Effizientes Fragment-Screening in der XChem-Anlage an der Diamond Light Source
29. Mai 2021
Dieser Artikel beschreibt den kompletten XChem-Prozess für kristallbasiertes Fragment-Screening, beginnend mit der Beantragung des Zugangs und allen nachfolgenden Schritten bis hin zur Datenverbreitung.
Die XChem-Anlage an der Diamond Light Source bietet ein routinemäßiges, großflächiges Kristall-Grafik-Fragment-Screening, das den gesamten Prozess der Kristallabscheidung unterstützt. Die Röntgenkristallographie ist ein wesentlicher Bestandteil des FBDD-Toolkits. Es ist empfindlich genug, um schwache Bindemittel zu identifizieren und liefert direkt strukturelle Informationen über die Wechselwirkungen auf molekularer Ebene.
Die fragmentbasierte Wirkstoffforschung ist eine weit verbreitete Strategie für die Entdeckung von Leitstrukturen. Das Unternehmen hat sechs Medikamente für den klinischen Einsatz geliefert und mehr als 50 Moleküle wurden in klinische Studien überführt. Die Auswirkungen der Fortschritte und der Effizienz, die die XChem-Plattform im Vergleich zu herkömmlichen Einweichmethoden, Datenerfassungs- und Analysemethoden bietet, lassen sich am besten visuell veranschaulichen.
Beginnen Sie mit der Auswahl der Kristalle und der Position der Verbindung. Öffnen Sie TextRank auf einem PC und wählen Sie das Kristallfach aus, entweder aus der Liste unten rechts oder indem Sie den Barcode in das Feld oben links eingeben. Wählen Sie das richtige Bildformat und die einzelne Well-Ansicht aus.
Um Lösungsmittel oder Verbindungen zu einem Tropfen hinzuzufügen, ohne den Kristall zu treffen, klicken Sie mit der rechten Maustaste innerhalb des Tropfens, aber weg vom Kristall, wenn ein geeigneter Kristall für ein Experiment gefunden wird, während Sie sich durch die Tropfenbilder bewegen. Öffnen Sie die Echo-Software und wählen Sie Neu aus, um Lösungen mit dem akustischen Spender zu dosieren. Wählen Sie die richtige Quellwellenplatte und die richtige Flüssigkeitsklasse.
Stellen Sie sicher, dass der richtige Plattentyp als Zielplatte ausgewählt ist. Aktivieren Sie dann das benutzerdefinierte Kontrollkästchen und fahren Sie fort. Wählen Sie Importieren aus, und wählen Sie die entsprechende Batchdatei aus.
Führen Sie dann die Importschritte aus, wie von der Software gefordert. Verwenden Sie die Plattenkarten, um die zu dosierende Lösung und die Bestimmungsorte zu überprüfen. Führen Sie dann das Protokoll aus, indem Sie den Eingabeaufforderungen folgen, sobald sie angezeigt werden.
Die Lösungen von der Ausgangsplatte werden in die ausgewählten Kristalltropfen abgegeben. Bewahren Sie die Platte für die erforderliche Zeit im Inkubator auf. Um die Kristalle mit dem halbautomatischen Kristallerntegerät zu ernten, drücken Sie die Schaltfläche "Arbeitsablauf starten", um zur ersten ausgewählten Well-Position zu gelangen.
Wenn der Kristall überlebt hat, montieren Sie ihn in der Schleife und tauchen Sie ihn in den flüssigen Stickstoff, um ihn auf Position eins im ersten Puck in der Liste zu platzieren. Wählen Sie in der Benutzeroberfläche die entsprechende Beschreibung für den Kristall aus. Wenn es sich bei dem Tropfen um ein zusammengesetztes Einweichen handelt, notieren Sie die Beschreibung des zusammengesetzten Zustands.
Wenn der Quarz erfolgreich gemountet wurde, wählen Sie mounted aus, andernfalls wählen Sie fail. Sobald die Kristalle geerntet sind, bringen Sie die Pucks zum Barcode-Scanner und legen Sie sie einzeln in den Halter, um den Puck zu scannen und die Barcodes anzuheften. Sobald der Scanvorgang abgeschlossen ist, legen Sie die Deckel auf die Pucks und lagern Sie sie in einem Flüssigstickstoff-Lagerdewar.
Um die falsch zentrierten Samples zu erfassen, sehen Sie sich die Sample-Wechsler-Ansicht in ISPyB an und wählen Sie Ranking by AP Resolution, um die Samples nach automatisch verarbeiteter Auflösung in einer Farbabstufung von Grün bis Rot zu bewerten. Klicken Sie auf die Proben, um zu prüfen, ob rote oder gelbe Proben vorhanden sind. Überprüfen Sie dann die Kristall-Schnappschüsse, um zu sehen, ob der Kristall zentriert wurde.
Um die Ergebnisse der automatischen Verarbeitung von Diamond über XChem Explorer oder XCE abzurufen und zu analysieren, gehen Sie in einem Terminal in den Unterordner processing und verwenden Sie den Alias XCE, um XChem Explorer zu öffnen. Wählen Sie auf der Registerkarte "Übersicht" die Schaltfläche "Tabellen aus Datenquelle aktualisieren" aus, um die Zusammenfassung der experimentellen Daten zu aktualisieren. Wählen Sie auf der Registerkarte "Einstellungen" das Datenerfassungsverzeichnis aus, und öffnen Sie die Registerkarte "Datasets".
Wählen Sie das Ziel aus dem Dropdown-Menü "Ziel auswählen" aus, wählen Sie im Dropdown-Menü "Datensätze" die Option "Neue Ergebnisse aus der automatischen Verarbeitung abrufen" aus und klicken Sie auf "Ausführen". Um die ersten Karten mit Dimple zu berechnen, öffnen Sie die Registerkarte Karten, wählen Sie das Referenzmodell aus dem Dropdown-Menü aus und wählen Sie die gewünschten Datensätze aus, gefolgt von der Ausführung von Dimple für ausgewählte MTZ-Dateien. Um Ligandenbeschränkungen zu generieren, wählen Sie die gewünschten Datensätze aus und erstellen Sie dann eine SCF-, PDB- oder PNG-Datei ausgewählter Verbindungen aus der Dropdown-Liste Karten und Beschränkungen.
Um Treffer mit Panda zu identifizieren, wählen Sie die Registerkarte Pandas, stellen Sie sicher, dass das Ausgabeverzeichnis korrekt definiert ist, und führen Sie panda aus. Analysieren Sie aus dem Dropdown-Menü zur Trefferidentifikation. Um die von Panda identifizierten Treffer zu analysieren, führen Sie panda aus.
Inspizieren aus dem Dropdown-Menü Trefferidentifikation. So öffnen Sie Blässhuhn mit dem Panda-Bedienfeld. Lastdurchschnitt und 2mFo-DFc-Karten von Dimple zum Vergleich mit der Ereigniskarte und dem Modell.
Sobald ein Ligand angepasst wurde, klicken Sie auf Ligand mit Modell zusammenführen und Modell speichern, bevor Sie zu einem anderen Ereignis navigieren, um zu vermeiden, dass Änderungen am gebundenen Zustandsmodell verloren gehen. Kommentieren Sie das Bindungsereignis mithilfe des Ereigniskommentarfelds, und kommentieren Sie die Bindungswebsites mithilfe von Datensatzwebsiteinformationen. Nachdem alle lebensfähigen Liganden modelliert, zusammengeführt und basierend auf der Ereigniskarte gespeichert wurden, schließen Sie panda.inspect.
Exportieren Sie die Panda-Inspektionsmodelle zurück in das Projektverzeichnis und starten Sie eine erste Runde der Verfeinerung für die ausgewählten Datensätze, und die Verfeinerung wird jetzt auf der Registerkarte Verfeinerung angezeigt. Die XChem-Pipeline für das Fragment-Screening durch Röntgenkristallographie wurde umfassend gestrafft, so dass sie von der wissenschaftlichen Gemeinschaft übernommen werden kann. Dieses Diagramm zeigt die Akzeptanz und Konsolidierung des Benutzerprogramms von 2015 bis 2019 mit der Schaffung von Blockzuweisungsgruppen im Jahr 2019 und die Widerstandsfähigkeit der Plattform während der COVID-19-Pandemie im Jahr 2020.
Erfolgreiche Kampagnen liefern eine dreidimensionale Karte potenzieller Interaktionsstellen auf dem Zielprotein. Ein typisches Ergebnis ist das XChem-Screening der Hauptprotease von SARS-CoV-2. Die bekannten Sites of Interest, wie z.B. Enzymaktivstellen und Subtaschen, sind gelb dargestellt.
Die mutmaßlichen allosterischen Stellen, wie sie an Protein-Protein-Wechselwirkungen beteiligt sind, sind in Magenta dargestellt, und Kristallpackungsgrenzflächen, die im Allgemeinen als falsch positiv angesehen werden, sind grün dargestellt. In der Vergangenheit war es schwierig, die Kristallographie als primäres Fragmentsieb zu verwenden. Diese Studie dokumentierte die XChem-Pipeline-Protokolle von der Probenvorbereitung bis zu den endgültigen Strukturen.
Das kristallographische Fragment-Screening ergänzt andere biophysikalische Techniken und ist in der Regel unerlässlich, um Fragmenttreffer zu Bleiverbindungen zu entwickeln. Es kann auf jede Zielklasse in der Wirkstoffforschung angewendet werden.
Übersicht
Dieser Artikel beschreibt den vollständigen XChem-Prozess für die kristallbasierte Fragment-Screening, wobei die Schritte von der Zugangsantragstellung bis zur Datenverbreitung detailliert erläutert werden. Die XChem-Einrichtung an der Diamond Light Source verbessert die fragmentbasierte Wirkstoffforschung durch effiziente Röntgenkristallographie.
Wesentliche Studienkomponenten
Bereich der Wissenschaft
- Fragmentbasierte Wirkstoffforschung (FBDD)
- Röntgenkristallographie
- Strukturbiologie
Hintergrund
- Die fragmentbasierte Wirkstoffentwicklung ist eine Strategie zur Leitstrukturfindung.
- Röntgenkristallographie liefert strukturelle Einblicke in molekulare Wechselwirkungen.
- Herkömmliche Einweichmethoden weisen Grenzen auf, die XChem behebt.
- Die XChem-Plattform hat während der COVID-19-Pandemie eine hohe Widerstandsfähigkeit gezeigt.
Zweck der Studie
- Dokumentation der XChem-Pipeline-Protokolle von der Probenvorbereitung bis zu den endgültigen Strukturen.
- Veranschaulichung der Effizienz der XChem-Plattform für die Fragment-Screening.
- Herausstellung der Bedeutung des kristallographischen Fragment-Screenings für die Wirkstoffentwicklung.
Verwendete Methoden
- Auswahl von Kristallen und Verbindungen für das Screening.
- Verwendung akustischer Dosiergeräte zur Lösungsdosierung.
- Gewinnung von Kristallen mithilfe halbautomatischer Geräte.
- Datenanalyse mittels XChem Explorer und Panda-Software.
Hauptergebnisse
- Erfolgreiche Kampagnen liefern dreidimensionale Karten von Interaktionsstellen.
- Dokumentierter Nutzerzulauf des Programms von 2015 bis 2019.
- Identifizierung potenzieller allosterischer Stellen und aktiver Stellen auf Proteinen.
- Optimierte Protokolle ermöglichen einen breiteren Zugang für die wissenschaftliche Gemeinschaft.
Schlussfolgerungen
- Die XChem-Pipeline verbessert die Effizienz der Fragment-Screenings erheblich.
- Das kristallographische Fragment-Screening ergänzt andere biophysikalische Methoden.
- Weiterentwicklungen der XChem-Plattform unterstützen laufende Arbeiten zur Wirkstoffentdeckung.
Häufig gestellte Fragen
Ausschlaggebende Bedeutung für die Industrie
Die fragmentbasierte Wirkstoffentwicklung setzt auf die empfindliche Detektion schwacher molekularer Wechselwirkungen, wobei die Röntgenkristallographie sowohl Bindungsaffinität als auch strukturelle Details liefert, die für die Optimierung von Leitstrukturen unerlässlich sind. Die XChem-Einrichtung an der Diamond Light Source ermöglicht eine standardisierte kristallographische Fragment-Screening-Prozesskette – von der Probenvorbereitung bis zur Datenablage – und erlaubt so die routinemäßige Identifizierung schwacher Binder mit hoher struktureller Genauigkeit. Diese Fähigkeit unterstützt die frühe Zielvalidierung und den Übergang von Hits zu Leitstrukturen in verschiedenen therapeutischen Bereichen und verringert mechanistische Unsicherheiten in Entdeckungspipelines.
Strategische Anwendungen in der Biopharma-Forschung und Entwicklung
Frühe Entdeckung und Zielvalidierung
- Wissenschaftlicher Wert: Ermöglicht die Überprüfung therapeutischer Hypothesen durch direkte Beobachtung der Bindungsmodi von Liganden in atomarer Auflösung.
- Operativer Wert: Unterstützt die biologische Risikominimierung, indem die Zielmolekülbindung und Zugänglichkeit der Bindungsstelle vor Investition in eine Wirkstoffkampagne bestätigt werden.
- Prädiktiver Wert: Generiert verlässliche Ausgangspunkte für die medizinische Chemie, indem Fragmente mit definierten Interaktionsgeometrien identifiziert werden.
Screening und Assay-Entwicklung
- Assay-Bereitschaft: Liefert standardisierte, reproduzierbare strukturelle Ergebnisse, die eine zuverlässige Verbindungsbewertung über verschiedene Kampagnen hinweg ermöglichen.
- Skalierbarkeit: Ermöglicht Hochdurchsatz-Screening durch automatisierte Probenhandhabung und unbeaufsichtigte Datenerfassung an der I04-1-Strahllinie.
- Datenqualität: Erzeugt quantitative Elektronendichtekarten und Liganden-Restriktionen, die die Validierung von Hits und die anschließende Verfeinerung unterstützen.
Translationale und präklinische Forschung
- Translationale Kontinuität: Liefert strukturelle Einblicke, die mit der Biomarker-Entwicklung übereinstimmen, indem funktionell relevante Interaktionsstellen kartiert werden.
- Präklinische Entlastung von Risiken: Ermöglicht eine schnelle Weiterverfolgung von Treffern bei neuartigen Zielstrukturen, wie während des Screenings der Hauptprotease von SARS-CoV-2 mit einer Bearbeitungszeit von drei Wochen gezeigt wurde.
- Portfoliorelevanz: Unterstützt risikoadjustierte Entscheidungen zur Voranbringung durch strukturelle Nachweise der Bindung über verschiedene Zielklassen hinweg.
Pipeline- und Workflow-Integration
Die XChem-Plattform ist in den Entdeckungsprozess von der frühen Target-Validierung bis hin zur Lead-Identifizierung integriert und liefert strukturelle Daten, die die Auswahl und Optimierung von Hits leiten.
- Entdeckungsbiochemie: Unterstützt die Hypothesenprüfung, indem sie direkte strukturelle Nachweise von Wechselwirkungen zwischen Verbindungen und Zielstrukturen liefert und die Bindungsmechanismen aufklärt.
- Screening: Ermöglicht die Bereitschaft für Assays durch automatisierte Kristallhandhabung, Lösungsmittelzugabe und Datenverarbeitungsworkflows, die Reproduzierbarkeit gewährleisten.
- Analytik: Erzeugt quantifizierbare Ergebnisse, darunter Liganden-Bindungsereigniskarten, zur Verfeinerung geeignete Modelle und Standortannotationen, die einen vergleichenden Analysenansatz über verschiedene Bedingungen hinweg ermöglichen.
- Translationale Forschung: Verbindet Fragmenttreffer mit der präklinischen Kontinuität, indem sie einen strukturellen Kontext für Zielstrukturenbindung und allosterische Modulation bereitstellt.
- Unternehmensweite Wiederverwendung: Funktioniert als wiederverwendbare strukturelle Screening-Methode, die über begutachtete akademische und proprietäre industrielle Wege zugänglich ist.
Operative und unternehmerische Auswirkungen
- Wissenschaftlicher Wert: Vorhersagegenauigkeit durch direkte strukturelle Visualisierung schwacher Binder-Wechselwirkungen, wodurch Unsicherheiten bei der Zielvalidierung reduziert werden.
- Operationaler Wert: Standardisierung und Reproduzierbarkeit durch optimierte Protokolle, automatisierte Dosierung und zentrale Datenverwaltung über XChem Explorer.
- Strategischer Wert: Verbesserte Go/No-Go-Entscheidungen durch strukturelle Bestätigung von Hits, die die biophysikalische Screening-Triage ergänzt.
- Portfolio-Wirkung: Risikoadjustierte Priorisierung, ermöglicht durch strukturelle Daten zur Bindungsstelle-Plastizität und zu Interaktions-Hotspots.
Durchführungsaspekte
- Setzt Fachkenntnisse in Kristallographie, im Umgang mit Fragmentbibliotheken und bei der Interpretation struktureller Daten voraus.
- Hängt von dem Zugang zu Synchrotron-Strahllinien, akustischen Dosiersystemen und automatisierten Kristallgewinnungswerkzeugen ab.
- Erfordert eine standardisierte Vorgehensweise zwischen Teams bei der Probenverfolgung, der Benennung von Daten und den Einreichungsprotokollen über ISPyB und XChem Explorer.
- Beinhaltet Anpassungsüberlegungen bezüglich Kristallqualität, Lösungsmittelverträglichkeit und zielgerichteten Bedingungen für das Eindiffundieren von Verbindungen.
- Praktische Einschränkungen umfassen die Abhängigkeit von der Herstellbarkeit der Kristalle sowie der Röntgenempfindlichkeit bestimmter Zielstrukturen, wie in der Studie angemerkt.
