Name: Herstellung von Ratten-Skelettmuskelhomogenaten für Nitrat- und Nitritmessungen (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-07-29T13:30:00.000+00:00
Duration: 7 min 19 s
Description: Lernen Sie die Herstellung von Ratten-Skelettmuskelhomogenaten zur präzisen Nitrat- und Nitritmessung. Diese Methode ermöglicht zuverlässige Analysen des NO-Stoffwechsels in Muskelgewebe.

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Diese Arbeit wurde durch das interne NIH / NIDDK-Stipendium ZIA DK 0251041-14 an Alan N Schechter, MD, unterstützt.

Das Tierprotokoll wurde vom NIDDK Animal Care and Use Committee (ASP K049-MMB-20) genehmigt. Die Tiere wurden gemäß dem aktuellen Leitfaden für die Pflege und Verwendung von Labortieren behandelt und behandelt, der auf der AAALAC-Website frei verfügbar ist.
1. Sammlung von Skelettmuskeln der Ratte
<ol><li>Während eine Ratte unter tiefer Narkose steht (5% Isofluran, bestätigt durch fehlende Reaktion auf Schwanz- / Beinklemmung), beginnen Sie mit der Perfusion mit Heparin-haltiger Kochsalzlösung, indem Sie eine 19-G-Nadel in eine Spitze des linken Ventrikels einführen und einen Nick im rechten Vorhof machen. Kochsalzlösung mit Heparin durch die inneren Organe durchsickern lassen, bis mindestens 1,5 Liter/kg durch das Gewebe geflossen sind. Zu diesem Zeitpunkt sind die Tiere durch Entblutung tot und die Kadaver sind bereit, für die Probenentnahme verarbeitet zu werden. HINWEIS: Eine gute Perfusion ist entscheidend, insbesondere für genaue Messungen von Nitrit, da Nitrit durch das verbleibende Hämoglobin zu Nitrat oxidiert wird.</li>
	<li>Identifizieren Sie Zielmuskelgewebe und entfernen Sie es aus den Hinterbeinen22 mit sauberen chirurgischen Instrumenten. Entfernen Sie so viel Fett und Bindegewebe wie möglich aus dem Muskelgewebe.</li>
	<li>Legen Sie die gewünschte Muskelmenge in ein Mikrozentrifugenröhrchen und legen Sie sie dann auf Trockeneis. Bewahren Sie die mit Gewebe gefüllten Röhrchen im -80 °C Gefrierschrank auf. HINWEIS: Bei menschlichen Biopsieproben sofort nach der Entnahme gründlich mit sauberer Gaze abtupfen, um überschüssiges Blut zu entfernen.</li>
</ol>2. Vorbereitung für die Homogenisierung
<ol><li>Herstellung einer nitritkonservierenden Lösung (Stopplösung)<ol><li>Eine klare gelbe Lösung, die 890 mM Kaliumferricyanid (K3Fe (CN) 6) und 118 mM NEM (N-Ethylmaleimid) enthält, wird in destilliertem Wasser hergestellt, wobei keine Kristalle zu vermeiden sind. Fügen Sie nichtionisches Tensid (Reinigungsmittel) im Verhältnis 1:9 (v/v, Table of Materials) hinzu und mischen Sie vorsichtig, um Schaumbildung zu vermeiden.</li>
		<li>Die Stopplösung wird im Verhältnis 1:9 mit destilliertem Wasser verdünnt. Legen Sie die verdünnte Stopplösung (Verhältnis 1:5 von Muskelgewebe zu verdünnter Stopplösung) in das Homogenisierungsröhrchen. HINWEIS: Zwanzig Milligramm Gewebe erfordern 100 μL Stop-Lösung und 200 mg Gewebe erfordern 1000 μL Stop-Lösung in der Röhre. Das Vorhandensein von Reinigungsmittel in der zugesetzten Lösung ist entscheidend für die Störung der Zellmembranen. Jedes nichtionische Reinigungsmittel kann verwendet werden, aber es muss darauf geachtet werden, dass es die Chemilumineszenzmethode nicht stört.</li>
	</ol></li>
	<li>Gewebepräparation<ol><li>Das Gewebe aus dem -80 °C Gefrierschrank nehmen und langsam in Eis auftauen. Entfernen Sie das restliche Fett und Bindegewebe aus der Skelettmuskulatur. Schneiden Sie Stücke der Skelettmuskulatur ab und tupfen Sie sie zum Trocknen auf Gaze.</li>
		<li>Wiegen Sie die Menge an Gewebe (20, 50 und 200 mg). Legen Sie den vorgewogenen Skelettmuskel in die Stop-Lösung in den Homogenisierungsröhrchen oder legen Sie das vorgewogene Gewebe zur späteren Verwendung in ein sauberes Mikrozentrifugenröhrchen.</li>
	</ol></li>
</ol>3. Homogenisierung
<ol><li>Rotationshomogenisator (Abbildung 1)<ol><li>Setzen Sie das M-Typ-Röhrchen mit der vorgewogenen Skelettmuskulatur und der vorgemessenen Stopplösung in das Gerät ein. Homogenisieren Sie jede Probe zweimal (Einstellung auf den zerstörerischsten Homogenisierungszyklus) und legen Sie das Röhrchen unmittelbar nach jeder Homogenisierung für 5 min zum Abkühlen auf Eis.</li>
		<li>Bei 2.000 × g und 4 °C 5 min kurz zentrifugieren. Legen Sie das volle Röhrchen wieder auf Eis und fügen Sie die entsprechende Menge Methanol hinzu (≥ 99,9 %, 10x des Gewebegewichts). Wirbel gründlich für 15 s. HINWEIS: Verwenden Sie für 20 mg Gewebe 200 μL Methanol. Methanol wird verwendet, um Proteine aus Gewebehomogenat auszufällen und stört die Chemilumineszenzmethode nicht. Wenn eine andere Proteinfällungsmethode verwendet wird, testen Sie die Kompatibilität mit Chemilumineszenz.</li>
		<li>Noch einmal homogenisieren und 30 min auf Eis inkubieren. Zentrifugieren Sie die Proben für 35 min bei 4 °C und 3.500 × g. Saugen Sie den Überstand ab und messen Sie den Nitrit-/Nitratgehalt oder lagern Sie ihn bei -80 °C für den späteren Gebrauch.</li>
	</ol></li>
	<li>Perlenhomogenisator (Abbildung 2)<ol><li>Legen Sie das Skelettmuskelgewebe in ein perlenhaltiges Röhrchen (Verhältnis 1:5 für Gewebe: verdünnte Stopplösung) und homogenisieren Sie zweimal für 45 s bei der höchsten Geschwindigkeit, die auf dem verwendeten Instrument verfügbar ist. Legen Sie das Röhrchen sofort nach jeder Homogenisierung für 5 min zum Abkühlen auf Eis.</li>
		<li>Mit einer kleinen Tischzentrifuge (2.000 x g) 5 Sek. kurz zentrifugieren. Legen Sie das Röhrchen wieder auf Eis und fügen Sie eine entsprechende Menge Methanol hinzu (Reinheit ≥ 99,9 %, 10x des Gewebegewichts). Wirbel gründlich für 15 s. ANMERKUNG 1: Verwenden Sie für 20 mg Gewebe 200 μL Methanol. ANMERKUNG 2: Methanol wird verwendet, um Proteine aus Gewebehomogenat auszufällen und stört nicht die Chemilumineszenzmethode. Wenn eine andere Proteinfällungsmethode verwendet wird, testen Sie die Kompatibilität mit Chemilumineszenz.</li>
		<li>Homogenisieren Sie erneut für 45 s bei der höchsten Geschwindigkeit, die mit dem verwendeten Gerät verfügbar ist. Auf Eis 30 min inkubieren. Zentrifuge bei 17.000 x g, 4 °C, 30 min. Saugen Sie den Überstand ab und messen Sie den Nitrit-/Nitratgehalt oder lagern Sie ihn bei -80 °C für den späteren Gebrauch.</li>
	</ol></li>
	<li>Pulverisierer (Abbildung 3)<ol><li>Bereiten Sie Röhrchen mit verdünnter Stopplösung (5x des Gewebegewichts) vor und wiegen Sie sie. Notieren Sie das Gewicht (Schlauch + Anschlaglösung).</li>
		<li>Legen Sie das Flüssigstickstoffpulverwerkzeug auf Trockeneis und warten Sie ca. 30 Minuten, bis es die gewünschte Temperatur erreicht hat.</li>
		<li>Mit einer in flüssigem Stickstoff gekühlten Pinzette eine Probe (bereits gemessenes Gewebegewicht) in den Pulverisierer überführen. Fügen Sie einen kleinen Löffel flüssigen Stickstoff hinzu, um sicherzustellen, dass das Gewebe bei flüssiger Stickstofftemperatur ist.</li>
		<li>Nachdem 95% des flüssigen Stickstoffs verdampft sind, legen Sie das Zerkleinerungswerkzeug auf das Gewebe und drücken Sie fest. Sie sollten die Probe zerquetschen fühlen. Schlagen Sie mit dem Schlägel 3-5x auf das Brechwerkzeug.</li>
		<li>Überprüfen Sie die Probe mit einem in flüssigem Stickstoff gekühlten Löffel auf verbleibende Stücke. Nach dem Abkühlen in flüssigem Stickstoff verwenden Sie ein Stück Seidenpapier, um gefrorenes Wasser abzuwischen, bevor Sie das Gewebe berühren. Wenn ein Stück vorhanden ist, bewegen Sie es in die Mitte und schlagen Sie dann 5-6 weitere Male mit dem Schlägel.</li>
		<li>Wenn die gesamte Probe pulverisiert wurde, wird das zerkleinerte Gewebe mit dem mit flüssigem Stickstoff gekühlten Löffel direkt in das vorgewogene Röhrchen mit der verdünnten Stopplösung überführt (Schritt 3.3.1). Stellen Sie sicher, dass Sie diesen Schritt schnell ausführen, denn wenn sich der zerquetschte Skelettmuskel erwärmt, wird er klebrig und schwer zu übertragen.</li>
		<li>Wirbel für 15 s. Stellen Sie sicher, dass kein Gewebe an der Oberseite des Röhrchens steckt, indem Sie das Röhrchen öffnen. Wenn ja, versuchen Sie, es zu entfernen und dann wieder zu wirbeln.</li>
		<li>Zentrifugieren Sie die Probe für 2-3 s mit einer kleinen Tischzentrifuge. Wiegen Sie das Röhrchen erneut. Berechnen Sie das Gewebegewicht, indem Sie das ursprüngliche Schlauchgewicht (Schritt 3.3.1) von diesem neuen Gewicht abziehen. Legen Sie die Röhre auf Eis. HINWEIS: Die genauen Gewichte helfen, das genaue Gewebegewicht zu bestimmen und wie viel Gewebe während der Pulverisierung verloren ging.</li>
		<li>Nachdem alle Proben bis Schritt 3.3.8 verarbeitet wurden, wird ein geeignetes Volumen Methanol (≥ 99,9 %, 10x des Gewebegewichts) hinzugefügt. 15 s gründlich durchziehen und 30 min auf Eis inkubieren. HINWEIS: Verwenden Sie für 20 mg Gewebe 200 μL Methanol. Methanol wird verwendet, um Proteine aus Gewebehomogenat auszufällen und stört die Chemilumineszenzmethode nicht. Wenn eine andere Proteinfällungsmethode verwendet wird, testen Sie die Kompatibilität mit Chemilumineszenz.</li>
		<li>Zentrifuge bei 17.000 × g, 4 °C, 30 min. Saugen Sie den Überstand ab und messen Sie den Nitrit-/Nitratgehalt oder lagern Sie ihn bei -80 °C für die spätere Verwendung.</li>
	</ol></li>
</ol>4. Nitrit/Nitrat-Messung mit Stickstoffmonoxid-Analysator (NOA)
<ol><li>Bereiten Sie alle Proben mit einer der drei verschiedenen oben beschriebenen Homogenisierungsmethoden vor und injizieren Sie sie in eine NOA für die Nitrat- und Nitritmessung. HINWEIS: Detaillierte Protokolle für die NOA-Verwendung wurden zuvorveröffentlicht 19.</li>
</ol>

<ol><li>Ignarro, L. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nitric+oxide+as+a+unique+signaling+molecule+in+the+vascular+system%3A+a+historical+overview%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Physiology+and+Pharmacology%22%5BJournal%5D)">Nitric oxide as a unique signaling molecule in the vascular system: a historical overview.</a> Journal of Physiology and Pharmacology. 53 (4), Pt 1 503-514 (2002).</li>
<li>Moncada, S., Higgs, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+L-arginine-nitric+oxide+pathway%5BTitle%5D)+AND+%22New+England+Journal+of+Medicine%22%5BJournal%5D)">The L-arginine-nitric oxide pathway.</a> New England Journal of Medicine. 329 (27), 2002-2012 (1993).</li>
<li>Thomas, D. D., Liu, X., Kantrow, S. P., Lancaster, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+biological+lifetime+of+nitric+oxide%3A+implications+for+the+perivascular+dynamics+of+NO+and+O2%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">The biological lifetime of nitric oxide: implications for the perivascular dynamics of NO and O2.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 98 (1), 355-360 (2001).</li>
<li>Lundberg, J. O., Weitzberg, E., Gladwin, M. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+nitrate-nitrite-nitric+oxide+pathway+in+physiology+and+therapeutics%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Drug+Discovery%22%5BJournal%5D)">The nitrate-nitrite-nitric oxide pathway in physiology and therapeutics.</a> Nature Reviews Drug Discovery. 7 (2), 156-167 (2008).</li>
<li>Govoni, M., Jansson, E. A., Weitzberg, E., Lundberg, J. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+increase+in+plasma+nitrite+after+a+dietary+nitrate+load+is+markedly+attenuated+by+an+antibacterial+mouthwash%5BTitle%5D)+AND+%22Nitric+Oxide%22%5BJournal%5D)">The increase in plasma nitrite after a dietary nitrate load is markedly attenuated by an antibacterial mouthwash.</a> Nitric Oxide. 19 (4), 333-337 (2008).</li>
<li>Jansson, E. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+mammalian+functional+nitrate+reductase+that+regulates+nitrite+and+nitric+oxide+homeostasis%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Chemical+Biology%22%5BJournal%5D)">A mammalian functional nitrate reductase that regulates nitrite and nitric oxide homeostasis.</a> Nature Chemical Biology. 4 (7), 411-417 (2008).</li>
<li>Piknova, B., Park, J. W., Kwan Jeff Lam, K., Schechter, A. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nitrate+as+a+source+of+nitrite+and+nitric+oxide+during+exercise+hyperemia+in+rat+skeletal+muscle%5BTitle%5D)+AND+%22Nitric+Oxide%22%5BJournal%5D)">Nitrate as a source of nitrite and nitric oxide during exercise hyperemia in rat skeletal muscle.</a> Nitric Oxide. 55-56, 54-61 (2016).</li>
<li>Cosby, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nitrite+reduction+to+nitric+oxide+by+deoxyhemoglobin+vasodilates+the+human+circulation%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Medicine%22%5BJournal%5D)">Nitrite reduction to nitric oxide by deoxyhemoglobin vasodilates the human circulation.</a> Nature Medicine. 9 (12), 1498-1505 (2003).</li>
<li>Shiva, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Deoxymyoglobin+is+a+nitrite+reductase+that+generates+nitric+oxide+and+regulates+mitochondrial+respiration%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation+Research%22%5BJournal%5D)">Deoxymyoglobin is a nitrite reductase that generates nitric oxide and regulates mitochondrial respiration.</a> Circulation Research. 100 (5), 654-661 (2007).</li>
<li>Millar, T. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Xanthine+oxidoreductase+catalyses+the+reduction+of+nitrates+and+nitrite+to+nitric+oxide+under+hypoxic+conditions%5BTitle%5D)+AND+%22FEBS+Letter%22%5BJournal%5D)">Xanthine oxidoreductase catalyses the reduction of nitrates and nitrite to nitric oxide under hypoxic conditions.</a> FEBS Letter. 427 (2), 225-228 (1998).</li>
<li>Benjamin, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stomach+NO+synthesis%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Stomach NO synthesis.</a> Nature. 368 (6471), 502(1994).</li>
<li>Lundberg, J. O., Weitzberg, E., Lundberg, J. M., Alving, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intragastric+nitric+oxide+production+in+humans%3A+measurements+in+expelled+air%5BTitle%5D)+AND+%22Gut%22%5BJournal%5D)">Intragastric nitric oxide production in humans: measurements in expelled air.</a> Gut. 35 (11), 1543-1546 (1994).</li>
<li>Larsen, F. J., Ekblom, B., Sahlin, K., Lundberg, J. O., Weitzberg, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+dietary+nitrate+on+blood+pressure+in+healthy+volunteers%5BTitle%5D)+AND+%22New+England+Journal+of+Medicine%22%5BJournal%5D)">Effects of dietary nitrate on blood pressure in healthy volunteers.</a> New England Journal of Medicine. 355 (26), 2792-2793 (2006).</li>
<li>Kapil, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inorganic+nitrate+supplementation+lowers+blood+pressure+in+humans%3A+role+for+nitrite-derived+NO%5BTitle%5D)+AND+%22Hypertension%22%5BJournal%5D)">Inorganic nitrate supplementation lowers blood pressure in humans: role for nitrite-derived NO.</a> Hypertension. 56 (2), 274-281 (2010).</li>
<li>Jones, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dietary+nitrate+supplementation+and+exercise+performance%5BTitle%5D)+AND+%22Sports+Medicine%22%5BJournal%5D)">Dietary nitrate supplementation and exercise performance.</a> Sports Medicine. 44, Suppl 1 35-45 (2014).</li>
<li>Piknova, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Skeletal+muscle+as+an+endogenous+nitrate+reservoir%5BTitle%5D)+AND+%22Nitric+Oxide%22%5BJournal%5D)">Skeletal muscle as an endogenous nitrate reservoir.</a> Nitric Oxide. 47, 10-16 (2015).</li>
<li>Wylie, L. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+skeletal+muscle+nitrate+store%3A+influence+of+dietary+nitrate+supplementation+and+exercise%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Physiology%22%5BJournal%5D)">Human skeletal muscle nitrate store: influence of dietary nitrate supplementation and exercise.</a> Journal of Physiology. 597 (23), 5565-5576 (2019).</li>
<li>Piknova, B., Schechter, A. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Measurement+of+nitrite+in+blood+samples+using+the+ferricyanide-based+hemoglobin+oxidation+assay%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Measurement of nitrite in blood samples using the ferricyanide-based hemoglobin oxidation assay.</a> Methods in Molecular Biology. 704, 39-56 (2011).</li>
<li>Piknova, B., Park, J. W., Cassel, K. S., Gilliard, C. N., Schechter, A. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Measuring+Nitrite+and+Nitrate%2C+Metabolites+in+the+Nitric+Oxide+Pathway%2C+in+Biological+Materials+using+the+Chemiluminescence+Method%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Measuring Nitrite and Nitrate, Metabolites in the Nitric Oxide Pathway, in Biological Materials using the Chemiluminescence Method.</a> Journal of Visualized Experiments. (118), e54879(2016).</li>
<li>Nyakayiru, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sodium+nitrate+ingestion+increases+skeletal+muscle+nitrate+content+in+humans%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Applied+Physiology%22%5BJournal%5D)">Sodium nitrate ingestion increases skeletal muscle nitrate content in humans.</a> Journal of Applied Physiology. 123 (3), 637-644 (2017).</li>
<li>Troutman, A. D., Gallardo, E. J., Brown, M. B., Coggan, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Measurement+of+nitrate+and+nitrite+in+biopsy-sized+muscle+samples+using+HPLC%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Applied+Physiology%22%5BJournal%5D)">Measurement of nitrate and nitrite in biopsy-sized muscle samples using HPLC.</a> Journal of Applied Physiology. 125 (5), 1475-1481 (2018).</li>
<li>Shinin, V., Gayraud-Morel, B., Tajbakhsh, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Template+DNA-strand+co-segregation+and+asymmetric+cell+division+in+skeletal+muscle+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Template DNA-strand co-segregation and asymmetric cell division in skeletal muscle stem cells.</a> Methods in Molecular Biology. 482, 295-317 (2009).</li>
<li>Long, G. M., Troutman, A. D., Fisher, A., Brown, M. B., Coggan, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Muscle+fiber+type+differences+in+nitrate+and+nitrite+storage+and+nitric+oxide+signaling+in+rats%5BTitle%5D)+AND+%22bioRxiv%22%5BJournal%5D)">Muscle fiber type differences in nitrate and nitrite storage and nitric oxide signaling in rats.</a> bioRxiv. , (2020).</li>
<li>Ohtake, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dietary+nitrite+supplementation+improves+insulin+resistance+in+type+2+diabetic+KKA%28y%29+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Nitric+Oxide%22%5BJournal%5D)">Dietary nitrite supplementation improves insulin resistance in type 2 diabetic KKA(y) mice.</a> Nitric Oxide. 44, 31-38 (2015).</li>
</ol>

Die Autoren erklären, dass sie keine Interessenkonflikte haben. Alan N. Schechter ist als Miterfinder mehrerer Patente aufgeführt, die an die National Institutes of Health für die Verwendung von Nitritsalzen zur Behandlung von Herz-Kreislauf-Erkrankungen erteilt wurden. Er erhält Lizenzgebühren auf der Grundlage der NIH-Lizenzierung dieser Patente für die klinische Entwicklung, aber keine andere Vergütung. Diese Vereinbarungen haben keinen Einfluss auf seine Einhaltung der JoVE-Zeitschriftenrichtlinien.

Um Veränderungen der NO-Metaboliten, Nitrat und Nitrit, in Abhängigkeit von physiologischen Eingriffen zu überwachen, ist es unerlässlich, die Spiegel dieser Ionen in den verschiedenen Organen zu messen, die für ihren Stoffwechsel entscheidend sind. Da Hämoglobin im Blut mit NO und seinen Metaboliten reagiert, ist es auch wichtig, Blut so schnell wie möglich aus Gewebeproben zu entfernen. So wurden die Tiere mit Kochsalzlösung perfundiert, bevor sie Skelettmuskelgewebe (Gesäß, TA, EDL, Gastrocnemius-Muskel) sammelten, un...

Stickstoffmonoxid (NO), ein kleines gasförmiges Signalmolekül, spielt eine entscheidende Rolle bei physiologischen und pathophysiologischen Prozessen1. NO kann aus L-Arginin durch endogene Enzyme der Familie der Stickstoffmonoxidsynthase (NOS) hergestellt werden, bevor es einer schnellen Oxidation zu Nitrat (NO3-) und möglicherweise Nitrit (NO2-) in Blut und Geweben 2,3 unterzogen wird. Kürzlich wurde gezeigt, dass diese Anionen in Säugetiersystemen wieder zu NO reduziert werden4. Nitrat wird in Nitrit umgewandelt, hauptsächlich durch kommensale bakterielle Nitratreduktasen in der Mundhöhle, die auf Ionen wirken, die von den Speicheldrüsen abgesondert und direkt aufgenommen werden 5, und in gewissem Maße durch Säugetierenzyme wie Xanthinoxidoreduktase 6,7. Nitrit kann durch verschiedene Mechanismen, einschließlich Desoxyhämoglobin8, Desoxymyoglobin9, molybdänhaltige Enzyme 10 und nicht-enzymatische Reduktion in Gegenwart von Protonen11,12, weiter zu NO reduziert werden.
Dieser Nitrat-Nitrit-NO-Weg wird unter hypoxischen Bedingungen verstärkt, wobei die NOS-Aktivität verringert wird, da NOS Sauerstoff für die NO-Erzeugung4 benötigt. Viele neuere Studien haben positive Auswirkungen von diätetischem Nitrat auf die Blutdruckregulierung und die Trainingsleistung berichtet, was darauf hindeutet, dass Nitratreduktionswege zur Verstärkung der NO-Signalisierung beitragen13,14,15. Frühere Studien haben gezeigt, dass einige Skelettmuskeln wahrscheinlich die wichtigsten Nitratspeicher im Körper sind16. Im Vergleich zu Blut oder anderen inneren Organen wie Leber enthält die Skelettmuskulatur (Gluteus maximus) deutlich höhere Nitratwerte und hat eine erhebliche Masse im Säugetierkörper. Es wurde gezeigt, dass Laufbandübungen die Nitratreduktion zu Nitrit und zu NO im Gesäß in einem Rattenmodell7 verstärken. Diese Ergebnisse deuten darauf hin, dass einige Skelettmuskeln wichtige Quellen für NO durch Nitratreduktionswege in physiologischen Situationen sein könnten. Neuere Studien deuten darauf hin, dass diese Ergebnisse, einschließlich Veränderungen des Muskelnitratspiegels während des Trainings, auch beim Menschen auftreten17.
Zwei der aktuellen Autoren hatten zuvor eine Methode zur Messung des Nitrat- und Nitritspiegels in Blut und anderen flüssigen Proben etabliert18. Als jedoch die Konzentrationen dieser Anionen in Gewebehomogenaten zunächst analysiert wurden, waren detaillierte Protokolle nicht verfügbar. Um die Nitrat-Nitrit-NO-Dynamik in verschiedenen Organen zu verstehen, war es unser Ziel, eine genaue und effiziente Methode zur Messung des Nitrat- und Nitritspiegels in Säugetiergeweben einschließlich der Skelettmuskulatur zu entwickeln. In früheren Studien wurden Nagetiergewebe verwendet, um zuverlässige Homogenisierungsprozesse zu entwickeln und dann den Nitrat- und Nitritgehalt in den Homogenaten 7,16,19 zu analysieren. Die Verwendung dieser Homogenisierungsmethode wurde auf menschliche Skelettmuskelbiopsieproben ausgeweitet, wobei die Werte bestätigt wurden und vor allem die für Muskeln im Vergleich zu Blut / Plasma beobachteten Werte in ähnlichen Bereichen und Verhältnissen lagen wie bei Nagetieren17. In den letzten Jahren haben auch andere Gruppen begonnen, den Nitrat- und Nitritgehalt in Skelettmuskelhomogenaten zu messen, und berichteten über vergleichbare Werte wie die unserer Gruppe20,21.
Ziel dieses Protokollpapiers ist es, die Herstellung von Skelettmuskelhomogenaten unter Verwendung von drei verschiedenen Homogenisierungsmethoden zur anschließenden Messung des Nitrat- und Nitritgehalts detailliert zu beschreiben. Zusätzlich wurden die Auswirkungen des zur Homogenisierung verwendeten Gewebegewichts auf die Werte von Nitrat und Nitrit in Skelettmuskelproben untersucht. Wir glauben, dass diese Methoden leicht auf andere Arten von Säugetiergeweben angewendet werden können. In jüngster Zeit wurde vor allem im Bereich der Sportphysiologie auf die möglichen Unterschiede in der Nitrat/Nitrit/NO-Physiologie nach Muskelgruppen geachtet. Wir berichten auch die Mengen an Nitrat und Nitrit in vier verschiedenen Nagetiermuskeln und finden eine ungleichmäßige Verteilung beider Ionen zwischen diesen verschiedenen Muskeln; Eine Beobachtung, die weiterer Untersuchungen bedarf.

<table><tbody><tr><td>gentleMACS Dissoziator</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-093-235</td><td></td></tr><tr><td>gentle MACS M Rohr</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-093-236</td><td>Länge: 87 mm; Durchmesser: 30 mm</td></tr><tr><td>Heparin Natrium</td><td>Hospira</td><td>NDC-0409-7620-13</td><td></td></tr><tr><td>Isofluran</td><td>Baxter</td><td>NDC-10019-360-60</td><td></td></tr><tr><td>Methanol</td><td>Sigma</td><td>646377</td><td></td></tr><tr><td>Minilys Bead Homogenisator</td><td>Bertin Instruments</td><td>P000673-MLYS0-A</td><td></td></tr><tr><td>NEM; N-Ethylmaleimid</td><td>Sigma</td><td>4260</td><td></td></tr><tr><td>Stickstoffmonoxid-Analysator</td><td>GE</td><td>Sievers NOA 280i</td><td></td></tr><tr><td>NP-40; 4-Nonylphenylpolyethylenglykol</td><td>Sigma</td><td>74385</td><td></td></tr><tr><td>Kaliumferricyanid; K3Fe(CN)6</td><td>Sigma</td><td>702587</td><td></td></tr><tr><td>Precellys Lysekit</td><td>Bertin Instruments</td><td>P000911-LYSK0-A</td><td>enthält 2 ml-Röhrchen mit 2,8 mm Keramikkügelchen (Zirkonoxid) für die Homogenisierung</td></tr><tr><td>Pulverisierer-Kit</td><td>Cellcrusher</td><td>Cellcrusher-Kit</td><td></td></tr></tbody></table>

herstellung von ratten-skelettmuskelhomogenaten für nitrat- und nitritmessungen

Preparation of Rat Skeletal Muscle Homogenates for Nitrate and Nitrite Measurements

Nitrationen (NO3-) galten früher als inerte Endprodukte des Stickstoffmonoxid (NO)-Stoffwechsels. Frühere Studien zeigten jedoch, dass Nitrationen bei Säugetieren durch einen zweistufigen Reduktionsmechanismus wieder in NO umgewandelt werden können: Nitrat wird hauptsächlich von oralen kommensalen Bakterien zu Nitrit (NO2-) reduziert, dann wird Nitrit durch verschiedene Mechanismen, einschließlich über Häm- oder Molybdän-haltige Proteine, zu NO reduziert. Dieser reduktive Nitratweg trägt zur Verbesserung der NO-vermittelten Signalwege bei, insbesondere im Herz-Kreislauf-System und bei Muskeltraining. Der Nitratgehalt im Körper vor einer solchen Verwertung wird durch zwei verschiedene Quellen bestimmt: endogene NO-Oxidation und Nitrataufnahme über die Nahrung, hauptsächlich aus Pflanzen. Um den komplexen NO-Zyklus unter physiologischen Bedingungen aufzuklären, haben wir die Dynamik seiner Metaboliten, Nitrat- und Nitritionen, die im Vergleich zu NO relativ stabil sind, weiter untersucht. In früheren Studien wurde die Skelettmuskulatur als Hauptspeicherorgan für Nitrationen bei Säugetieren sowie als direkte Quelle von NO während des Trainings identifiziert. Daher ist die Etablierung einer zuverlässigen Methodik zur Messung des Nitrat- und Nitritspiegels in der Skelettmuskulatur wichtig und sollte hilfreich sein, um ihre Anwendung auf andere Gewebeproben auszudehnen. Dieser Artikel erläutert ausführlich die Vorbereitung von Skelettmuskelproben mit drei verschiedenen Homogenisierungsmethoden für Nitrat- und Nitritmessungen und diskutiert wichtige Fragen im Zusammenhang mit Homogenisierungsprozessen, einschließlich der Größe der Proben. Nitrat- und Nitritkonzentrationen wurden auch über vier verschiedene Muskelgruppen hinweg verglichen.

Um repräsentative Ergebnisse zu erhalten, wurde Skelettmuskelgewebe von 8 Wistar-Ratten (Männchen und Weibchen, Gewicht 250 ± 50 g) verwendet. Ratten-Skelettmuskelhomogenate (50 mg Musculus gluteus maximus für jede Methode) wurden mit drei verschiedenen Homogenisierungswerkzeugen (rotierender Homogenisator, Perlenhomogenisator und Pulverisierer) hergestellt. Die Nitrat- und Nitritgehalte dieser Homogenate wurden dann mit einem Stickstoffmonoxid-Analysator (NOA) bestimmt (Abbildung 4). Die Ni...

Wir präsentieren Protokolle für drei verschiedene Methoden zur Homogenisierung von vier verschiedenen Muskelgruppen von Ratten-Skelettmuskelgewebe, um die Nitrat- und Nitritwerte zu messen und zu vergleichen. Darüber hinaus vergleichen wir verschiedene Probengewichte, um zu untersuchen, ob die Gewebeprobengröße die Ergebnisse der Homogenisierung beeinflusst.

Herstellung von Ratten-Skelettmuskelhomogenaten für Nitrat- und Nitritmessungen

Nitrate ions (NO3-) were once thought to be inert end products of nitric oxide (NO) metabolism. However, previous studies demonstrated that nitrate ions ...

Die Skelettmuskulatur dient als Hauptreservoir für Nitrat, das nach seiner Umwandlung in Nitrit als NO-Quelle während des Trainings dient. Hier stellen wir die Methodik vor, um diese Ionen in Muskel- und anderen Geweben zu messen. Um zu beginnen, bereiten Sie die nitratkonservierende oder stoppende Lösung vor, indem Sie 890 Millimolar Kaliumferricyanid und 118 Millimolar n-Methylmaleimid in destilliertem Wasser kombinieren, um sicherzustellen, dass keine Kristalle in Lösung verbleiben, dann fügen Sie ein nichtionisches Tensid in einem Verhältnis von 1 zu 9 hinzu und mischen Sie vorsichtig, um Schaumbildung zu vermeiden.Die Stopplösung wird im Verhältnis 1 zu 9 mit destilliertem Wasser verdünnt und die verdünnte Stopplösung in das Homogenisierungsröhrchen gegeben. Als nächstes tauen Sie das zuvor isolierte und gefrorene Rattenmuskelgewebe auf Eis auf. Sobald das Gewebe aufgetaut ist, entfernen Sie das restliche Fett und Bindegewebe aus der Skelettmuskulatur.Schneiden Sie Stücke des Skelettmuskels ab und tupfen Sie sie zum Trocknen auf eine Gaze. Wiegen Sie die entsprechende Menge Skelettmuskelgewebe ab und legen Sie dann das vorgewichtige Gewebe in die Homogenisierungsröhrchen, die die Stopplösung enthalten. Für die Homogenisierung in einem Rotationshomogenisator legen Sie das M-Typ-Röhrchen mit dem vorgewogenen Skelettmuskel und der vorgemessenen Stopplösung in die Maschine.Homogenisieren Sie jede Probe zweimal und legen Sie das Röhrchen nach jeder Homogenisierung sofort für 5 Minuten auf Eis, um abzukühlen. Nach der Homogenisierung das Röhrchen kurz zentrifugieren. Stellen Sie das Röhrchen wieder auf Eis und fügen Sie die entsprechende Menge Methanol hinzu, bevor Sie 15 Sekunden lang wirbeln.Homogenisieren Sie die Probe erneut und inkubieren Sie sie 30 Minuten lang auf Eis, zentrifugieren Sie dann die Probe, saugen Sie den Überstand an und fahren Sie mit der Messung des Nitrit- und Nitratgehalts fort. Für die Perlenhomogenisierung legen Sie das Skelettmuskelgewebe in ein perlenhaltiges Röhrchen und homogenisieren Sie zweimal für 45 Sekunden mit der höchsten Geschwindigkeit, die auf dem Instrument verfügbar ist. Nach jeder Homogenisierung das Röhrchen sofort für 5 Minuten auf Eis legen, um abzukühlen, dann zentrifugieren Sie das Röhrchen, legen Sie das Röhrchen wieder auf Eis und fügen Sie die entsprechende Menge Methanol hinzu, bevor Sie 15 Sekunden lang wirbeln.Homogenisieren Sie die Probe erneut für 45 Sekunden und inkubieren Sie sie dann 30 Minuten lang auf Eis. Zentrifugieren Sie die Probe, saugen Sie den Überstand ab und fahren Sie mit der Messung des Nitrit- und Nitratgehalts fort. Für die Homogenisierung auf Pulverisatorbasis bereiten Sie Röhrchen vor, die die verdünnte Stopplösung enthalten, wiegen und notieren Sie dann das Gewicht der Röhrchen.Nachdem Sie das Pulverwerkzeug 30 Minuten lang auf Trockeneis abgekühlt haben, mit einer in flüssigem Stickstoff gekühlten Pinzette die vorgewogene Gewebeprobe in den Pulverisierer überführen und dann eine kleine Menge flüssigen Stickstoffs hinzufügen, um sicherzustellen, dass das Gewebe flüssige Stickstofftemperatur hat. Nachdem 95% des flüssigen Stickstoffs verdampft sind, legen Sie das Zerkleinerungswerkzeug auf das Gewebe und drücken Sie fest, um die Probe zu spüren, und schlagen Sie dann mit einem Hammer 3 bis 5 Mal auf das Zerkleinerungswerkzeug. Wenn die gesamte Probe mit einem flüssigen, stickstoffgekühlten Löffel und einer Pinzette pulverisiert wurde, wird das zerkleinerte Gewebe direkt in das vorgewogene Röhrchen mit der verdünnten Stopplösung überführt.Als nächstes wirbeln Sie den Schlauch für 15 Sekunden und öffnen Sie dann den Schlauch, um nach Gewebe zu suchen, das im Deckel steckt. Wenn ja, versuchen Sie, es zu entfernen, dann Wirbel wieder. Zentrifugieren Sie die Probe kurz für 2 bis 3 Sekunden.Wiegen Sie das Röhrchen erneut und berechnen Sie das Gewebegewicht, indem Sie das ursprüngliche Schlauchgewicht von diesem neuen Gewicht abziehen. Legen Sie die Röhre auf Eis. Fügen Sie ein geeignetes Volumen Methanol in das Röhrchen und wirbeln Sie das Röhrchen gründlich für 15 Sekunden durch, bevor Sie es 30 Minuten lang auf Eis inkubieren, dann zentrifugieren Sie die Probe, saugen Sie den Überstand ab und fahren Sie mit der Messung des Nitrit- und Nitratgehalts fort.Nitratgehalte und Ratten-Skelettmuskelhomogenate, die mit einem rotierenden Homogenisator, einem Perlenhomogenisator und einem Pulverisierer hergestellt wurden, waren ähnlich. Interessanterweise zeigte die von einem Pulverisierer vorbereitete Homogenatprobe für den Nitritgehalt den höchsten Wert, der sich statistisch von den beiden anderen Probenwerten unterschied. Ein Vergleich der Nitrit- und Nitratgehalte in Gluteushomogenaten, die aus 20, 50 und 200 Milligramm Gewebe mit einem Perlenhomogenisator hergestellt wurden, zeigte, dass sich weder der Nitrat- noch der Nitritgehalt zwischen den Muskelprobengrößen signifikant unterschied.Der Vergleich der Nitratwerte in verschiedenen Skelettmuskelgeweben von Nagetieren zeigte, dass der Gesäßmuskel etwa doppelt so hohe Nitratwerte aufwies als die anderen drei Muskelgewebe. Diese Unterschiede erreichten jedoch keine statistische Signifikanz. Ähnlich wie die Nitratwerte war auch die Nitratkonzentration im Gesäßmuskel höher als in den anderen drei Muskelgeweben und signifikant höher als in der Gastrocnemiusprobe.Unsere Methode ist relativ einfach und eignet sich gut für kleine Proben, während Nitrat und Nitrit während der Probenvorbereitung erhalten bleiben.

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Research

Forschung

JoVE Journal

Biology

Biologie

Hier zeigen wir die Herstellung von Kollagen-basierten, baut Gewebe mit Skelettmyoblasten. Diese 3-D konstruiert Konstrukte verwendet zu ersetzen oder zu reparieren Gewebe...

Herstellung von Myogenic Engineered Tissue Konstrukte

Wir beschreiben а Protokoll für die Isolierung von reinen, stark gekoppelte Ratte-Mitochondrien für funktionelle oder strukturelle Untersuchungen der zellulären Bioenergetik, biophysikalische Messungen, Proteomik oder mitochondriale DNA und Lipiden Analyse.

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Die endogene Produktion von Stickstoffmonoxid (NO) reguliert eine Vielzahl von biologischen Funktionen. Es wird zunehmend klar, dass Störungen oder Fehlregulation der NO-basierter Signalisierung in vielen menschlichen Krankheiten beteiligt ist. Methoden zur Quantifizierung relevanter keine Metaboliten können neue diagnostische oder prognostische Biomarker für Erkrankungen des Menschen bieten.

Analytische Verfahren zur Bestimmung von Stickoxid Bioaktivität

Verfahren zur Biopsie des Vastus lateralis, Herstellung von gereinigtem Mitochondrien und respirometrischen Profiling beschrieben. Die Verwendung von kleinen Muskelvolumen macht diese Technik für klinische Forschung.

Vorbereitung und Respirometrische Bewertung der Mitochondrien isoliert aus dem Skelettmuskelgewebe durch perkutane Nadelbiopsie Erhalten

Hier präsentieren wir eine Modifikation einer zuvor berichteten Methode, die die Isolierung von qualitativ hochwertigen und gereinigten Mitochondrien aus kleineren Mengen von Maus-Skelettmuskeln ermöglicht. Dieses Verfahren führt zu hochgradig gekoppelten Mitochondrien, die während mikrotiterplattenbasierter Respirometirc-Assays mit hoher Funktion atmen.

Isolierung von Mitochondrien von minimalen Mengen an Maus-Skelettmuskel für die Hochdurchsatz-Mikroplatten-Atemmessungen

Stickstoffmonoxid (NO) ist ein wichtiges Signalmolekül in der vaskulären Homöostase. NEIN, die Produktion in vivo ist zu gering für eine direkte Messung. Die Chemilumineszenz bietet nützliche Einblicke in den NO-Zyklus durch die Messung seiner Vorläufer und Oxidationsprodukte, Nitrit und Nitrat. Die Nitrit-/Nitratbestimmung in Körpergeweben und -flüssigkeiten wird erläutert.

Mess Nitrit und Nitrat, Metabolite in der Stickoxid-Bahn, in biologischen Materialien der Chemilumineszenz-Methode unter Verwendung von

Hier präsentieren wir ein Protokoll für schnelle Muskelfaseranalysen, die eine verbesserte Färbequalität ermöglicht und dadurch die automatische Erfassung und Quantifizierung von Faserpopulationen die frei verfügbare Software ImageJ.

Ein schnelles automatisiertes Protokoll zur Muskelfaser Populationsanalyse in Rattenmuskelquerschnitte Mit Myosin Heavy Chain Immunhistochemie

Eine intakte Regulierung der Muskelglukoseaufnahme ist wichtig für die Aufrechterhaltung der Ganzkörperglukose-Homöostase. Dieses Protokoll stellt die Bewertung der insulin- und kontraktionsstimulierten Glukoseaufnahme in isolierten und inkubierten reifen Skelettmuskeln dar, wenn die Auswirkungen verschiedener physiologischer Interventionen auf den Glukosestoffwechsel des ganzen Körpers beschrieben werden.

Messung der insulin- und kontraktionsstimulierten Glukoseaufnahme in isolierten und inkubierten reifen Skelettmuskeln von Mäusen

Lernen Sie die Herstellung von Ratten-Skelettmuskelhomogenaten zur präzisen Nitrat- und Nitritmessung. Diese Methode ermöglicht zuverlässige Analysen des NO-Stoffwechsels in Muskelgewebe.

Herstellung von Ratten-Skelettmuskelhomogenaten für Nitrat- und Nitritmessungen

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