Name: Zebrafisch-Modell der Neuroblastom-Metastasierung (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-03-14T15:00:00.000+00:00
Duration: 5 min 20 s
Description: Erfahren Sie die Entwicklung eines Zebrafisch-Modells zur Untersuchung der Neuroblastom-Metastasierung mit MYCN- und LMO1-Überexpression. Diese Methode ermöglicht Echtzeit-In-vivo-Bildgebung von Tumorzellstreuung und Metastasierung.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Diese Arbeit wurde durch einen Zuschuss R01 CA240323 (S.Z.) des National Cancer Institute unterstützt; einen Zuschuss W81XWH-17-1-0498 (S.Z.) vom Verteidigungsministerium der Vereinigten Staaten (DoD); einen V Scholar Award der V Foundation for Cancer Research (S.Z.) und einen Platform Grant des Mayo Center for Biomedical Discovery (S.Z.); und Unterstützt durch das Mayo Clinic Cancer Center und das Center for Individualized Medicine (S.Z.).

<ol><li>Veldman, M., Lin, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Zebrafish+as+a+developmental+model+organism+for+pediatric+research%5BTitle%5D)+AND+%22Pediatric+Research%22%5BJournal%5D)">Zebrafish as a developmental model organism for pediatric research.</a> Pediatric Research. 64, 470-476 (2008).</li>
<li>Feitsma, H., Cuppen, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Zebrafish+as+a+cancer+model%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Cancer+Research%22%5BJournal%5D)">Zebrafish as a cancer model.</a> Molecular Cancer Research. 6 (5), 694(2008).</li>
<li>Ethcin, J., Kanki, J. P., Look, A. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Zebrafish+as+a+model+for+the+study+of+human+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Zebrafish as a model for the study of human cancer.</a> Methods in Cell Biology. 105, 309-337 (2010).</li>
<li>Benjamin, D. C., Hynes, R. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intravital+imaging+of+metastasis+in+adult+Zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Cancer%22%5BJournal%5D)">Intravital imaging of metastasis in adult Zebrafish.</a> BMC Cancer. 17 (1), 660(2017).</li>
<li>Kim, I. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microenvironment-derived+factors+driving+metastatic+plasticity+in+melanoma%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Microenvironment-derived factors driving metastatic plasticity in melanoma.</a> Nature Communications. 8, 14343(2017).</li>
<li>Zhu, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Activated+ALK+collaborates+with+MYCN+in+neuroblastoma+pathogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Cell%22%5BJournal%5D)">Activated ALK collaborates with MYCN in neuroblastoma pathogenesis.</a> Cancer Cell. 21 (3), 362-373 (2012).</li>
<li>Maris, J. M., Hogarty, M. D., Bagatell, R., Cohn, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neuroblastoma%5BTitle%5D)+AND+%22Lancet%22%5BJournal%5D)">Neuroblastoma.</a> Lancet. 369 (9579), London, England. 2106-2120 (2007).</li>
<li>Park, J. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Children%27s+oncology+group%27s+2013+blueprint+for+research%3A+neuroblastoma%5BTitle%5D)+AND+%22Pediatric+Blood+and+Cancer%22%5BJournal%5D)">Children's oncology group's 2013 blueprint for research: neuroblastoma.</a> Pediatric Blood and Cancer. 60 (6), 985-993 (2013).</li>
<li>Hoehner, J. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+developmental+model+of+neuroblastoma%3A+differentiating+stroma-poor+tumors%27+progress+along+an+extra-adrenal+chromaffin+lineage%5BTitle%5D)+AND+%22Laboratory+Investigation%3A+A+Journal+of+Technical+Methods+and+Pathology%22%5BJournal%5D)">A developmental model of neuroblastoma: differentiating stroma-poor tumors' progress along an extra-adrenal chromaffin lineage.</a> Laboratory Investigation: A Journal of Technical Methods and Pathology. 75 (5), 659-675 (1996).</li>
<li>Tsubota, S., Kadomatsu, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Origin+and+initiation+mechanisms+of+neuroblastoma%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+and+Tissue+Research%22%5BJournal%5D)">Origin and initiation mechanisms of neuroblastoma.</a> Cell and Tissue Research. 372 (2), 211-221 (2018).</li>
<li>Tolbert, V. P., Matthay, K. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neuroblastoma%3A+Clinical+and+biological+approach+to+risk+stratification+and+treatment%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+and+Tissue+Research%22%5BJournal%5D)">Neuroblastoma: Clinical and biological approach to risk stratification and treatment.</a> Cell and Tissue Research. 372 (2), 195-209 (2018).</li>
<li>Maris, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recent+advances+in+neuroblastoma%5BTitle%5D)+AND+%22New+England+Journal+of+Medicine%22%5BJournal%5D)">Recent advances in neuroblastoma.</a> New England Journal of Medicine. 362 (23), 2202-2211 (2010).</li>
<li>Zhu, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((LMO1+Synergizes+with+MYCN+to+promote+neuroblastoma+initiation+and+metastasis%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Cell%22%5BJournal%5D)">LMO1 Synergizes with MYCN to promote neuroblastoma initiation and metastasis.</a> Cancer Cell. 32, 310-323 (2017).</li>
<li>Patton, E. E., Zon, L. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+art+and+design+of+genetic+screens%3A+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Genetics%22%5BJournal%5D)">The art and design of genetic screens: zebrafish.</a> Nature Reviews Genetics. 2 (12), 956-966 (2001).</li>
<li>Lieschke, G. J., Currie, P. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Animal+models+of+human+disease%3A+zebrafish+swim+into+view%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Genetics%22%5BJournal%5D)">Animal models of human disease: zebrafish swim into view.</a> Nature Reviews Genetics. 8 (5), 353-367 (2007).</li>
<li>Tao, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((LIN28B+regulates+transcription+and+potentiates+MYCN-induced+neuroblastoma+through+binding+to+ZNF143+at+target+gene+promotors%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">LIN28B regulates transcription and potentiates MYCN-induced neuroblastoma through binding to ZNF143 at target gene promotors.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 117 (28), 16516-16526 (2020).</li>
<li>Ung, C. Y., Guo, F., Zhang, X., Zhu, Z., Zhu, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mosaic+zebrafish+transgenesis+for+functional+genomic+analysis+of+candidate+cooperative+genes+in+tumor+pathogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Mosaic zebrafish transgenesis for functional genomic analysis of candidate cooperative genes in tumor pathogenesis.</a> Journal of Visualized Experiments. (97), e52567(2015).</li>
<li>Zhang, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Critical+role+for+GAB2+in+neuroblastoma+pathogenesis+through+the+promotion+of+SHP2%2FMYCN+cooperation%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">Critical role for GAB2 in neuroblastoma pathogenesis through the promotion of SHP2/MYCN cooperation.</a> Cell Reports. 18 (12), 2932-2942 (2017).</li>
<li>Zimmerman, M. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MYC+drives+a+subset+of+high-risk+pediatric+neuroblastomas+and+is+activated+through+mechanisms+including+enhancer+hijacking+and+focal+enhancer+amplification%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Discovery%22%5BJournal%5D)">MYC drives a subset of high-risk pediatric neuroblastomas and is activated through mechanisms including enhancer hijacking and focal enhancer amplification.</a> Cancer Discovery. 8 (3), 320-335 (2018).</li>
<li>Koach, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Drugging+MYCN+oncogenic+signaling+through+the+MYCN-PA2G4+binding+interface%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Research%22%5BJournal%5D)">Drugging MYCN oncogenic signaling through the MYCN-PA2G4 binding interface.</a> Cancer Research. 79 (21), 5652-5667 (2019).</li>
<li>Kimmel, C. B., Ballard, W. W., Kimmel, S. R., Ullmann, B., Schilling, T. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stages+of+embryonic+development+of+the+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Dynamics%22%5BJournal%5D)">Stages of embryonic development of the zebrafish.</a> Developmental Dynamics. 203 (3), 253-310 (1995).</li>
<li>DuBois, S. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Metastatic+sites+in+stage+IV+and+IVS+neuroblastoma+correlate+with+age%2C+tumor+biology%2C+and+survival%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+pediatric+hematology%2Foncology%22%5BJournal%5D)">Metastatic sites in stage IV and IVS neuroblastoma correlate with age, tumor biology, and survival.</a> Journal of pediatric hematology/oncology. 21 (3), 181-189 (1999).</li>
<li>Wattrus, S. J., Zon, L. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stem+cell+safe+harbor%3A+The+hematopoietic+stem+cell+niche+in+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Blood+Advances%22%5BJournal%5D)">Stem cell safe harbor: The hematopoietic stem cell niche in zebrafish.</a> Blood Advances. 2 (21), 3063-3069 (2018).</li>
<li>Menke, A. L., Spitsbergen, J. M., Wolterbeek, A. P., Woutersen, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Normal+anatomy+and+histology+of+the+adult+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Toxicologic+Pathology%22%5BJournal%5D)">Normal anatomy and histology of the adult zebrafish.</a> Toxicologic Pathology. 39 (5), 759-775 (2011).</li>
<li>Renshaw, S. A., Trede, N. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+model+450+million+years+in+the+making%3A+Zebrafish+and+vertebrate+immunity%5BTitle%5D)+AND+%22Disease+Models+and+Mechanisms%22%5BJournal%5D)">A model 450 million years in the making: Zebrafish and vertebrate immunity.</a> Disease Models and Mechanisms. 5 (1), 38-47 (2012).</li>
<li>Junqueira, L. C., Cossermelli, W., Brentani, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differential+staining+of+collagens+type+I%2C+II+and+III+by+Sirius+Red+and+polarization+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Archivum+histologicum+Japonicum+%28Nihon+Soshikigaku+Kiroku%29%22%5BJournal%5D)">Differential staining of collagens type I, II and III by Sirius Red and polarization microscopy.</a> Archivum histologicum Japonicum (Nihon Soshikigaku Kiroku). 41 (3), 267-274 (1978).</li>
<li>Sweat, F., Puchtler, H., Rosenthal, S. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sirius+red+F3BA+as+a+stain+for+connective+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22Archives+of+Pathology%22%5BJournal%5D)">Sirius red F3BA as a stain for connective tissue.</a> Archives of Pathology. 78, 69-72 (1964).</li>
<li>Ignatius, M. S., Hayes, M., Langenau, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+imaging+of+cancer+in+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Advances+in+Experimental+Medicine+and+Biology%22%5BJournal%5D)">In vivo imaging of cancer in zebrafish.</a> Advances in Experimental Medicine and Biology. 916, 219-237 (2016).</li>
<li>Howe, C. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+zebrafish+reference+genome+sequence+and+its+relationship+to+the+human+genome%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">The zebrafish reference genome sequence and its relationship to the human genome.</a> Nature. 496 (7446), 498-503 (2013).</li>
<li>Fazio, M., Ablain, J., Chuan, Y., Langenau, D. M., Zon, L. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Zebrafish+patient+avatars+in+cancer+biology+and+precision+cancer+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Cancer%22%5BJournal%5D)">Zebrafish patient avatars in cancer biology and precision cancer therapy.</a> Nature Reviews Cancer. 20 (5), 263-273 (2020).</li>
<li>Yoganantharjah, P., Gibert, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Use+of+the+zebrafish+model+to+aid+in+drug+discovery+and+target+validation%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Topics+in+Medicinal+Chemistry%22%5BJournal%5D)">The Use of the zebrafish model to aid in drug discovery and target validation.</a> Current Topics in Medicinal Chemistry. 17 (18), 2041-2055 (2018).</li>
<li>Ignatius, M. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+imaging+of+tumor-propagating+cells%2C+regional+tumor+heterogeneity%2C+and+dynamic+cell+movements+in+embryonal+rhabdomyosarcoma%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Cell%22%5BJournal%5D)">In vivo imaging of tumor-propagating cells, regional tumor heterogeneity, and dynamic cell movements in embryonal rhabdomyosarcoma.</a> Cancer Cell. 21 (5), 680-693 (2012).</li>
<li>Stoletov, K., Montel, V., Lester, R. D., Gonias, S. L., Klemke, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-resolution+imaging+of+the+dynamic+tumor+cell+vascular+interface+in+transparent+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">High-resolution imaging of the dynamic tumor cell vascular interface in transparent zebrafish.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 104 (44), 17406-17411 (2007).</li>
<li>Ahmed, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neuroblastoma+with+orbital+metastasis%3A+ophthalmic+presentation+and+role+of+ophthalmologists%5BTitle%5D)+AND+%22Eye%22%5BJournal%5D)">Neuroblastoma with orbital metastasis: ophthalmic presentation and role of ophthalmologists.</a> Eye. 20 (4), London, England. 466-470 (2006).</li>
<li>Papaioannou, G., McHugh, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neuroblastoma+in+childhood%3A+review+and+radiological+findings%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Imaging+Society%22%5BJournal%5D)">Neuroblastoma in childhood: review and radiological findings.</a> Cancer Imaging Society. 5 (1), 116-127 (2005).</li>
<li>Langenau, D. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Co-injection+strategies+to+modify+radiation+sensitivity+and+tumor+initiation+in+transgenic+Zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Oncogene%22%5BJournal%5D)">Co-injection strategies to modify radiation sensitivity and tumor initiation in transgenic Zebrafish.</a> Oncogene. 27 (30), 4242-4248 (2008).</li>
<li>Amores, A., et al. Zebrafish hox clusters and vertebrate genome evolution. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aAmores%2C+A+%22Science%22">Science</a>. 282 (5394), New York, N.Y. 1711-1714 (1998).</li>
<li>Postlethwait, J. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Vertebrate+genome+evolution+and+the+zebrafish+gene+map%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Genetics%22%5BJournal%5D)">Vertebrate genome evolution and the zebrafish gene map.</a> Nature Genetics. 18 (4), 345-349 (1998).</li>
<li>Opazo, J. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Whole-genome+duplication+and+the+functional+diversification+of+teleost+fish+hemoglobins%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Biology+and+Evolution%22%5BJournal%5D)">Whole-genome duplication and the functional diversification of teleost fish hemoglobins.</a> Molecular Biology and Evolution. 30 (1), 140-153 (2013).</li>
</ol>

Die Autoren erklären, dass sie keine konkurrierenden finanziellen Interessen haben.

Zebrafisch wurde in den letzten Jahrzehnten häufig in der Forschung verwendet, insbesondere in der Krebsforschung, aus offensichtlichen Gründen, wie z.B. seiner Wartungsfreundlichkeit, robusten Reproduktion und klaren Vorteilen für die In-vivo-Bildgebung1,28. Das Zebrafischmodell kann aufgrund seiner äußeren Befruchtung und Entwicklung leicht embryonal manipuliert werden, was sich gut zu Säugetiermodellorganismen wie Ratten und Mäusen für groß angelegte ...

Zebrafisch wurde in verschiedenen Forschungsbereichen, insbesondere bei Krebs, weit verbreitet und angewendet. Dieses Modell bietet viele Vorteile - wie seine robuste Reproduktion, kostengünstige Wartung und vielseitige Visualisierung von Tumorwachstum und Metastasierung -, die Zebrafische zu einem leistungsstarken Werkzeug machen, um die zellulären und molekularen Grundlagen der Tumorgenese und Metastasierung zu untersuchen und zu untersuchen. Neue Techniken für groß angelegte Genomkartierung, Transgenese, Genüberexpression oder Knockout, Zelltransplantation und chemische Screens haben die Leistungsfähigkeit des Zebrafischmodells immens erhöht1. In den letzten Jahren wurden viele Zebrafischlinien entwickelt, um die Tumorgenese und Metastasierung einer Vielzahl von menschlichen Krebsarten zu untersuchen, einschließlich, aber nicht beschränkt auf Leukämie, Melanom, Rhabdomyosarkom und hepatozelluläres Karzinom2,3,4,5. Darüber hinaus wurde das erste Zebrafischmodell des Neuroblastoms (NB) durch Überexpression von MYCN, einem Onkogen, im peripheren sympathischen Nervensystem (PSNS) unter Kontrolle des Dopamin-beta-Hydroxylase(dβh)-Promotors erzeugt. Mit diesem Modell wurde weiter gezeigt, dass aktiviertes ALK mit MYCN synergistisch wirken kann, um den Tumorbeginn zu beschleunigen und die Tumorpenetranz in vivo zu erhöhen6.
NB stammt aus der sympathoadrenalen Linie der Neuralleistenzellen und ist ein hochmetastasierender Krebs bei Kindern7. Es ist für 10% der pädiatrischen Krebstodesfälle verantwortlich8. Bei der Diagnose weit verbreitet metastasiert, kann NB klinisch als Tumore dargestellt werden, die hauptsächlich entlang der Kette der sympathischen Ganglien und des Nebennierenmarks von PSNS9,10 entstehen. Die MYCN-Amplifikation ist häufig mit schlechten Ergebnissen bei NB-Patienten assoziiert11,12. Darüber hinaus wurde LMO1 als kritisches NB-Suszeptibilitätsgen in Hochrisikofällen identifiziert13,14. Studien fanden heraus, dass die transgene Koexpression von MYCN und LMO1 im PSNS des Zebrafischmodells nicht nur ein früheres Auftreten von NB fördert, sondern auch eine weit verbreitete Metastasierung in den Geweben und Organen induziert, die Stellen ähneln, die häufig bei Patienten mit Hochrisiko-NB13 beobachtet werden. Vor kurzem wurde ein weiterer metastasierender Phänotyp von NB auch in einem neueren Zebrafischmodell von NB beobachtet, in dem sowohl MYCN als auch Lin28B, die für ein RNA-bindendes Protein kodieren, unter Kontrolle des dβh-Promotors überexprimiert werden16.
Der stabile transgene Ansatz bei Zebrafischen wird häufig verwendet, um zu untersuchen, ob die Überexpression eines Gens von Interesse zur normalen Entwicklung und Pathogenese der Krankheit beitragen könnte14,15. Diese Technik wurde erfolgreich eingesetzt, um die Bedeutung mehrerer Gene und Wege für die NB-Tumorgenese zu demonstrieren6,16,17,18,19,20. In diesem Beitrag wird vorgestellt, wie die transgene Fischlinie, die sowohl MYCN als auch LMO1 im PSNS überexprimiert, geschaffen wurde und wie gezeigt wurde, dass die Zusammenarbeit dieser beiden Onkogene den Beginn der NB-Tumorgenese und -Metastasierung beschleunigt13. Erstens wurde die transgene Linie, die EGFP-MYCN unter Kontrolle des dβh-Promotors überexprimiert (als MYCN-Linie bezeichnet), durch Injektion des dβh-EGFP-MYCN-Konstrukts in einZellstadium von Wildtyp-AB-Embryonen entwickelt, wie zuvor beschrieben6,17. Eine separate transgene Linie, die LMO1 im PSNS überexprimiert (als LMO1-Linie bezeichnet), wurde entwickelt, indem zwei DNA-Konstrukte, dβh-LMO1 und dβh-mCherry, in WT-Embryonen im Einzellstadium koprojiziert wurden13. Es wurde bereits gezeigt, dass koinjizierte Doppel-DNA-Konstrukte in das Fischgenom kointegriert werden können; Daher werden LMO1 und mCherry in den PSNS-Zellen der transgenen Tiere koexprimiert. Sobald die injizierten F0-Embryonen die Geschlechtsreife erreicht hatten, wurden sie dann mit WT-Fischen ausgekreuzt, um positive Fische mit Transgenintegration zu identifizieren. Kurz gesagt, die F1-Nachkommen wurden zuerst durch Fluoreszenzmikroskopie auf mCherry-Expression in den PSNS-Zellen untersucht. Die Keimbahnintegration von LMO1 in mCherry-positiven Fischen wurde durch genomische PCR und Sequenzierung weiter bestätigt. Nach erfolgreicher Identifizierung jeder transgenen Linie wurden die Nachkommen heterozygoter MYCN- und LMO1-transgener Fische miteinander verpaart, um eine zusammengesetzte Fischschnur zu erzeugen, die sowohl MYCN als auch LMO1 (als MYCN bezeichnet; LMO1-Linie). Tumortragendes MYCN; LMO1-Fische wurden alle zwei Wochen mittels Fluoreszenzmikroskopie auf hinweise auf metastasierende Tumore in den Regionen überwacht, die vom primären Ort, der Interrenaldrüsenregion (IRG, Zebrafischäquivalent der menschlichen Nebenniere) entfernt sind13. Um die Metastasierung von Tumoren in MYCN zu bestätigen; LMO1 Fisch,histologische und immunhistochemische Analysen wurden angewendet.

<table><tbody><tr><td>3,3'-Diaminobenzidin (DAB) Vektor</td><td>Kit Vektor</td><td>SK-4100</td><td></td></tr><tr><td>Essigsäure</td><td>Fisher Scientific / Acros Organic</td><td>64-19-7</td><td></td></tr><tr><td>Agarose GP2</td><td>Midwest Scientific</td><td>009012-36-6</td><td></td></tr><tr><td>Anti-Tyrosin-Hydroxylase (TH) Antikörper</td><td>Pel-Freez</td><td>P40101</td><td></td></tr><tr><td>Avidin/Biotin Blockierungskit</td><td>Vektor</td><td>SP-2001</td><td></td></tr><tr><td>BOND Intense R Detektion</td><td>Leica Biosystems</td><td>DS9263</td><td></td></tr><tr><td>BOND Primärantikörper-Verdünnungsmittel</td><td>Leica Biosystems Newcastle, Ltd.</td><td>AR9352</td><td></td></tr><tr><td>BOND-MAX IHC Instrument</td><td>Leica Biosystems Newcastle, Ltd.</td><td>N/A</td><td>vollautomatisches IHC-Färbesystem</td></tr><tr><td>CH211-270H11 BAC-Klon</td><td>BACPAC Resources Center (BRFC)</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Verbundmikroskop ausgestattet mit DP71 Kamera</td><td>Olympus</td><td>AX70</td><td></td></tr><tr><td>Cytoseal XYL (Eindeckmedium auf Xylolbasis)</td><td>Richard-Allan Scientific</td><td>8312-4</td><td></td></tr><tr><td>Eosin</td><td>Leica</td><td>3801601</td><td>gebrauchsfertig (keine Vorbereitung erforderlich)</td></tr><tr><td>Ethanol</td><td>Carolina</td><td>86-1263</td><td></td></tr><tr><td>Expand Long Template PCR System</td><td>Roche Applied Science, IN</td><td>11681834001</td><td></td></tr><tr><td>Gateway BP Clonase II Enzymmischung</td><td>Invitrogen, CA</td><td>11789-020</td><td></td></tr><tr><td>Gateway LR Clonase II Enzymmischung</td><td>Invitrogen, CA</td><td>11791-100</td><td></td></tr><tr><td>Ziege Anti-Rb Sekundärantikörper (biotinyliert)</td><td>Dako</td><td>E0432</td><td></td></tr><tr><td>Hämatoxylinlösung, Harris modifiziert</td><td>Sigma Aldrich Chemical Company Inc. / SAFC</td><td>HHS-32-1L</td><td></td></tr><tr><td>HRP Avidin D</td><td>Vektor</td><td>A-2004</td><td></td></tr><tr><td>Salzsäure</td><td>Aqua Solutions</td><td>4360-1L</td><td></td></tr><tr><td>Wasserstoffperoxid, 3%</td><td>Fisher Scientific</td><td>H324-500</td><td></td></tr><tr><td>I-SceI Enzym</td><td>New England Biolabs, MA</td><td>R0694L</td><td></td></tr><tr><td>Kanamycinsulfat</td><td>Teknova, Inc.</td><td>K2150</td><td></td></tr><tr><td>Kimberly-Clark Professional Kimtech Science Kimwipes</td><td>Fisher Scientific</td><td>34133</td><td></td></tr><tr><td>Lithiumcarbonat</td><td>Sigma Aldrich Chemical Company Inc. / SAFC</td><td>554-13-2</td><td></td></tr><tr><td>Mikrotom zum Schneiden</td><td>Leica Biosystems</td><td>RM2255</td><td></td></tr><tr><td>One Shot TOP10 Chemisch kompetent&nbsp;E. coli</td><td>Invitrogen</td><td>C404006</td><td></td></tr><tr><td>p3E-polyA</td><td>&nbsp;Dr. Chi-Bin Chien, Univ. of Utah</td><td>N/A</td><td>ein großzügiges Geschenk (Bitte beziehen Sie sich auf die Webseite http://tol2kit.genetics.utah.edu/index.php/Main_Page, um Material zu erhalten, das wie beschrieben frei verteilt wird.)</td></tr><tr><td>Parafin Wachs</td><td>Surgipath Paraplast</td><td>39603002</td><td>Parrafin zu</td></tr><tr><td>Parafin Paraformaldehyd</td><td>Alfa Aesar</td><td>A11313</td><td></td></tr><tr><td>pDEST Vektor (modifizierter Zielvektor mit I-SceI-Erkennungsstellen)</td><td>Dr. C. Grabher, Karlsruher Institut für Technologie, Karlsruhe, Deutschland</td><td>N/A</td><td>ein großzügiges Geschenk</td></tr><tr><td>pDONR 221 Gateway Spendervektor</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>12536-017</td><td></td></tr><tr><td>pDONRP4-P1R Spendervektor</td><td>&nbsp;Dr. Chi-Bin Chien, Univ. of Utah</td><td>N/A</td><td>ein großzügiges</td></tr><tr><td>Geschenk Phenolrot, 0,5%</td><td>Sigma Aldrich</td><td>&nbsp; P0290</td><td></td></tr><tr><td>Phosphatgepufferte Kochsalzlösung (PBS), 10X</td><td>BioRad</td><td>1610780</td><td></td></tr><tr><td>Picrosirrius Rotes Färbekit</td><td>Polysciences</td><td>24901-250</td><td></td></tr><tr><td>pME-mCherry</td><td>Addgene</td><td>26028</td><td></td></tr><tr><td>Proteinase K, rekombinant, PCR-Qualität</td><td>Roche</td><td>21712520</td><td></td></tr><tr><td>QIAprep Spin MiniPrep Kit</td><td>Qiagen</td><td>27104</td><td></td></tr><tr><td>RDO Schnellentkalker</td><td>Apex Enginerring</td><td>RDO04</td><td></td></tr><tr><td>Natriumazid (NaN3)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>26628-22-8</td><td></td></tr><tr><td>Stereo-Fluoreszenzmikroskop</td><td>Leica</td><td>MZ10F</td><td></td></tr><tr><td>Stereoskopisches Fluoreszenzmikroskop mit digitalem Visier DS-U1 Kamera für die Bildgebung</td><td>Nikon</td><td>SMZ-1500</td><td></td></tr><tr><td>Taq DNA Polymerase</td><td>New England Biolabs, MA</td><td>M0273L</td><td></td></tr><tr><td>Tissue-Tek VIP&reg; &nbsp; 6 AI Vakuum-Infiltrationsprozessor</td><td>Sakura</td><td>N/A</td><td>Modell #: VIP-6-A1</td></tr><tr><td>Tricaine-S</td><td>Western Chemical Incorporated</td><td>20513</td><td></td></tr><tr><td>Xylol</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>X3P1GAL</td><td></td></tr></tbody></table>

zebrafisch-modell der neuroblastom-metastasierung

Zebrafish Model of Neuroblastoma Metastasis

Zebrafische haben sich zu einem wichtigen Tiermodell entwickelt, um menschliche Krankheiten, insbesondere Krebs, zu untersuchen. Zusammen mit den robusten transgenen und Genom-Editing-Technologien, die bei der Zebrafischmodellierung eingesetzt werden, machen die einfache Wartung, die ertragreiche Produktivität und die leistungsstarke Live-Bildgebung den Zebrafisch insgesamt zu einem wertvollen Modellsystem, um Metastasen und zelluläre und molekulare Grundlagen, die diesem Prozess zugrunde liegen, in vivo zu untersuchen. Das erste Zebrafisch-Neuroblastom -Modell (NB) der Metastasierung wurde durch Überexpression von zwei Onkogenen, MYCN und LMO1, unter Kontrolle des Dopamin-beta-Hydroxylase (dβh) -Promotors entwickelt. Co-überexprimiertes MYCN und LMO1 führten zur reduzierten Latenz und erhöhten Penetranz der Neuroblastomagenese sowie zu einer beschleunigten Fernmetastasierung von Tumorzellen. Dieses neue Modell wiederholt zuverlässig viele Schlüsselmerkmale der metastasierenden NB beim Menschen, einschließlich der Beteiligung klinisch relevanter und metastasenassoziierter genetischer Veränderungen; natürliche und spontane Entwicklung von Metastasen in vivo; und konservierte Metastasenstellen. Daher besitzt das Zebrafischmodell einzigartige Vorteile, um den komplexen Prozess der Tumormetastasierung in vivo zu analysieren.

Um festzustellen, ob LMO1 mit MYCN synergisiert, um die NB-Pathogenese zu beeinflussen, wurden transgene Konstrukte, die die Expression von entweder LMO1 (dβh:LMO1 und dβh:mCherry) oder MYCN (dβh:EGFP-MYCN) in den PSNS-Zellen unter Kontrolle des dβh-Promotors steuern, in Zebrafischembryonen injiziert13. Wie in Abbildung 1A dargestellt, wurden nach der Entwicklung stabiler transgener Linien und der...

Diese Arbeit stellt die Methode der Entwicklung, Charakterisierung und Verfolgung in Echtzeit der Tumormetastasierung im Zebrafischmodell des Neuroblastoms vor, insbesondere in der transgenen Zebrafischlinie mit Überexpression von MYCN und LMO1, die spontan Metastasen entwickelt.

Zebrafisch-Modell der Neuroblastom-Metastasierung

Zebrafish has emerged as an important animal model to study human diseases, especially cancer. Along with the robust transgenic and genome editing ...

Mit diesen Methoden wurde das erste Zebrafischmodell der Neuroblastom-Metastasierung entwickelt. Und um zu zeigen, dass dieses Modell viele Merkmale der Metastasierung, die bei Patienten mit hohem Neuroblastomrisiko beobachtet wurden, getreu rekapitulieren kann. Der Hauptvorteil dieses metastasierenden Zebrafischmodells ist die Echtzeit-In-vivo-Bildgebung der Tumorverbreitung, um besser zu verstehen, wann und möglicherweise wie Metastasen auftreten.Diese Technik ist nicht spezifisch für Neuroblastome. Es kann auf Zebrafischmodelle verschiedener Krebsarten angewendet werden, solange die Tumorzellen identifiziert und verfolgt werden können, was zu einer Reihe von Möglichkeiten führt. Entwickeln Sie zunächst eine heterozygote transgene Fischlinie, die sowohl MYCN als auch LMO1 überexprimiert, indem Sie MYCN- und LMO1-transgene Linien kreuzen.Verwenden Sie eines Tages nach der Befruchtung ein stereoskopisches Fluoreszenzmikroskop, um die Nachkommen der Auskreuzung für die EGFP-Expression zu sortieren, die sich als EGFP-positive Punkte präsentiert. Nach dem Sortieren isolieren Sie die gescreenten Embryonen in separate Petrischalen und kennzeichnen sie die Schalen als MYCN-positiv oder MYCN-negativ. Visualisieren und sortieren Sie Embryonen beider Gruppen für die LMO1-Expression drei bis vier Tage nach der Befruchtung.Suchen Sie nach roten Fluoreszenzflecken sowohl im oberen zervikalen Ganglion als auch in nicht-PSNS-dopaminergen neuronalen Zellen, insbesondere in der Oblongata-Medulla des Hinterhirns. Führen Sie das Screening durch, bevor die Embryonen fünf Tage nach der Befruchtung erreichen. Dann isolieren Sie sortierte Fische in vier Gruppen verschiedener Genotypen und kennzeichnen Sie sie nur als MYCN, nur LMO1, MYCN und LMO1 sowie als Wildtyp.Heben Sie sie unter identischen Bedingungen gemäß Standardprotokollen an. Visualisieren Sie Tumore mit einem stereoskopischen Fluoreszenzmikroskop, indem Sie Fische vorsichtig mit einem Metallspatel auf beiden seitenseitigen Seiten umdrehen, um den Tumor zu sehen. Nach der Identifizierung der möglichen tumortragenden Fische isolieren Sie sie in einem separaten Tank mit entsprechenden Etiketten, die das Geburtsdatum, das Datum, an dem der Tumor untersucht wurde, und den Genotyp enthalten.Wiederholen Sie sechs Wochen nach der Befruchtung die vorherigen Schritte, um nach tumortragenden Fischen und nicht tumortragenden Fischen zu suchen, um das Vorhandensein von Tumoren für zuvor gescreente Fische zu bestätigen oder neue mögliche tumortragende Fische zu identifizieren. Suchen Sie nach der anhaltenden oder erhöhten Größe der fluoreszenzpositiven Masse und des bestätigten tumortragenden Fisches. Nachdem Sie tumortragende Fische identifiziert haben, überwachen Sie sie zweiwöchentlich auf Hinweise auf eine Tumorzellmigration, die sich als winzige EGFP- oder mCherry-positive Tumormassen weit vom primären Ort der Tumorgenese entfernt präsentiert.Isolieren Sie diese Fische bei Bedarf in separaten Tanks und kennzeichnen Sie sie entsprechend, um mögliche Metastasen anzuzeigen. Nach der Interpretation des heterozygoten MYCN in LMO1-Fischen und beim Sortieren ihrer Nachkommen war die EGFP MYCN-Expression in den nicht-PSNS-dopaminergen neuronalen Zellen einen Tag nach der Befruchtung prominent. Im Gegensatz dazu war die LMO1-Expression sowohl in PSNS-Zellen als auch in nicht-PSNS-dopaminergen neuronalen Zellen prominent.Fluoreszierende positive Tumormassen wurden in Geweben in Organen nachgewiesen, die von der primären Tumorstelle in der Verbindung transgener Fische mit Überexpression von MYCN und LMO1 entfernt sind, aber nicht in den transgenen Fischen mit der Expression von MYCN allein. H & E-Färbungen der chirurgischen Abschnitte zeigen, dass der Primärtumor aus der Interrenaldrüsenregion entstand, dem Zebrafisch-Äquivalent der menschlichen Nebenniere, die die häufigste Stelle der Primärerkrankung bei Neuroblastompatienten ist. Tumormassen, die von der Interrenaldrüse entfernt sind, wurden in mehreren Regionen nachgewiesen, einschließlich des distalen Teils der Niere, der Orbita, der Kieme, der Milz und der Innenwand der Vorhofkammer des Herzens.Die PSNS-Neuroblastenlinie von Tumorzellen am Primärtumor und allen metastasierenden Stellen wurde bestätigt. Signifikant amplifizierte Mengen und eine erhöhte Dicke von PSR-gefärbten Kollagenfasern wurden in MYCN LMO1-Tumoren im Vergleich zu den Tumoren, die MYCN allein exprimieren, gefunden. Nach der Anwendung dieses Verfahrens können ein Arzneimittelscreening und das Testen neuartiger Krebstherapien angewendet werden, die möglicherweise zur Entwicklung alternativer Wirkstoffe zur Vorbeugung und Behandlung von metastasierenden Krebserkrankungen führen können.

zebrafish-model-of-neuroblastoma-metastasis

Research

Forschung

JoVE Journal

Cancer Research

Krebsforschung

Dieses Video beschreibt eine Mikroinjektionsmethode für die Verabreichung von Brustkrebszellen in den perivitellinischen Raum von transgenen Zebrafischembryonen. Nach der Inkubation visualisieren wir den Embryo unter einem Fluoreszenzmikroskop, um die Invasion, Verbreitung und Metastasierung von Krebszellen zu beobachten.

zPDX-Analyse der Invasivität: Untersuchung des invasiven Verhaltens von metastasierten Krebszellen in Zebrafischembryonen Xenotransplantaten

Eine schnelle Weg zum Bildschirm für die Melanom-Modifikatoren mit einem Zebrafisch autochthonen Tumormodell vorgestellt. Es nutzt die miniCoopR Vektor, der zur Expression von Melanom-Kandidat Gene in Melanozyten ermöglicht. Verfahren zur Melanom Überleben Kurven, eine Invasion Assay, ein Protokoll für Antikörperfärbung Maßstab von Melanozyten und Melanomzellen eine Transplantation Assay erhalten werden beschrieben.

Screening für Melanom Modifiers mit einem Zebrafisch Autochthone Tumormodell

Das Ziel dieser Studie ist es zu zeigen, wie die Mosaik-Transgenese-Strategie im Zebrafisch verwendet werden kann, um die relativen Beiträge mehrerer Onkogene zur Tumorinitiierung und -progression in vivo schnell und effizient zu bewerten.

Mosaic Zebrafisch Transgenese für Funktionelle Genomanalyse Candidate Cooperative Gene in Tumor Pathogenese

Dieses Verfahren nutzt Zebrabärblingembryonen effizient die Gefäß invasive Fähigkeit von Krebszellen zu testen. Fluoreszierende Krebszellen werden in den precardiac Sinus oder Dottersack von sich entwickelnden Embryonen injiziert. Krebszelle Gefäßinvasion und Extravasation wird über Fluoreszenzmikroskopie des Heckbereich 24 bis 96 Stunden später bewertet.

Testen des Vascular Invasive Fähigkeit von Krebszellen in Zebrabärbling (<em&gt; Danio rerio</em&gt;)

Hier beschreiben wir Xenotransplantat Zebrabärbling Modelle mit zwei verschiedenen Injektionsstellen, dh perivitellinen Raum und Kanal von Cuvier, das invasive Verhalten zu untersuchen und die intravasation und Extravasation Potential von menschlichen Brustkrebszellen zu bewerten sind.

Invasive Verhalten von menschlichen Brustkrebszellen in embryonalem Zebrabärbling

Die Transplantation von Krebszellen ist ein wichtiges Instrument zur Identifizierung von Krebsmechanismen und therapeutischen Reaktionen. Aktuelle Techniken hängen von immune-inkompetenten Tieren ab. Hier beschreiben wir eine Methode zur Transplantation von Zebrafisch-Tumorzellen in immunkompetenten Embryonen zur Langzeitanalyse des Tumorzellverhaltens und in vivo- Arzneimittelwirkungen.

Transplantation von Zebrafisch-pädiatrischen Hirntumoren in immune-kompetente Wirte für die Langzeitstudie von Tumorzellverhalten und Drug Response

Hier zeigen wir den Prozess der Erstellung einer zellulären elektrische Spannung Reporter Zebrafisch Linie um embryonale Entwicklung, Bewegung, zu visualisieren und Fisch Tumorzellen in Vivo.

Visualisierung von zellulären elektrische Aktivität im frühen Zebrafish Embryos und Tumoren

Hier bieten wir ein Schritt-für-Schritt-Protokoll mit Tipps zur Generierung von Xenografts und Richtlinien für die Tumorverhaltensanalyse, die Immunfluoreszenz mit voller Montätralisierung und die konfokale Bildgebungsquantifizierung.

Generation von Zebrafischen Larval Xenografts und Tumorverhaltensanalyse

Wir berichten über eine Technik, die eine Live-Bildgebung der Mikrotubulidynamik in Glioblastomzellen (GBM) ermöglicht, die in ein Hirngewebe von Wirbeltieren eindringen. Die Kopplung der orthotopischen Injektion von fluoreszenzmarkierten GBM-Zellen in ein transparentes Zebrafischgehirn mit hochauflösender intravitaler Bildgebung ermöglicht die Messung der Dynamik des Zytoskeletts während der in situ Krebsinvasion.

Live-Bildgebung der Mikrotubulidynamik in Glioblastomzellen, die in das Zebrafischgehirn eindringen

Wir beschreiben ein Protokoll für die Xenotransplantation in das Eigelb von transparenten Zebrafischembryonen, das durch eine einfache, schnelle Staging-Methode optimiert wird. Die Analysen nach der Injektion umfassen das Überleben und die Beurteilung der Krankheitslast von xenotransplantierten Zellen durch Durchflusszytometrie.

Eine einfache, schnelle und effektive Methode zur Analyse der Tumor-Xenotransplantation in transparenten Zebrafischembryonen

Erfahren Sie die Entwicklung eines Zebrafisch-Modells zur Untersuchung der Neuroblastom-Metastasierung mit MYCN- und LMO1-Überexpression. Diese Methode ermöglicht Echtzeit-In-vivo-Bildgebung von Tumorzellstreuung und Metastasierung.

Zebrafisch-Modell der Neuroblastom-Metastasierung

Weitere Videos entdecken