Herstellung von Ratten-Skelettmuskelhomogenaten für Nitrat- und Nitritmessungen

Die Skelettmuskulatur dient als Hauptreservoir für Nitrat, das nach seiner Umwandlung in Nitrit als NO-Quelle während des Trainings dient. Hier stellen wir die Methodik vor, um diese Ionen in Muskel- und anderen Geweben zu messen. Um zu beginnen, bereiten Sie die nitratkonservierende oder stoppende Lösung vor, indem Sie 890 Millimolar Kaliumferricyanid und 118 Millimolar n-Methylmaleimid in destilliertem Wasser kombinieren, um sicherzustellen, dass keine Kristalle in Lösung verbleiben, dann fügen Sie ein nichtionisches Tensid in einem Verhältnis von 1 zu 9 hinzu und mischen Sie vorsichtig, um Schaumbildung zu vermeiden.

Die Stopplösung wird im Verhältnis 1 zu 9 mit destilliertem Wasser verdünnt und die verdünnte Stopplösung in das Homogenisierungsröhrchen gegeben. Als nächstes tauen Sie das zuvor isolierte und gefrorene Rattenmuskelgewebe auf Eis auf. Sobald das Gewebe aufgetaut ist, entfernen Sie das restliche Fett und Bindegewebe aus der Skelettmuskulatur.

Schneiden Sie Stücke des Skelettmuskels ab und tupfen Sie sie zum Trocknen auf eine Gaze. Wiegen Sie die entsprechende Menge Skelettmuskelgewebe ab und legen Sie dann das vorgewichtige Gewebe in die Homogenisierungsröhrchen, die die Stopplösung enthalten. Für die Homogenisierung in einem Rotationshomogenisator legen Sie das M-Typ-Röhrchen mit dem vorgewogenen Skelettmuskel und der vorgemessenen Stopplösung in die Maschine.

Homogenisieren Sie jede Probe zweimal und legen Sie das Röhrchen nach jeder Homogenisierung sofort für 5 Minuten auf Eis, um abzukühlen. Nach der Homogenisierung das Röhrchen kurz zentrifugieren. Stellen Sie das Röhrchen wieder auf Eis und fügen Sie die entsprechende Menge Methanol hinzu, bevor Sie 15 Sekunden lang wirbeln.

Homogenisieren Sie die Probe erneut und inkubieren Sie sie 30 Minuten lang auf Eis, zentrifugieren Sie dann die Probe, saugen Sie den Überstand an und fahren Sie mit der Messung des Nitrit- und Nitratgehalts fort. Für die Perlenhomogenisierung legen Sie das Skelettmuskelgewebe in ein perlenhaltiges Röhrchen und homogenisieren Sie zweimal für 45 Sekunden mit der höchsten Geschwindigkeit, die auf dem Instrument verfügbar ist. Nach jeder Homogenisierung das Röhrchen sofort für 5 Minuten auf Eis legen, um abzukühlen, dann zentrifugieren Sie das Röhrchen, legen Sie das Röhrchen wieder auf Eis und fügen Sie die entsprechende Menge Methanol hinzu, bevor Sie 15 Sekunden lang wirbeln.

Homogenisieren Sie die Probe erneut für 45 Sekunden und inkubieren Sie sie dann 30 Minuten lang auf Eis. Zentrifugieren Sie die Probe, saugen Sie den Überstand ab und fahren Sie mit der Messung des Nitrit- und Nitratgehalts fort. Für die Homogenisierung auf Pulverisatorbasis bereiten Sie Röhrchen vor, die die verdünnte Stopplösung enthalten, wiegen und notieren Sie dann das Gewicht der Röhrchen.

Nachdem Sie das Pulverwerkzeug 30 Minuten lang auf Trockeneis abgekühlt haben, mit einer in flüssigem Stickstoff gekühlten Pinzette die vorgewogene Gewebeprobe in den Pulverisierer überführen und dann eine kleine Menge flüssigen Stickstoffs hinzufügen, um sicherzustellen, dass das Gewebe flüssige Stickstofftemperatur hat. Nachdem 95% des flüssigen Stickstoffs verdampft sind, legen Sie das Zerkleinerungswerkzeug auf das Gewebe und drücken Sie fest, um die Probe zu spüren, und schlagen Sie dann mit einem Hammer 3 bis 5 Mal auf das Zerkleinerungswerkzeug. Wenn die gesamte Probe mit einem flüssigen, stickstoffgekühlten Löffel und einer Pinzette pulverisiert wurde, wird das zerkleinerte Gewebe direkt in das vorgewogene Röhrchen mit der verdünnten Stopplösung überführt.

Als nächstes wirbeln Sie den Schlauch für 15 Sekunden und öffnen Sie dann den Schlauch, um nach Gewebe zu suchen, das im Deckel steckt. Wenn ja, versuchen Sie, es zu entfernen, dann Wirbel wieder. Zentrifugieren Sie die Probe kurz für 2 bis 3 Sekunden.

Wiegen Sie das Röhrchen erneut und berechnen Sie das Gewebegewicht, indem Sie das ursprüngliche Schlauchgewicht von diesem neuen Gewicht abziehen. Legen Sie die Röhre auf Eis. Fügen Sie ein geeignetes Volumen Methanol in das Röhrchen und wirbeln Sie das Röhrchen gründlich für 15 Sekunden durch, bevor Sie es 30 Minuten lang auf Eis inkubieren, dann zentrifugieren Sie die Probe, saugen Sie den Überstand ab und fahren Sie mit der Messung des Nitrit- und Nitratgehalts fort.

Nitratgehalte und Ratten-Skelettmuskelhomogenate, die mit einem rotierenden Homogenisator, einem Perlenhomogenisator und einem Pulverisierer hergestellt wurden, waren ähnlich. Interessanterweise zeigte die von einem Pulverisierer vorbereitete Homogenatprobe für den Nitritgehalt den höchsten Wert, der sich statistisch von den beiden anderen Probenwerten unterschied. Ein Vergleich der Nitrit- und Nitratgehalte in Gluteushomogenaten, die aus 20, 50 und 200 Milligramm Gewebe mit einem Perlenhomogenisator hergestellt wurden, zeigte, dass sich weder der Nitrat- noch der Nitritgehalt zwischen den Muskelprobengrößen signifikant unterschied.

Der Vergleich der Nitratwerte in verschiedenen Skelettmuskelgeweben von Nagetieren zeigte, dass der Gesäßmuskel etwa doppelt so hohe Nitratwerte aufwies als die anderen drei Muskelgewebe. Diese Unterschiede erreichten jedoch keine statistische Signifikanz. Ähnlich wie die Nitratwerte war auch die Nitratkonzentration im Gesäßmuskel höher als in den anderen drei Muskelgeweben und signifikant höher als in der Gastrocnemiusprobe.

Unsere Methode ist relativ einfach und eignet sich gut für kleine Proben, während Nitrat und Nitrit während der Probenvorbereitung erhalten bleiben.