläre Funktion eukaryotischer Organismen kann die 3D-Struktur innerhalb des Kerns definieren, die durch Wechselwirkungen zwischen verschiedenen Proteinen mit Chromatin und verschiedenen Molekülen einschließlich RNA unterstützt wird. In den letzten drei Jahren haben die biologischen Kondensate, die relevant waren, einschließlich Heterochromatin, eine grundlegende Rolle bei der Bestimmung der Phasentrennung gespielt, die die ausgeprägte nukleare räumliche Organisation von aktivem und repressivem Chromatin fördert <...

Seit den frühen Studien zu Emil Heitz1gilt Heterochromatin als wichtiger Regulator zellulärer Prozesse wie Genexpression, meiotische und mitotische Trennung von Chromosomen und die Aufrechterhaltung der Genomstabilität2,3,4.
Heterochromatin wird hauptsächlich in zwei Typen unterteilt: konstitutives Heterochromatin, das charakteristisch repetitive Sequenzen definiert, und transponierbare Elemente, die an bestimmten Chromosomenstellen wie den Telomeren und Zentromeren vorhanden sind. Diese Art von Heterochromatin wird hauptsächlich epigenetisch durch spezifische Histonmarkierungen wie die Di- oder Trimethylierung von Lysin 9 des Histons H3 (H3K9me3) und die Bindung des Heterochromatinproteins 1a (HP1a)5,6definiert. Auf der anderen Seite lokalisiert fakultatives Heterochromatin durch die Arme des Chromosoms und besteht hauptsächlich aus entwicklungsstillierten Genen7,8. Die Immunfärbung von Heterochromatinblöcken in Metaphasenzellen oder die Beobachtung von Heterochromatinaggregaten in Interphasenzellen hat viel Licht in das Verständnis der Bildung und Funktion heterochromatischer Regionenenthüllt 9.
Die Verwendung von Drosophila als Modellsystem hat die Entwicklung wesentlicher Werkzeuge zur Untersuchung von Heterochromatin ohne den Einsatz von Elektronenmikroskopie ermöglicht10. Seit der Beschreibung der Positionseffektvariegation und der Entdeckung von Heterochromatin-assoziierten Proteinen wie HP1a und histon-posttranslationalen Modifikationen haben viele Gruppen mehrere immunhistochemische Techniken entwickelt, die eine Visualisierung dieser heterochromatischen Regionen ermöglichen10,11.
Diese Techniken basieren auf der Verwendung spezifischer Antikörper, die Heterochromatin-assoziierte Proteine oder Histonmarkierungen erkennen. Für jeden Zelltyp und Antikörper müssen die Fixations- und Permeabilisationsbedingungen empirisch bestimmt werden. Die Bedingungen können auch variieren, wenn zusätzliche mechanische Verfahren wie Quetschtechniken verwendet werden. In diesem Protokoll beschreiben wir die Verwendung von Drosophila Speicheldrüsen zur Untersuchung heterochromatischer Herde. Speicheldrüsen haben polytenisierte Zellen, die mehr als 1.000 Kopien des Genoms enthalten, so dass eine verstärkte Ansicht der meisten Chromatinmerkmale, mit Ausnahme der Satelliten-DNA und einiger heterochromatischer Regionen, die unterrepliziert sind, möglich ist. Dennoch sind Heterochromatinregionen in Polytenchromosompräparaten leicht sichtbar, aber die Squashing-Techniken können manchmal charakteristische Chromatin-gebundene Komplexe oder die Chromatin-Architektur stören. Daher kann die Immunlokalisierung von Proteinen im gesamten Speicheldrüsengewebe diese unerwünschten Effekte übertreffen. Wir haben dieses Protokoll verwendet, um mehrere Chromatin-gebundene Proteine nachzuweisen, und wir haben gezeigt, dass dieses Protokoll in Kombination mit mutierten Drosophila-Beständen verwendet werden kann, um Heterochromatin-Störung zu untersuchen12.

<table><tbody><tr><td>1,5 mL Mikrozentrifugenröhrchen</td><td>Axygen MCT-150-C</td><td>11351904</td><td>Marke nicht kritisch</td></tr><tr><td>16 % Formaldehyd</td><td>Thermo Scientific</td><td>28908</td><td></td></tr><tr><td>AF1 Citifluor</td><td>Ted pella</td><td>19470</td><td>25 mL</td></tr><tr><td>BSA, Molekularbiologie Qualität</td><td>Roche</td><td>10735078001</td><td>Marke nicht kritisch</td></tr><tr><td>Vollständig, Proteaseinhibitoren Ultra EDTA Protease Inhibitoren</td><td>Merck</td><td>5892953001</td><td></td></tr><tr><td>Deckglas</td><td>Corning</td><td>CLS285022-200EA</td><td>22x22, Marke nicht kritisch</td></tr><tr><td>DTT</td><td>Sigma</td><td>d9779</td><td>Marke nicht kritisch</td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Sigma</td><td>E5134</td><td>Marke nicht kritisch</td></tr><tr><td>EGTA</td><td></td><td></td><td>Marke nicht kritisch</td></tr><tr><td>Objektträger</td><td>Goldsiegel</td><td>3011</td><td>Marke nicht kritisch</td></tr><tr><td>H3BO3</td><td>Baker</td><td>0084-01</td><td>Marke nicht kritisch</td></tr><tr><td>H3K9me3</td><td>Abcam</td><td>8889</td><td></td></tr><tr><td>HP1a</td><td>Hybridoma Bank</td><td>C1A9</td><td>Produktform&nbsp; Konzentrat 0,1 mL</td></tr><tr><td>KCl</td><td></td> Marke <td>Baker 3040-01</td><td>nicht kritisch</td></tr><tr><td>Methanol</td><td>Baker</td><td>9070-03</td><td>Marke nicht kritisch</td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Sigma</td><td>71376</td><td>Marke nicht kritisch</td></tr><tr><td>Marke NaOH</td><td></td><td></td><td>nicht kritisch</td></tr><tr><td>Marke PIPES</td><td></td><td></td><td>Marke nicht kritisch</td></tr><tr><td>Rotator</td><td>Thermo Scientific</td><td>13-687-12Q</td><td>&nbsp; Labquake Tube Shaker</td></tr><tr><td>Thermo Mixer C</td><td>Eppendorf</td><td>13527550</td><td>SmartBlock 1,5 mL</td></tr><tr><td>Tris</td><td>Milipore</td><td>648311</td><td>Marke nicht kritisch</td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma</td><td>T8787</td><td>100 mL, Marke nicht kritisch</td></tr><tr><td>&beta;-Mercaptoethanol</td><td>Bio-Rad</td><td>1610710</td><td>25 mL, Marke nicht kritisch</td></tr></tbody></table>

immunfluoreszierende färbung zur visualisierung von heterochromatin-assoziierten proteinen in drosophila speicheldrüsen

Immunofluorescent Staining for Visualization of Heterochromatin Associated Proteins in Drosophila Salivary Glands

Die Visualisierung von Heterochromatin-Aggregaten durch Immunfärbung kann eine Herausforderung sein. Viele Säugetierkomponenten von Chromatin sind in Drosophila melanogaster konserviert. Daher ist es ein ausgezeichnetes Modell, um die Bildung und Aufrechterhaltung von Heterochromatin zuuntersuchen. Polytenisierte Zellen, wie sie in Speicheldrüsen von Larven des dritten InstarS D. melanogaster gefunden werden, bieten ein hervorragendes Werkzeug, um das Chromatin fast tausendmal verstärkt zu beobachten, und haben es forschern ermöglicht, Veränderungen in der Verteilung von Heterochromatin im Kern zu untersuchen. Obwohl die Beobachtung von Heterochromatinkomponenten direkt in Polytenchromosompräparaten durchgeführt werden kann, kann die Lokalisation einiger Proteine durch die Schwere der Behandlung verändert werden. Daher ergänzt die direkte Visualisierung von Heterochromatin in Zellen diese Art von Studie. In diesem Protokoll beschreiben wir die für dieses Gewebe verwendeten Immunfärbungstechniken, die Verwendung sekundärer fluoreszierender Antikörper und die konfokale Mikroskopie, um diese Heterochromatinaggregate genauer und detaillierter zu beobachten.

Repräsentative Ergebnisse der HP1a-Immunfärbung in Drosophila-Speicheldrüsen sind in Abbildung 1 dargestellt. Ein positives Ergebnis ist die Beobachtung eines Brennpunktes (Abbildung 1a) (heterochromatisches Aggregat oder Kondensat). Ein negatives Ergebnis ist kein Signal oder ein dispergiertes Signal. Manchmal kann ein Doppelsignal beobachtet werden, dh mit einem Doppelpunkt (Abbildung 1c), aber es tritt normalerweise in k...

Dieses Protokoll zielt darauf ab, Heterochromatin-Aggregate in Drosophila-Polyten-Zellen zu visualisieren.

Immunfluoreszierende Färbung zur Visualisierung von Heterochromatin-assoziierten Proteinen in Drosophila Speicheldrüsen

Visualization of heterochromatin aggregates by immunostaining can be challenging. Many mammalian components of chromatin are conserved in Drosophila ...

Ziel dieses Protokolls ist es, Heterochromatin-Aggregate in Drosophila-Zellen zu visualisieren. Um dies zu erreichen, verwenden wir Polytenzellen, die sich in den Speicheldrüsen dritter Instar-Larven befinden Das Genom dieser Zellen wird fast tausendfach amplifiziert, und die Chromosomen erhalten die Eigenschaften von Grenzflächenzellen. Sie haben gut definierte Telomere und Brücken, die Chromozentrum genannt werden, in denen sich alle Zentromere aggregieren, und es ist hauptsächlich heterochromatisch.Mit dem dritten Instar-Larvengewebe können wir auch die Veränderung der heterochromatischen Aggregate im Hintergrund verschiedener genetischer Mutanten bewerten. Um die dritte Instar-Larvenkultur zu optimieren, müssen Sie zuerst 5 bis 10 Tage alte Erwachsene sammeln und etwa 50 in eine breite Halsflasche eines Standardmediums geben. 25 männlich und 25 weiblich.Stellen Sie die Flasche für 12 Stunden in einen Inkubator mit kontrollierter Temperatur bei 25 Grad Celsius. Nachdem die Inkubationszeit vorbei ist, entfernen Sie die Erwachsenen und übertragen Sie sie in eine neue Flasche, um den Vorgang zu wiederholen. Lassen Sie die Embryonen 22 Stunden lang bei 18 Grad Celsius wachsen.Stellen Sie für die Larvensammlung sicher, dass Sie die wandernden Larven wählen, die keine unverschämten Kugeln haben. Sezieren Sie 15 Paar Speicheldrüsen oder so viel wie möglich in 30 Minuten bei kaltem PBS mit Protesthemmern unter dem Mikroskop. Übertragen Sie die Speicheldrüsen in ein anderes Rohr mit eiskaltem PBS.Einmal mit kaltem PBS plus Protesthemmern waschen. Denken Sie daran, warten Sie immer, bis das Gewebe den Boden der Röhre erreicht hat. Nachdem Sie das PBS aus dem letzten Schritt entfernt haben, fügen Sie direkt 0,5 Milliliter eines Kaugummifixierungspuffers der X-Gruppe und 50% Methanol plus 2% Formaldehyd hinzu.Zwei Stunden bei vier Grad Celsius bei milder Rotation inkubieren. Führen Sie eine fünfminütige Rotationswäsche mit Tris-Triton-Puffer durch und fügen Sie einen Milliliter hinzu. Warten Sie immer, bis das Gewebe den Boden der Röhre erreicht hat.Hinweis: Warten Sie, bis das Gewebe den Boden der Röhre erreicht hat. Inkubieren Sie die Speicheldrüsen mit Tris-Triton, das gleiche wie oben, plus 1% Beta-Mercaptoethanol für zwei Stunden bei 37 Grad Celsius mit leichtem Schütteln. Mit BO3-Puffer waschen und mit BO3 plus 10 Millimolar DTT bei 37 Grad Celsius unter leichtem Schütteln 15 Minuten lang inkubieren.Führen Sie am Ende der Inkubationszeit eine Wäsche mit einem Milliliter BO3-Puffer allein durch. Inkubieren Sie die Speicheldrüsen in einem Milliliter Puffer B für zwei Stunden bei Raumtemperatur mit Rotation. Entfernen Sie alle Puffer B und fügen Sie Puffer A plus Antikörper von Interesse hinzu.In diesem Fall verwenden wir HP one, A C 1 8 9 von Iridium Bank. 1 zu 3.000 über Nacht bei vier Grad mit Rotation. An dieser Stelle ist wichtig, dass das Schütteln keine Blasen aufwirft, die den Antikörper schädigen könnten.Behandeln Sie die Behandlung nach 15 Minuten mit Puffer B, unter Rühren bei Raumtemperatur mit jeweils einem Millimeter. Die Drüsen werden zusammen mit dem sekundären Antibiotikapaar auf einen Boden übertragen, der für zwei Stunden unter Rotation bei vier Grad auf Puffer B bezogen wird. In diesem Schritt ist es wichtig, das Röhrchen mit Aluminiumpapierfolie abzudecken, um den sekundären Antikörper vor dem Licht zu schützen.Führen Sie 2x15-Minuten-Unterlegscheiben bei Raumtemperatur durch, während Sie mit einem Milliliter Puffer B drehen.Mit einem DNA-Marker wie Sydox oder OH in einem Milliliter Puffer B auflösen und in einem Milliliter Puffer B für 10 Minuten bei Raumtemperatur mit Rotation auflösen. Führen Sie eine Wäsche mit Puffer B und einmal mit PBS durch, wobei jede Wäsche 10 Minuten dauert, während Sie bei Raumtemperatur rotieren. Montieren Sie schließlich die Speicheldrüsen auf einer Rutsche und machen Sie einen Pool mit einem Abdeckungsrutsch.Legen Sie die Speicheldrüsen in die Mitte des Pools und bedecken Sie sie mit Sidiflor. Um eine Verformung der Blase zu vermeiden, wird die viskose Flüssigkeit überall hin ausgedehnt. Dann versiegeln Sie alle Dias mit klarem Nagellack.Unter einem Fluoreszenz- oder Konfokalmikroskop beobachten. Wenn die Probe nicht am selben Tag beobachtet wird, lagern Sie sie aus dem Licht bei vier Grad. Repräsentative Ergebnisse der HB1-Monofärbung in Drosophila-Speicheldrüsen sind in Abbildung eins dargestellt.Ein positives Ergebnis ist die Beobachtung eines Brennpunkts wie in A, atherochromatischem Aggregat oder Kondensat. Ein negatives Ergebnis ist kein Signal oder ein dispergiertes Signal. Manchmal kann ein Doppelsignal wie ein Doppelpunkt in C beobachtet werden, tritt aber normalerweise in kleineren Mengen auf.Um die Daten zu analysieren, können sie als Balkendiagramm dargestellt werden, wobei die Verteilung von HP1 mit verschiedenen mutanten Hintergründen verglichen wird. Zum Beispiel können wir in Abbildung zwei sehen, dass 98% der Kerne eine Verteilung von einem Punkt aufweisen. Und 2% von zwei Herden im Wildtyp.In der Mutante änderte sich der Anteil und das Vorhandensein von zwei Herden erhöhte sich auf 40%Abbildung drei zeigt repräsentative Trimethylierungslysin 9H3 bei Monofärbung. Ergebnis in Drosophila Speicheldrüsen beobachten einen Brennpunkt in B, es ist ein günstiges Ergebnis am chromatischen Aggregat oder Kondensat, ein Doppel- oder Dreifachsignal in C kann selten gesehen werden, aber in kleinen Mengen. Am Ende dieses Protokolls können Sie trotz Zustandsbeschränkungen ein diachromatisches Kondensat von HP1-Protein sehen, es wird ein guter erster Ansatz sein.

immunofluorescent-staining-for-visualization-heterochromatin

Research

Forschung

JoVE Journal

Biology

Biologie

Mesoscopic Fluoreszenz-Tomographie arbeitet darüber hinaus das Eindringen Grenzen der Gewebe-Schnitte Fluoreszenzmikroskopie. Die Technik basiert auf Multi-Projektion Beleuchtung und ein Photon Transport Beschreibung basiert. Wir zeigen in-vivo Ganzkörper-3D-Visualisierung der Morphogenese von GFP-exprimierenden Flügel Imaginalscheiben...

Mesoscopic Fluoreszenz-Tomographie für In-vivo Imaging der Entwicklungsländer Drosophila</em

Drosophila Puppenstadium Abdomen Immunhistochemie

Um zu verstehen, wie komplex Zelle Formen, wie neuronalen Dendriten, während der Entwicklung erreicht werden, ist es wichtig, in der Lage sein, genau Assay Mikrotubuli Organisation. Hier beschreiben wir eine robuste immunhistologische Markierung Methode, um Mikrotubuli Organisation von dendritischen Verzweigung Neuron sensorischen Dendriten, Luftröhre, Muskeln zu untersuchen, und...

Immunhistologische Markierung von Mikrotubuli in Sensory Neuron Dendriten, Tracheen und Muskeln in der Drosophila Larva Körperwand

Dieses Video zeigt die Immunfluoreszenzfärbung eines transgenen Drosophila-Gehirns für die Einzelzellbildgebung von Gliazellen. Das Gehirn exprimiert membrangesteuerte Proteine, die mit verschiedenen Kombinationen von antigenen Epitopen unter der Kontrolle eines glialspezifischen Rekombinasesystems fusioniert sind. Die isolierten und fixierten Gehirne werden mit primären Antikörpern gefärbt, die spezifisch für die antigenen Epitope sind, gefolgt von Fluorophor-konjugierten Sekundärantikörpern.

Immunfluoreszenzfärbung von Drosophila-Gehirnen für die Einzelzellbildgebung von Gliazellen

Imaging von zentrosomale Proteine ​​während der Drosophila Spermatogenese ist eine leistungsfähige Methode, um neue Proteine ​​von entscheidender Bedeutung für die Biologie Zentrosom zu identifizieren sowie die besondere Funktion der bekannten Akteure in diesem Prozess aufzuklären.

Imaging Zentrosomen in Fly Hoden

Verfahren zur Isolierung und Herstellung von Drosophila Hoden Proben (leben und fest) für die Bildgebung durch Phasenkontrast-und Fluoreszenzmikroskopie sind hierin beschrieben.

Die zytologische Analyse der Spermatogenese: Live-und Fest Zubereitungen aus<em&gt; Drosophila</em&gt; Hoden

Immunfärbung ist eine effektive Technik zur Visualisierung spezifischer Zelltypen und Proteine innerhalb von Geweben. Durch die Verwendung von Ultraschall verringert das hier beschriebene Protokoll die Notwendigkeit, Drosophila melanogaster-Gewebe von Embryonen und Larven im Spätstadium vor der Immunfärbung zu präparieren. Wir bieten eine effiziente Methodik für die Immunfärbung von Formaldehyd-fixierten Whole-Mount-Larven.

Beschallung-erleichtert Immunfluoreszenzfärbungen der Late-Stage embryonalen und Larven<em&gt; Drosophila</em&gt; Gewebe<em&gt; In-situ</em

Drosophila und Säugetieren hämatopoetischen Systeme haben viele gemeinsame Merkmale, Drosophila ein attraktives genetisches Modell machen Hämatopoese zu studieren. Hier zeigen wir Präparation und Lagerung des großen Larven hämatopoetischen Organ für die Immunhistochemie. Wir beschreiben Methoden auch verschiedene Larven hämatopoetischen Fächer einschließlich zirkulierenden Blutzellen und sessile-Zellen zu untersuchen.

Methoden, um die Lymphdrüsen und Blutzellen zu prüfen, die in<em&gt; Drosophila</em&gt; Larvae

Die beschriebenen RNA in Situ Hybridisierung Protokoll ermöglicht die Erkennung von RNA in ganze Drosophila Embryos oder seziert Gewebe. Mit 96-Well-Mikrotiterplatten und Tyramide Signalverstärkung, können Protokolle mit hoher Auflösung, Empfindlichkeit und Durchsatz und bei relativ geringen Kosten erkannt werden.

Hochauflösender Fluoreszenz In Situ Hybridisierung in Drosophila Embryos und Gewebe mit Tyramide Signalverstärkung

Wir präsentieren hier ein verbessertes Protokoll für die Ganzkörperpräparation und Immunfärbung von Drosophila-Hoden, das für die konfokale Mikroskopie geeignet ist und auch eine reproduzierbare und zuverlässige Markierung ermöglicht. Wir veranschaulichen dieses Protokoll durch 3D-Darstellung und Quantifizierung von Kolokalisierungsexperimenten an den großen S4-S5-Spermatozyten.

Immunfärbung von Drosophila-Hoden für die konfokale 3D-Analyse großer Spermatozyten

Diese Protokolle beschreiben, wie die Organisation und Okklusionsfunktion plissierter Septatenübergänge in Kontroll- und mutanten-embryonalem Epithel von Drosophila charakterisiert werden kann.

Immunfärbungs- und Farbstoffpenetrationsexperimente zur Definition von Kern-Plezier-Septaten-Übergangsproteinen in Drosophila-embryonalen Epitheln

Lernen Sie immunfluoreszente Färbung zur Visualisierung von Heterochromatin-Aggregaten in Drosophila-Speicheldrüsen. Diese Methode ermöglicht die Analyse chromatindynamischer Veränderungen in verschiedenen genetischen Hintergründen.

Immunfluoreszierende Färbung zur Visualisierung von Heterochromatin-assoziierten Proteinen in Drosophila Speicheldrüsen

Weitere Videos entdecken