Name: Überwachung des dynamischen Wachstums von Netzhautgefäßen im sauerstoffinduzierten Retinopathie-Mausmodell (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-04-02T14:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 32 s
Description: Erfahren Sie die Präparation und Immunfluoreszenzfärbung von Netzhaut-Flatmounts aus Mäusen zur Beobachtung dynamischer Gefäßveränderungen im Modell der sauerstoffinduzierten Retinopathie.

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Wir danken allen Mitgliedern unseres Labors und des Augentierlabors des Zhongshan Ophthalmic Center für ihre technische Unterstützung. Wir danken auch Prof. Chunqiao Liu für die experimentelle Unterstützung. Diese Arbeit wurde durch Zuschüsse der National Natural Science Foundation of China (NSFC: 81670872; Peking, China), die Naturwissenschaftliche Stiftung der Provinz Guangdong, China (Fördernummer 2019A1515011347) und ein hochrangiges Krankenhausbauprojekt des State Key Laboratory of Ophthalmology am Zhongshan Ophthalmic Center (Grant No. 303020103; Guangzhou, Provinz Guangdong, China).

Die Autoren haben nichts offenzulegen.

Die Anfälligkeit von Mäusen für OIR wird von vielen Faktoren beeinflusst. Die Welpen mit unterschiedlichem genetischen Hintergrund und Stämmen können nicht verglichen werden. Bei BALB/c-Albino-Mäusen wachsen die Gefäße schnell wieder in den VO-Bereich mit signifikant reduzierten neovaskulären Büscheln38 ein, was der Forschung einige Schwierigkeiten bereitet. Bei C57BL/6-Mäusen kommt es im Vergleich zum BALB/cJ-Mausstamm39,40 zu erhöhten Ph...

Die retinale Neovaskularisation (RNV), definiert als ein Zustand, in dem neue pathologische Gefäße aus bestehenden Netzhautvenen entstehen, erstreckt sich normalerweise entlang der inneren Oberfläche der Netzhaut und wächst in den Glaskörper (oder unter bestimmten Bedingungen subretinalen Raum)1. Es ist ein Kennzeichen und gemeinsames Merkmal vieler ischämischer Retinopathien, einschließlich Frühgeborenenretinopathie (ROP), Netzhautvenenverschluss (RVO) und proliferativer diabetischer Retinopathie (PDR)2.
Zahlreiche klinische und experimentelle Beobachtungen haben gezeigt, dass Ischämie die Hauptursache für die retinale Neovaskularisation ist 3,4. Bei ROP werden Neugeborene in geschlossenen Inkubatoren hohem Sauerstoff ausgesetzt, um die Überlebensraten zu erhöhen, was auch ein wichtiger Treiber für den Stopp des Gefäßwachstums ist. Nach Abschluss der Behandlung erleben die Netzhäute von Neugeborenen eine relativ hypoxische Periode5. Andere Situationen werden bei der Okklusion von zentralen oder verzweigten Netzhautvenen bei RVO beobachtet, und es wird auch eine Schädigung der Netzhautkapillaren beobachtet, die durch Mikroangiopathie bei PDR2 verursacht wird. Hypoxie erhöht weiter die Expression von angiogenen Faktoren wie dem vaskulären endothelialen Wachstumsfaktor (VEGF) durch den Hypoxie-induzierten Faktor-1α (HIF-1α)-Signalweg, der wiederum vaskuläre Endothelzellen dazu bringt, in den hypoxischen Bereich zu wachsen und neue Gefäße zu bilden 6,7.
ROP ist eine Art vaskuläre proliferative Retinopathie bei Frühgeborenen und eine Hauptursache für Erblindung im Kindesalter8,9, die durch Netzhauthypoxie, retinale Neovaskularisation und fibröse Hyperplasie gekennzeichnet ist10,11,12. In den 1950er Jahren fanden Forscher heraus, dass eine hohe Sauerstoffkonzentration die Atemwegssymptome von Frühgeborenen signifikant verbessern kann13,14. Infolgedessen wurde die Sauerstofftherapie damals vermehrt bei Frühgeborenen eingesetzt15. Gleichzeitig mit der weit verbreiteten Anwendung der Sauerstofftherapie bei Frühgeborenen stieg die Inzidenz von ROP jedoch von Jahr zu Jahr an. Seitdem haben Forscher Sauerstoff mit ROP verknüpft und verschiedene Tiermodelle untersucht, um die Pathogenese von ROP und RNV16 zu verstehen.
Beim Menschen ist der größte Teil der Entwicklung des retinalen Gefäßsystems vor der Geburt abgeschlossen, während sich bei Nagetieren das retinale Gefäßsystem nach der Geburt entwickelt und ein zugängliches Modellsystem zur Untersuchung der Angiogenese im retinalen Gefäßsystem bietet2. Mit dem kontinuierlichen Fortschritt der Forschung sind sauerstoffinduzierte Retinopathie-Modelle (OIR) zu wichtigen Modellen für die Nachahmung der pathologischen Angiogenese infolge von Ischämie geworden. Es gibt keine spezifischen Tierarten in der Studie des OIR-Modells und das Modell wurde in verschiedenen Tierarten entwickelt, darunter Kätzchen 17, Ratte18, Maus19, Beagle-Welpe 20 und Zebrafisch21. Alle Modelle teilen den gleichen Mechanismus, durch den sie während der frühen Netzhautentwicklung Hyperoxie ausgesetzt sind und dann in die normoxische Umgebung zurückkehren. Smith et al. beobachteten, dass die Exposition von Mäusewelpen gegenüber Hyperoxie von P7 für 5 Tage eine extreme Form der Gefäßregression in der zentralen Netzhaut induzierte und sie bei P12 zurück in die Raumluft brachte und allmählich neovaskuläre Büschel auslöste, die in Richtung des Glaskörperswuchsen 19. Dies war ein standardisiertes OIR-Mausmodell, das auch als Smith-Modell bezeichnet wurde. Connor et al. optimierten das Protokoll weiter und stellten 2009 eine universell anwendbare Methode zur Quantifizierung des Bereichs von VO (Vaso-Obliteration) und NV (Neovaskularisation) zur Verfügung, was die Akzeptanz und Nutzung des Modells22 erhöhte. Das OIR-Mausmodell ist aufgrund seiner geringen Größe, der schnellen Fortpflanzung, des klaren genetischen Hintergrunds, der guten Wiederholbarkeit und der hohen Erfolgsrate immer noch das am weitesten verbreitete Modell.
Bei Mäusen beginnt die retinale Vaskularisation nach der Geburt mit dem Einwachsen von Gefäßen vom Sehnervenkopf in die innere Netzhaut in Richtung Ora serrata. Während der normalen Netzhautentwicklung sprießen die ersten Netzhautgefäße um die Geburt herum aus dem Sehnervenkopf und bilden ein expandierendes Netzwerk (den primären Plexus), das die Peripherie um den postnatalen Tag 7(P7)23 erreicht. Dann beginnen die Gefäße in die Netzhaut zu wachsen, um eine tiefe Schicht zu bilden, die Netzhaut zu durchdringen und ein laminares Netzwerk um die innere Kernschicht (INL) zu bilden, wie beim Menschen24. Am Ende der dritten postnatalen Woche (P21) ist die tiefere Plexusentwicklung fast abgeschlossen. Für das OIR-Mausmodell tritt ein Gefäßverschluss immer in der zentralen Netzhaut auf, da während der Hyperoxie-Exposition eine große Anzahl unreifer Gefäßnetzwerke in der zentralen Region schnell degeneriert wird. So tritt das Wachstum der pathologischen Neovaskularisation auch in der mittleren peripheren Netzhaut auf, die die Grenze zwischen dem Nicht-Perfusionsbereich und dem vaskulären Bereich darstellt. Menschliche Netzhautgefäße haben sich jedoch fast vor der Geburt gebildet. Bei Frühgeborenen ist die periphere Netzhaut nicht vollständig vaskularisiert, wenn sie Hyperoxieausgesetzt ist 25,26. So treten Gefäßverschlüsse und Neovaskularisation hauptsächlich in der peripheren Netzhaut auf27,28. Trotz dieser Unterschiede rekapituliert das OIR-Modell der Maus die pathologischen Ereignisse, die während der Ischämie-induzierten Neovaskularisation auftreten.
Die Induktion des OIR-Modells kann in zwei Phasenunterteilt werden 29: In Phase 1 (Hyperoxie-Phase) wird die retinale Gefäßentwicklung durch Okklusion und Rückbildung der Blutgefäße infolge des Rückgangs von VEGF und der Apoptose von Endothelzellen gestoppt oder verzögert24,30; In Phase 2 (Hypoxiephase) wird die retinale Sauerstoffversorgung unter Raumluftbedingungenunzureichend 29, was für die neuronale Entwicklung und Homöostase essentiell ist19,31. Diese ischämische Situation führt normalerweise zu einer unregulierten, abnormalen Neovaskularisation.
Derzeit ist die häufig verwendete Modellierungsmethode die abwechselnd hohe / niedrige Sauerstoffexposition: Mütter und ihre Welpen werden 5 Tage lang bei P7 75% Sauerstoff ausgesetzt, gefolgt von 5 Tagen in Raumluft, bis P17 vergleichbare Ergebnisse zeigte22, was der Endpunkt der OIR-Mausmodellinduktion ist. (Abbildung 1). Neben der Simulation von ROP kann diese ischämievermittelte pathologische Neovaskularisation auch zur Untersuchung anderer ischämischer Netzhauterkrankungen verwendet werden. Die Hauptmessungen dieses Modells umfassen die Quantifizierung der Fläche von VO und NV, die von retinalen flachen Montierungen durch Immunfluoreszenzfärbung oder FITC-Dextranperfusion analysiert werden. Jede Maus kann wegen der tödlichen Operation nur einmal untersucht werden. Derzeit gibt es nur wenige Methoden, um dynamische Veränderungen des Netzhautgefäßsystems während des Prozesses der vaskulären Regression und pathologischen Angiogenese kontinuierlich zu beobachten32. In diesem Artikel bieten wir ein detailliertes Protokoll der OIR-Modellinduktion, die Analyse von retinalen flachen Mounts sowie einen Workflow der Fluoresceinfundusangiographie (FFA) an Mäusen, die hilfreich wären, um ein umfassenderes Verständnis der vaskulären dynamischen Veränderungen während zweier Phasen des OIR-Mausmodells zu erlangen.

<table><tbody><tr><td>1 mL sterile Spritze</td><td>Solarbio</td><td>YA0550</td><td>Zur Vorbereitung von retinalen Flat Mounts und intraperitonealen Injektionen</td></tr><tr><td>1&mal; Phosphatgepufferte Kochsalzlösung (PBS)</td><td>Transgen Biotech</td><td>&nbsp; FG701-01</td><td>Für die Präparation von Retina Flat Mounts</td></tr><tr><td>2 ml Mikrozentrifugenröhrchen</td><td>Corning</td><td>MCT-200-C</td><td>Für die Präparation von Retina Flat Mounts</td></tr><tr><td>48 Well Clear TC-Treated Multiple Well Plates</td><td>Corning</td><td>3548</td><td>Für die Präparation von Retina Flat</td></tr><tr><td>Mounts Selbstklebende Objektträger</td><td>Verschiedenes</td><td></td><td>Für die Präparation von Retina Flat Mounts</td></tr><tr><td>Adobe Photoshop CC 2019</td><td>Adobe Inc.</td><td></td><td>Für die Bildanalyse</td></tr><tr><td>Kohlendioxidgas</td><td>Verschiedenes</td><td></td><td>Für das Opfer</td></tr><tr><td>Objektträger</td><td>Verschiedenes</td><td></td><td>Für die Präparation von retinalen flachen Halterungen</td></tr><tr><td>Gebogene Pinzetten</td><td>World Precision Instruments</td><td>14127</td><td>Für die Präparation von retinalen flachen Halterungen</td></tr><tr><td>DAPI-Färbelösung</td><td>Abcam</td><td>ab228549</td><td>Für die Markierung von Zellkernen auf retinalen flachen Halterungen</td></tr><tr><td>Präpariermikroskop</td><td>Olmpus</td><td>SZ61</td><td>Für die Präparation von Retinal Flat Mounts</td></tr><tr><td>Fluorescein-Natrium</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F6377</td><td>Für in vivo</td></tr><tr><td>Bildgebung Fluoreszenzmikroskop</td><td>&nbsp; Zeiss</td><td>AxioImager.Z2</td><td>Für die Aufnahme von Fluoreszenzbildern von Netzhaut-Flachhalterungen</td></tr><tr><td>Fluoromount-G Eindeckmedien</td><td>SüdenBiotech</td><td>&nbsp; 0100-01</td><td>Zur Präparation von retinalen flachen Halterungen</td></tr><tr><td>Hydroxypropylmethylcellulose</td><td>Maya</td><td>89161</td><td>Für die in vivo Bildgebung</td></tr><tr><td>Isolectin B4 594 Antikörper</td><td>Invitrogen</td><td>I21413</td><td>Zur Markierung von retinalen Gefäßen auf retinalen flachen</td></tr><tr><td>Halterungen Mäuse C57/BL6J</td><td>GemPharmatech aus der Provinz</td><td></td> Jiangsu <td>Für die Induktion von OIR-Modellen</td></tr><tr><td>Mikrodissektion Schere-gerade</td><td>Klinge World Precision Instruments</td><td>503242</td><td>Zur Vorbereitung von Netzhaut-Flachpinnetten</td></tr><tr><td>Nr.4 gerade Pinzetten</td><td>World Precision Instruments</td><td>&nbsp; 501978-6</td><td>Zur Vorbereitung von retinalen flachen Halterungen</td></tr><tr><td>Normales Eselsserum</td><td>Abcam</td><td>ab7475</td><td>Zur Vorbereitung von retinalen flachen Halterungen</td></tr><tr><td>O2 Sensor</td><td>Verschiedenes</td><td></td><td>Zur Überwachung des O2</td></tr><tr><td>OxyCycler</td><td>Biospherix</td><td>A84XOV</td><td>Für die Induktion von OIR-Modellen</td></tr><tr><td>Paraformaldehyd (PFA)</td><td>Sigma</td><td>P6148-1KG</td><td>Zur Gewebefixierung</td></tr><tr><td>Pentobarbital-Natrium</td><td>Verschiedenes</td><td></td><td>Für die Anästhesie</td></tr><tr><td>Natronkalk</td><td>Verschiedenes</td><td></td><td>Zur Aufnahme von überschüssigem CO2 in der Sauerstoffkammer</td></tr><tr><td>SPECTRALIS HRA+OCT</td><td>Heidelberg</td><td>HC00500002</td><td>Für in vivo Bildgebung</td></tr><tr><td>SPSS Statistics 22.0</td><td>IBM</td><td></td><td>Für statistische Analysen</td></tr><tr><td>Tansference Decloring</td><td>Shaker Kylin-Bell</td><td>ZD-2008</td><td>Zur Vorbereitung von Retina Flat Mounts</td></tr><tr><td>Gewebekulturschale (Low Attachment)</td><td>Corning</td><td>3261-20EA</td><td>Zur Aufbereitung von Retina Flat Mounts</td></tr><tr><td>Transfer Pipetten Verschiedenes</td><td></td><td></td><td>Zur Aufbereitung von Retina Flat Mounts</td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma-Aldbsp</td><td>; SLBW6818</td><td>Für die Präparation von Retina Flat Mounts</td></tr><tr><td>Tropicamid</td><td>Verschiedenes</td><td></td><td>Für die in vivo Bildgebung</td></tr><tr><td>ZEN Imaging Software</td><td>ZEISS</td><td></td><td>Für die Bilderfassung und den Export</td></tr></tbody></table>

Überwachung des dynamischen wachstums von netzhautgefäßen im sauerstoffinduzierten retinopathie-mausmodell

Monitoring Dynamic Growth of Retinal Vessels in Oxygen-Induced Retinopathy Mouse Model

Sauerstoff-induzierte Retinopathie (OIR) wird häufig verwendet, um abnormales Gefäßwachstum bei ischämischen Netzhauterkrankungen zu untersuchen, einschließlich Frühgeborenen-Retinopathie (ROP), proliferativer diabetischer Retinopathie (PDR) und Netzhautvenenverschluss (RVO). Die meisten OIR-Studien beobachten eine retinale Neovaskularisation zu bestimmten Zeitpunkten; Das dynamische Gefäßwachstum bei lebenden Mäusen entlang eines Zeitverlaufs, das für das Verständnis der OIR-bedingten Gefäßerkrankungen unerlässlich ist, wurde jedoch zu wenig untersucht. Hier beschreiben wir ein Schritt-für-Schritt-Protokoll für die Induktion des OIR-Mausmodells, heben die potenziellen Fallstricke hervor und bieten eine verbesserte Methode zur schnellen Quantifizierung von Bereichen der Vasoobliteration (VO) und Neovaskularisation (NV) mittels Immunfluoreszenzfärbung. Noch wichtiger ist, dass wir das Nachwachsen von Gefäßen bei lebenden Mäusen von P15 bis P25 überwachten, indem wir eine Fluoresceinfundusangiographie (FFA) im OIR-Mausmodell durchführten. Die Anwendung von FFA auf das OIR-Mausmodell ermöglicht es uns, den Umbauprozess während des Nachwachsens von Gefäßen zu beobachten.

Im OIR-Mausmodell ist das wichtigste und grundlegendste Ergebnis die Quantifizierung des VO- und NV-Bereichs. Nach 5 Tagen in der Hyperoxie-Umgebung von P7 zeigte die zentrale Netzhaut der Welpen den größten Nicht-Perfusionsbereich. Unter der Stimulation der Hypoxie in weiteren 5 Tagen wurde allmählich eine retinale Neovaskularisation erzeugt, die intensiver fluoreszierte als die umgebenden normalen Gefäße. Nach P17 bildete sich das Fluoreszenzsignal der pathologischen Neovaskularisation schnell als Umbau der Netzhaut zu...

Dieses Protokoll beschreibt eine detaillierte Methode zur Herstellung und Immunfluoreszenzfärbung von Netzhaut-Flachhalterungen und Analysen von Mäusen. Auch die Verwendung der Fluoresceinfundusangiographie (FFA) bei Mäusewelpen und die Bildverarbeitung werden ausführlich beschrieben.

Überwachung des dynamischen Wachstums von Netzhautgefäßen im sauerstoffinduzierten Retinopathie-Mausmodell

Oxygen-induced retinopathy (OIR) is widely used to study abnormal vessel growth in ischemic retinal diseases, including retinopathy of prematurity (ROP), ...

Dieses Protokoll kann Forschern helfen, die Netzhaut von Mäusen leicht zu trennen und die dynamischen Veränderungen im Netzhautgefäßsystem des OIR-Mausmodells zu beobachten. Die Hauptvorteile dieser Methode sind die Erhaltung der Integrität der abgetrennten Netzhaut und die Möglichkeit, dass jede Maus als eigene Kontrolle dienen kann, was die Ergebnisse vergleichbarer macht. Forscher, die diese Methode zum ersten Mal ausprobieren, können bei der Aufnahme der fünf Orientierungsbilder Schwierigkeiten haben, da es etwas schwierig ist, Welpen in die richtige Position zu bringen.Um das Gewebe für die gesamte Netzhautmontage zu sammeln, trennen Sie die Augäpfel mit einer gebogenen Schere vom Orbitalgewebe eines eingeschläferten C57-Black/6-Welpen. Führen Sie dann gekrümmte Pinzetten in den hinteren Teil des Augapfels ein, klemmen Sie den Sehnerv und heben Sie das Auge schnell aus der Augenhöhle. Legen Sie die Augäpfel in vorgekühltes PBS, um Haare und Blut von der Oberfläche zu entfernen.Wenn alle Augäpfel gesammelt wurden, geben Sie die gereinigten Augäpfel in ein Zwei-Milliliter-Mikrozentrifugenröhrchen, das 4% Paraformaldehyd enthält, und inkubieren Sie für 15 Minuten bei Raumtemperatur und 12 bis 15 Umdrehungen pro Minute. Fügen Sie am Ende der Inkubation einen Tropfen PBS in die Mitte einer Kulturschale unter einem Seziermikroskop hinzu und legen Sie einen Augapfel in den Tropfen. Halten Sie den Augapfel mit einer Pinzette fest und verwenden Sie eine Ein-Milliliter-Spritzennadel, um die Hornhaut am Hornhautlimbus vorsichtig zu punktieren.Führen Sie die Spitze einer Schere in die Punktion ein und schneiden Sie die Hornhaut entlang des Hornhautlimbus, wobei Sie darauf achten, die Netzhaut nicht zu schneiden. Verwenden Sie eine Pinzette, um die Iris und die Linse zu entfernen, und legen Sie die verbleibende Augenmuschel in 4% Paraformaldehyd für eine 45-minütige Inkubation bei Raumtemperatur auf den Shaker. Am Ende der Inkubation legen Sie die feste Augenmuschel in einen frischen Tropfen PBS in der Mitte einer neuen Kulturschale.Halten Sie die Augenmuschel mit einer Pinzette und verwenden Sie eine zweite Pinzette, um die Netzhaut- und Skleraschichten sanft zu trennen. Legen Sie die Spitze der Schere zwischen die Netzhaut und die Skleraschichten und schneiden Sie die Sklera in Richtung Sehnerv. Ziehen Sie die Sklera von der Netzhaut ab, um die Netzhautschale zu erhalten.Lösen Sie mit einer Pinzette die Verbindung zwischen den radialen hyaloidalen Gefäßen und der peripheren Netzhaut. Verwenden Sie eine Zwei-Milliliter-Pipette mit abgeschnittener Spitze, um den Netzhautbecher in eine Vertiefung einer 48-Well-Platte für drei fünfminütige Wäschen bei Raumtemperatur PBS auf dem Shaker zu überführen. Nach dem letzten Waschgang den Becher in 1% Triton X-100 und 5% normalem Eselserum in PBS über Nacht bei vier Grad Celsius inkubieren.Um das retinale Gefäßsystem mit Isolectin B4 zu markieren, inkubieren Sie die Netzhaut in einer Vertiefung einer 48-Well-Platte in 400 Mikrolitern 0,1% normalem Eselserum, ergänzt mit Isolectin B4-594, über Nacht bei 4 Grad Celsius auf einem Shaker. Bei Bedarf kann gleichzeitig ein weiterer primärer Antikörper zugegeben werden. Am nächsten Tag waschen Sie die Netzhaut mit drei 20-minütigen Wäschen in 0,1% PBST auf dem Shaker.Nach dem letzten Waschgang inkubieren Sie die Netzhaut mit einem geeigneten hochaffinen sekundären Antikörper für eine Stunde bei Raumtemperatur, bevor Sie die Probe für 20 bis 25 Minuten mit DAPI markieren. Am Ende der Inkubation waschen Sie die Netzhaut mit drei 30-minütigen Wäschen in 0,1% PBST bei Raumtemperatur mit Schütteln. Nach der letzten Wäsche den Netzhautbecher mit der Öffnung nach oben auf einen sauberen Objektträger geben und die Netzhaut mit dem Mikroskop radial an den Positionen drei, sechs, neun und 12 Uhr von der Peripherie in Richtung Mitte schneiden, bis zu einem bis 1,5 Millimeter vom Sehnervenkopf entfernt.Spülen Sie die Netzhaut dreimal mit ein paar Tropfen PBS pro Waschgang, bevor Sie mit luftgelegtem Papier die Netzhaut trocknen und glätten. Fügen Sie einen Tropfen Montagemedium in die Mitte des Deckglases hinzu, bis der Durchmesser des Tröpfchens die Hälfte des Deckglases bedeckt. Legen Sie dann schnell das Deckglas, das mit der mittleren Seite nach unten montiert wird, auf die ausgebreitete Netzhaut.Sobald alle Netzhaut-Flachhalterungen vorbereitet sind, können die Proben durch konfokale Fluoreszenzmikroskopie abgebildet werden. Für die In-vivo-Bildgebung fügen Sie 20 Mikroliter mydriatische Augentropfen hinzu, um eine lang anhaltende Pupillenerweiterung zu erreichen. Nach fünf Minuten legen Sie die Welpen in eine stabile Position auf einem kleinen Heizkissen vor dem Bildgebungsgerät.Um die Feuchtigkeit in den Hornhäuten zu erhalten, fügen Sie während des Bildgebungsverfahrens regelmäßig künstliche Tränen hinzu. Klicken Sie anschließend auf Infrarot-Fundusbildgebung auf dem Gerät, um den Sehnervkopf in die Mitte des Bildschirms einzustellen. Injizieren Sie intraperitoneal 150 Mikroliter 0,5% Fluorescein-Natriumsalzlösung und klicken Sie sofort auf die FA- und Injektionstasten auf dem Touchpanel des Bildgebungsgeräts, um den Timer zu starten.Nach drei Minuten, wenn die Durchblutung der Netzhaut in die venöse Phase eingetreten ist, erhalten Sie das erste Bild der zentralen Netzhaut. Bewegen Sie die Linse des Bildgebungsgeräts horizontal zur nasalen Seite des Auges, bis sich der Sehnervenkopf in der Mitte einer Seite des Bildaufnahmebereichs befindet, und nehmen Sie das zweite Bild auf. Bewegen Sie das Objektiv weiter und nehmen Sie Bilder der temporalen, oberen und unteren Netzhaut auf die gleiche Weise auf.Um die Netzhautbilder in einem geeigneten Bildbearbeitungsprogramm zu verarbeiten, öffnen Sie das Menü Datei und klicken Sie auf Neu, um eine neue Leinwand mit schwarzem Hintergrund zu erstellen. Öffnen Sie das Bild der zentralen Netzhaut. Klicken Sie dann auf Datei, um ein zweites Bild hinzuzufügen.Stellen Sie die Deckkraft des zweiten Bildes auf 60% ein und verschieben und skalieren Sie das Bild, bis sich die beiden Bilder überlappen. Klicken Sie auf Zwischen freiem Transformations- und Warp-Modus wechseln und nehmen Sie bei Bedarf subtile Anpassungen an den Gefäßen vor. Stellen Sie dann die Deckkraft des zweiten Bildes wieder auf 100 % einWählen Sie beide Bilder aus und klicken Sie auf Ebenen automatisch überblenden.Aktivieren Sie Panorama als Mischmethode und aktivieren Sie auch die Kontrollkästchen für Nahtlose Töne und Farben und inhaltsbewusste Fülltransparentbereiche. Klicken Sie auf OK, um das Zusammenfügen der ersten beiden Bilder abzuschließen. Fügen Sie als Nächstes das dritte Bild hinzu und fügen Sie dieses Bild wie gezeigt zu den ersten beiden Bildern zusammen, bis alle fünf Bilder von einer einzelnen Netzhaut zusammengefügt wurden.Wenn alle Bilder aus der Analyse verarbeitet wurden, verwenden Sie das Zuschneidewerkzeug, um die FFA-Bilder auf eine einheitliche Größe zuzuschneiden, um die Beobachtung der Veränderungen der retinalen Gefäßdynamik zu verschiedenen Entwicklungszeitpunkten zu erleichtern. Nach fünf Tagen Exposition gegenüber Hyperoxie zeigen die zentralen Netzhäute der postnatalen Welpen des 12. Tages einen großen Nicht-Perfusionsbereich. Nach dem Übergang zu fünf Tagen hypoxischer Bedingungen neovaskularisieren die Netzhäute allmählich und zeigen einen Anstieg des Fluoreszenzsignals, der stärker ist als in den umgebenden normalen Gefäßen.Nach dem postnatalen Tag 17 bildet sich die pathologische Neovaskularisation schnell zurück und die Netzhaut zeigt am postnatalen Tag 25 ein völlig normales Aussehen. Eine gute Wiederholbarkeit und Stabilität des sauerstoffinduzierten Retinopathiemodells kann durch die Kontrolle der Wurfgröße und der postnatalen Gewichtszunahme der Welpen erreicht werden. Wie beobachtet, erreicht die Vasobliteration typischerweise am postnatalen Tag 12 ihren Höhepunkt und verschwindet am postnatalen Tag 25, während die Neovaskularisation am postnatalen Tag 17 ihren Höhepunkt erreicht und sich am postnatalen Tag 25 zurückbildet.Bei postnatalen Mäusen am 15. bis 25. Tag der Sauerstoff-induzierten Retinopathie nimmt der Durchmesser der retinalen Blutgefäße zu und wird im Vergleich zu der Netzhaut normaler Mäuse stark quälend. Die Pinzette in der linken Hand spielt hauptsächlich eine unterstützende Rolle. Achten Sie darauf, den Augapfel nicht zu quetschen, da er sich verformen oder reißen kann.

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Forschung

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