Verwendung des fluoreszierenden Farbstoffs Rhodamin B zur Untersuchung der Paarungswettbewerbsfähigkeit bei männlichen Aedes aegypti-Moskitos
7. Mai 2021
Hier präsentieren wir ein Protokoll zur Untersuchung der Paarungswettbewerbsfähigkeit von männlichen Aedes aegypti unter Verwendung von Fluoreszenzfarbstoff als Marker. Weibliche Moskitos sind sowohl markierten als auch unmarkierten Männchen zur Kopulation ausgesetzt. Nach der Paarung werden ihre Spermatheken unter einem Fluoreszenzmikroskop untersucht, um ihren Paarungspartner zu bestimmen.
Dieses Protokoll misst die Paarungswettbewerbsfähigkeit männlicher Mücken, was eine Voraussetzung für programme zur Unterdrückung der männlichen Mückenpopulation ist. Dieses Eignungskriterium wird im Rahmen der Qualitätskontrolle und Dehnungsbewertung bewertet. Diese Methode reduziert die Versuchszeit um 90% und ermöglicht den direkten Vergleich der Paarungswettbewerbsfähigkeit zwischen zwei sterilen oder Wolbachia-infizierten Linien.
Diese Prozedur werden von Irene Li und Keng Wai Mak durchgeführt. Zu Beginn sexen die männlichen und weiblichen Moskitos im Puppenstadium, entsprechend ihren Größenunterschieden. Für jeden Satz Moskitos 100 männliche Puppen in einen vormarkierten Käfig für die Saccharosefütterung oder Rhodamin B Saccharosefütterung.
Legen Sie die weiblichen Puppen in kleine Chargen von 40 bis 50 pro Käfig. Überprüfen Sie bei der Entstehung der Imagos die Käfige auf das Vorhandensein männlicher Moskitos. Um die 0,2% Rhodamin B Saccharoselösung herzustellen, lösen Sie 200 Milligramm Rhodamin B Pulver pro 100 Milliliter 10% Saccharoselösung.
Gut mischen, um sicherzustellen, dass das gesamte Pulver gelöst ist. Bereiten Sie 20 Zuckerzufuhrflaschen mit einem Docht vor. Fügen Sie 10 Milliliter 10% Saccharose zu 10 Feederflaschen und 10 Milliliter 0,2% Rhodamine B Saccharoselösung für die anderen 10 Feederflaschen hinzu.
Stellen Sie fünf Futterflaschen in jeden vorbereiteten männlichen Käfig und lassen Sie die männlichen Moskitos drei Tage lang vor dem Paarungsexperiment füttern. Schalten Sie die Quecksilberbrennerlampe und das Stereomikroskop ein. Lassen Sie die Lichtquelle zur Quecksilberbrennerlampe für 10 Minuten stabilisieren.
Stellen Sie dann die Fluoreszenzfilter für rotes Fluoreszenzprotein ein. Saugen Sie eine kleine Anzahl von Moskitos gleichzeitig in die Glasröhre des oralen Absaugers ab. Beobachten Sie durch die Glasröhre den Körper der männlichen Moskitos unter dem fluoreszierenden Stereomikroskop.
Verwenden Sie nur männliche Moskitos, die mit Rhodamin B für das Experiment markiert sind. Transferset Ein männliches Moskito in 12 Pappbecher, die mit Netzen gesichert sind. Legen Sie 10 saccharose gefütterte männliche Moskitos pro Tasse in sechs Tassen und 10 Rhodamine B Saccharose gefütterte männliche Moskitos pro Tasse in die anderen sechs Tassen.
Wiederholen Sie diesen Schritt für männliche Moskitos mit Satz B. Stellen Sie 12 Käfige für den Paarungstest auf. In jedem der sechs Käfige befinden sich 10 männliche Mücken, die mit Rhodamin B markiert sind, 10 unmarkierte männliche Moskitos mit Satz B und 10 jungfräuliche weibliche Wildtypmücken.
In den anderen sechs Käfigen sind 10 unmarkierte männliche Mücken, 10 mit Rhodamin B markierte männliche Moskitos und 10 jungfräuliche weibliche Wildtypmücken enthalten. Beschriften Sie diese Käfige, um klar zwischen den beiden Paarungskombinationen zu unterscheiden. Stellen Sie die jeweiligen Becher der Männchen gemäß den Etiketten in die Paarungskäfige.
Entfernen Sie das Netz und klopfen Sie vorsichtig auf die Tasse, um die Männchen aus der Tasse zu drängeln. Entfernen Sie vorsichtig den Pappbecher und das Netz aus dem Käfig, um sicherzustellen, dass keine Moskitos aus dem Käfig entweichen. Lassen Sie die männlichen Moskitos mindestens eine Stunde lang im Paarungskäfig akklimatisieren.
Übertragen Sie mit einem oralen Aspirator jungfräuliche weibliche Wildtypmücken in 12 Pappbecher, wobei jede Tasse 10 Moskitos enthält. Nach der Akklimatisierungszeit für die männlichen Moskitos eine Tasse Weibchen in jeden Paarungskäfig geben und das Netz entfernen. Drängeln Sie vorsichtig die Tasse, um alle verbleibenden weiblichen Moskitos aus der Tasse zu ermutigen, und entfernen Sie dann vorsichtig den Pappbecher und das Netz aus dem Käfig, um sicherzustellen, dass keine Moskitos aus dem Käfig entkommen.
Lassen Sie die Paarung drei Stunden lang stattfinden und beenden Sie dann das Paarungsexperiment, indem Sie alle Moskitos mit einem mechanischen Absauger aus jedem Käfig entfernen. Betäuben Sie die Moskitos mindestens fünf Minuten lang kalt auf Eis. Wenn die Moskitos vollständig betäubt sind, nehmen Sie die weiblichen Moskitos vorsichtig auf und beherbergen Sie sie in einem separaten Pappbecher, der mit Netzen gesichert ist.
Beschriften Sie den Pappbecher, indem Sie das entsprechende Etikett aus dem Steckkäfig auf den Becher übertragen. Um weibliche Spermatheken zu erhalten, betäuben Sie die weiblichen Moskitos mindestens fünf Minuten lang kalt auf Eis, bevor Sie unter einem Stereomikroskop sezieren. Sezieren Sie die weibliche Mücke unter dem Stereomikroskop.
Untersuchen Sie die Spermathecae unter dem Mikroskop. Wenn das Weibchen nicht befruchtet wird, wären alle drei Spermathecae leer, und wenn sie befruchtet würden, wären zwei oder drei der Spermathecae mit beweglichen Spermien gefüllt. Bestimmen Sie bei befruchteten Personen, ob die Spermathecae Rhodamin B-markierte Samenflüssigkeit enthalten, indem Sie sie unter dem fluoreszierenden Stereomikroskop untersuchen, das mit einem RFP1-Filter ausgestattet ist.
Wenn die Spermatheken mit Samenflüssigkeit gefüllt sind, die nicht mit Rhodamin B markiert ist, wird keine Fluoreszenz beobachtet. Auf der anderen Seite, wenn die Spermatheca Rhodamin B markierte Samenflüssigkeit enthält, würde sie orange fluoreszieren. Ziel dieses Paarungs-Wettbewerbstests war es, festzustellen, ob es nach mehreren Generationen der Inzucht zu einem Verlust der männlichen Paarungstauglichkeit führen könnte.
Es wurden experimentelle Triplikate des Paarungswettbewerbsfähigkeitstests durchgeführt, und die Besamungsdaten werden hier gezeigt. Wildtyp-Weibchen wurden entweder von den Inzucht- oder Outcross-Männchen mit gegenseitiger Markierung befruchtet. Die Ergebnisse zeigen, dass der Anteil der von den Inzucht- oder Outcross-Männchen befruchteten Weibchen durch die Rhodamin-B-Markierung nicht beeinflusst wurde.
Ein signifikant höherer Prozentsatz der Weibchen, die sich mit den Outcross-Männchen paarten als mit den Inzuchtmännen in allen drei Replikanten, was darauf hindeutet, dass Inzucht zu einem Verlust der Paarungsfitness führen könnte. Es ist wichtig, zusätzliche Käfige von weiblichen Moskitos vorzubereiten. Verwenden Sie keine weiblichen Moskitos aus einem Käfig, der mit männlichen Moskitos kontaminiert wurde, da vorbefruchtete Weibchen alle Daten ungültig machen würden.
Anders als der laborbasierte Paarungswettbewerbsfähigkeitstest kann dieses Verfahren in Markierungsfreisetzungsexperimenten verwendet werden, um die Paarungsbiologie von Insekten, die Populationsdynamik und ihre Ausbreitung zu untersuchen.
Überblick
Diese Studie präsentiert ein Protokoll zur Bewertung der Paarungswettbewerbsfähigkeit männlicher Aedes aegypti Moskitos, eine wichtige Überlegung in Strategien zur Kontrolle von Moskitobevölkerungen. Durch die Verwendung von Rhodamin B als fluoreszierender Marker können Forscher den Paarungserfolg von markierten gegenüber nicht markierten Männchen direkt vergleichen, nachdem sie weiblichen Moskitos ausgesetzt waren.
Wichtige Studienkomponenten
Forschungsbereich
- Paarungswettbewerbsfähigkeit von Moskitos
- Strategien zur Populationsunterdrückung
- Insektenverhalten und -biologie
Hintergrund
- Der Bedarf an effektiver Kontrolle der Moskitopopulation aufgrund ihrer Rolle bei der Krankheitsübertragung.
- Bedeutung der Bewertung der männlichen Paarungsfitness für die Qualitätskontrolle in Programmen der sterilen Insektentechnik.
- Verwendung von fluoreszierenden Markern zur Verbesserung der Genauigkeit und Effizienz des Experiments.
Verwendete Methoden
- Kontrollierte Paarungstests mit markierten und nicht markierten männlichen Moskitos.
- Aedes aegypti als Modellorganismus.
- Fluoreszenzmikroskopie zur Analyse von Paarungsergebnissen und Spermapräsenz.
Hauptergebnisse
- Inzucht reduziert die Paarungsfitness der Männchen, wie durch niedrigere Befruchtungsraten bei inzuchten Männchen im Vergleich zu Kreuzungsmännchen belegt wird.
- Die fluoreszente Markierung beeinflusste den Anteil der befruchteten Weibchen nicht.
- Die effiziente Methode ermöglicht eine schnelle Bewertung der Paarungswettbewerbsfähigkeit.
Schlussfolgerungen
- Diese Studie unterstreicht den Einfluss genetischer Faktoren auf den Paarungserfolg bei Aedes aegypti.
- Die Ergebnisse sind relevant für zukünftige Forschungen zur Moskitokontrolle und Populationsdynamik.
Häufig gestellte Fragen
Executive Industry Relevance
Assessing male mating competitiveness is critical for evaluating strain fitness in sterile insect technique programs, directly impacting the success of vector control strategies. This fluorescent dye-based method enables rapid, quantitative comparison of mating fitness between strains, reducing experimental time by 90% and supporting data-driven go/no-go decisions in pipeline advancement. By providing a scalable, reproducible assay for target validation in vector-borne disease intervention, it enhances predictive confidence in preclinical strain selection.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables direct interrogation of mating fitness as a phenotypic endpoint for strain fitness evaluation.
- Operational Value: Reduces assay duration from days to hours by eliminating blood-feeding and egg-hatching steps.
- Predictive Value: Supports mechanistic de-risking by quantifying competitive mating success between sterile or Wolbachia-infected lines.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Generates quantitative, fluorescence-based readouts for mating partner identification in spermathecae.
- Operational Value: Uses sucrose feeding for non-invasive male marking, enabling high-throughput preparation of labeled cohorts.
- Reproducibility: Standardized Rhodamine B concentration (0.2% in 10% sucrose) ensures consistent labeling across experimental replicates.
Translational & Preclinical Research
- Translational Continuity: Bridges laboratory strain evaluation to field release readiness by assessing a key fitness criterion for population suppression.
- Mechanistic De-risking: Detects fitness costs of inbreeding through reduced insemination rates, informing strain maintenance strategies.
- Disease-Relevant System: Uses Aedes aegypti, a vector for dengue, Zika, and chikungunya, aligning with global health priorities.
Pipeline & Workflow Integration
This method fits within the discovery-to-preclinical continuum, supporting strain selection after genetic modification and before field trial planning, by providing a quantitative mating competitiveness metric.
- Discovery Biology: Tests the hypothesis that genetic background influences mating success through competitive male-female interactions.
- Screening: Produces standardized, fluorescent sperm labeling enabling blind scoring of mating outcomes across experimental groups.
- Analytics: Generates proportional insemination data per male strain, facilitating statistical comparison of mating fitness.
- Translational Research: Connects laboratory competitiveness to field efficacy by validating a prerequisite for sterile male release success.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable platform for comparing any two male strains, applicable across vector control programs.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Provides mechanistic insight into mating fitness determinants, reducing ambiguity in strain selection.
- Operational Value: Eliminates dependency on blood feeding and embryology, simplifying workflow and increasing throughput.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions by identifying fitness defects early, reducing investment in non-competitive strains.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of strains based on validated mating competitiveness data.
Implementation Considerations
- Requires expertise in mosquito handling, sex separation at pupal stage, and fluorescence microscopy.
- Necessitates stereo microscope with RFP1 filter set and mercury burner lamp for standardized fluorescence detection.
- Demands cross-team standardization of male marking protocols and female dissection procedures to ensure data consistency.
- Involves adaptation considerations when applying to different mosquito species or strains with varying feeding behaviors.
- Includes practical limitations such as the need to avoid pre-inseminated females and ensure proper cage labeling to prevent cross-contamination.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:04
Introduction
0:41
Preparation of Male and Female Mosquitoes
1:11
Preparation of 0.2% RhB Sucrose Solution and Feeding of Male Mosquitoes
1:52
Checking for RhB Fluorescence in Male Mosquitoes
2:46
Mating Competitiveness Assay
5:36
Results: Assessment of Mating Competitiveness in Male Mosquitoes
6:27
Conclusion
