Name: Retinale Organoid-Induktionssystem zur Ableitung von 3D-Netzhautgewebe aus humanen pluripotenten Stammzellen (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-04-12T14:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 5 s
Description: Lernen Sie ein optimiertes Protokoll zur Induktion retinaler Organoide aus humanen pluripotenten Stammzellen. Diese Methode ermöglicht die effiziente und reproduzierbare Generierung von 3D-Netzhautgewebe für Krankheitsmodellierung und Zelltherapie.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Diese Studie wurde vom National Key R&D Program of China (2016YFC1101103, 2017YFA0104101), dem Guangzhou Science and Technology Project Fund (201803010078), dem Science & Technology Project der Provinz Guangdong (2017B020230003), der Natural Science Foundation (NSF) of China (81570874, 81970842), dem Hundred Talent Program der Sun Yat-sen University (PT1001010) und den Fundamental Research Funds des State Key Laboratory of Ophthalmology unterstützt.

1. Kultur und Ausbau von hPSCs
<ol><li>HPSC-Kultur
	<ol>
<li>Beschichten Sie zwei Vertiefungen einer 6-Well-Platte mit extrazellulärer Matrix (ECM, hESC-qualifizierte Matrix). Bereiten Sie 50 ml einer ECM-Lösung vor, die 8-12 μg/ml ECM in Dulbeccos Modified Eagle's Medium (DMEM) enthält. In 49 ml DMEM 1 ml der aufgetauten ECM-Stammlösung (50x) hinzufügen. Fügen Sie 1 ml der ECM-Lösung zu jeder Vertiefung einer 6-Well-Platte hinzu. Inkubieren Sie es für 1 h in einem Inkubator bei 37 °C und 5% CO2.</li>
		<li>Bereiten Sie hPSC-Wartungsmedium (MM) gemäß den Anweisungen des Herstellers vor.</li>
		<li>MM bei Raumtemperatur (RT) für 30 min vorwärmen.</li>
		<li>Auftauen einer kryogenen Durchstechflasche mit hPSCs (hiPSCs oder hESCs) (ca. 1 x 106)aus einem Flüssigstickstofftank durch Inkubation in einem Wasserbad bei 37 °C für 30 s.</li>
		<li>Nehmen Sie die Durchstechflasche heraus und desinfizieren Sie sie vorsichtig mit einem 75% igen Desinfektionsalkoholspray. Legen Sie es in eine Biosicherheitsschranke.</li>
		<li>Die Zellsuspension aus der Durchstechflasche in ein 15-ml-Röhrchen geben, 5 ml vorgewärmtes MM Tropfen für Tropfen mit einer 5-ml-Pipette in das Röhrchen geben. Schütteln Sie in der Zwischenzeit vorsichtig das Röhrchen, um die hPSCs zu mischen.</li>
		<li>Zentrifuge das Röhrchen bei 170 x g für 5 min. Entfernen Sie den größten Teil des Überstands vorsichtig mit einer 1-ml-Pipette und lassen Sie etwa 50 μL Überstand zurück, um den Verlust der Zellen zu vermeiden.</li>
		<li>Fügen Sie 1 ml MM in das Rohr hinzu und kehren Sie das Pellet wieder auf, indem Sie es ein- oder zweimal mit einer 1-ml-Pipette vorsichtig auf und ab pipettieren. HINWEIS: Das Überleben einzelner Zellen von hPSCs ist gering. Kleinzellige Klumpen mit 3-5 Zellen werden bevorzugt, um die hPSCs in Kolonien wachsen zu lassen.</li>
		<li>EcM aus den vorbeschichteten Vertiefungen entfernen (Schritt 1.1.1), 1,5 ml MM zu jeder Vertiefung hinzufügen und dann 0,5 ml Zellsuspension pro Vertiefung verteilen.</li>
		<li>Schütteln Sie die Platte vorsichtig, um die hPSCs gleichmäßig zu verteilen, und legen Sie die Platte in einen Inkubator bei 37 °C und 5% CO2. Bewegen Sie die Platte mindestens 24 Stunden lang nicht, um die Zelladhärenz zu fördern.</li>
		<li>Wechseln Sie MM jeden zweiten Tag und durchlassen Sie die hPSCs, wenn der Zusammenfluss etwa 80% erreicht hat.</li>
	</ol></li>
	<li>Weitergabe von hPSCs HINWEIS: Die Aufrechterhaltung des undifferenzierten Zustands in hPSCs ist für weitere Anwendungen sehr kritisch. Unter den adhärenten Bedingungen wachsen hPSCs in Kolonien mit einer klar definierten Grenze. Die Zellen sollten passagen, wenn der Zusammenfluss von hPSCs etwa 80% erreicht.<ol>
<li>Beobachten Sie die Zellen unter dem Mikroskop. Markieren und entfernen Sie die deutlich sichtbaren differenzierten Zellen (<5%) vor dem Passieren mechanisch.</li>
		<li>Bereiten Sie die ECM-beschichtete Platte wie in Schritt 1.1.1 beschrieben vor.</li>
		<li>Vorwarmes MM und 1x Phosphatpuffersalzlösung (PBS) ohneCa2+ undMg2+ bei RT.</li>
		<li>Die 0,5 mM EDTA -Lösung (in 1x PBS) wird in einem Wasserbad bei 37 °C vorgewärmt.</li>
		<li>Entfernen Sie das Medium mit einem Vakuum-Aspirationssystem von der Kulturplatte, fügen Sie 1 ml 1x PBS in jede Vertiefung hinzu, um die Zellen mit einer 1-ml-Pipette zu waschen und wiederholen Sie sie zweimal.</li>
		<li>Fügen Sie 1 ml EDTA-Lösung pro Vertiefung hinzu, um die hPSCs in einem Zellkulturinkubator bei 37 °C und 5% CO2 für 5 min zu dissoziieren. Überschreiten Sie nicht die empfohlene Inkubationszeit, um eine Dissoziation zu einzelnen Zellen zu vermeiden.</li>
		<li>Nehmen Sie die Platte heraus und überprüfen Sie die Ablösung der Zellen unter einem Mikroskop. Die konfluenten hPSCs lockern sich auf und jeder Zellrand ist zu sehen, aber die Zellen können sich nicht leicht durch sanftes Schütteln der Zellplatte lösen.</li>
		<li>Entfernen Sie die EDTA-Lösung mit einer 1-ml-Pipette und fügen Sie 1 ml MM hinzu, um die Dissoziation zu stoppen. Pipetten Sie die hPSCs ein- oder zweimal vorsichtig mit einer 1 mL Pipette, um die Zellen wieder aufzustellen. Es besteht keine Notwendigkeit, sich zu zentrifugieren, um die Zellen zu sammeln. HINWEIS: Wenn sich die meisten Zellen nach der Inkubation mit EDTA von der Platte absetzen, können die Zellen mit einer Zentrifuge gesammelt werden.</li>
		<li>Entfernen Sie ECM aus den vorbeschichteten Vertiefungen (Schritt 1.2.2) und fügen Sie 1,5 ml MM pro Vertiefung hinzu.</li>
		<li>Übertragen Sie 150-200 μL Zellklumpen in jede Vertiefung. Im Allgemeinen können hPSCs im Verhältnis 1:6 durchfahren werden. Zum Beispiel können Zellen aus einer Vertiefung einer 6-Well-Platte auf sechs neue Vertiefungen verteilt werden.</li>
		<li>Schütteln Sie die Platte vorsichtig, um die hPSCs gleichmäßig zu verteilen und kulturieren Sie die hPSCs im Inkubator bei 37 °C und 5% CO2 für mindestens 24 h, ohne die Platte zu berühren.</li>
		<li>Ändern Sie MM jeden zweiten Tag, wie in Schritt 1.1 beschrieben.</li>
	</ol></li>
</ol>2. Netzhautdifferenzierung von hPSCs
HINWEIS: Wenn die Kolonien ~ 80% Konfluenz erreichen(Abbildung 1B),können sie geführt werden, um sich nach dem in Abbildung 1Aschematisierten Protokoll in netztinale Organoide zu differenzieren. Um sicherzustellen, dass die hPSCs eine hohe Qualität und eine gute Ausbeute aufweisen, bewerten Sie regelmäßig die Pluripotenz mit molekularen Markern wie OCT4 oder NANOG mittels IFC oder QPCR. HPSCs sollten verworfen werden, wenn differenzierte Zellen mehr als 5% der Gesamtzellen ausmachen. Überprüfen Sie die Mykoplasmenkontamination mit einem Mykoplasmen-Nachweiskit gemäß den Anweisungen des Herstellers. Verwenden Sie nur mykoplasmenfreie hPSCs, da Mykoplasmen die Differenzierungsfähigkeit von hPSCs verändern können.
<ol><li>Medien und Reagenzien vorbereiten
	<ol>
<li>Bereiten Sie das neuronale Induktionsmedium (NIM) vor, indem Sie Folgendes mischen: 500 ml Dulbeccos modified Eagle Medium/Nutrient Mixture F-12 (DMEM/F-12, 1:1), 5 mL 1% N2 Supplement, 0,5 mL 0,1% Heparin (2 mg/ml in 1x PBS) und 5 ml 1% MEM Non-Essential Amino Acids (NEAA).</li>
		<li>Bereiten Sie ein netzhautliches Differenzierungsmedium (RDM) mit 300 ml DMEM / F-12, 200 ml DMEM-Basis, 10 ml 2% B27-Ergänzung, 5 ml 1% Antibiotikum Antimykotika und 5 ml 1% MEM NEAA vor. HINWEIS: Sowohl NIM als auch RDM werden nicht gefiltert, es wird jedoch ein Sterilitätstest durchgeführt. 1 ml Medium herausnehmen und in eine 35-mm-Schüssel geben und 3-7 Tage in einem Inkubator bei 37 °C und 5% CO2 ankulturieren. Das Medium kann bei 4 °C gelagert werden und sollte innerhalb von 2 Wochen verwendet werden, um die Aktivität der Komponenten zu gewährleisten.</li>
		<li>Bereiten Sie 10 mM Blebbistatin (1.000x) in DMSO vor. 1.710 μL DMSO 1.710 μL blebbistatin zulösen, um 10 mM Stammlösung (1.000x) zu erhalten, aliquot bei 10 μL/Röhrchen und bei -20 °C lagern. HINWEIS: Alle Medien und Reagenzien sollten vor Gebrauch 30 Minuten lang bei RT erwärmt werden, sofern nicht anders angegeben.</li>
	</ol></li>
	<li>Embryoidkörper (EB) Bildung
	<ol>
<li>Beginnen Sie am Tag 0 (D0) mit der Differenzierung. Nehmen Sie eine Vertiefung von hPSCs aus einer 6-Well-Platte heraus, die auf ~ 80% Konfluenz angewachsen ist. Sammeln Sie die Zellen mit EDTA-Dissoziationslösung, wie in den Schritten 1.2.1 bis 1.2.6 beschrieben.</li>
		<li>Entfernen Sie die EDTA-Lösung, fügen Sie 1 ml MM mit 10 μM Blebbistatin hinzu, um die Zelldissoziation zu stoppen, und sammeln Sie die Zellen mit einer 1 ml Pipette. Die Größe der Zellklumpen ist einer der Schlüsselfaktoren, die sich auf die Ausbeute von EBs auswirken. Ungefähr fünf Zellen pro Klumpen werden bevorzugt, um die richtige Größe von EBs auf D5 bis D7 zu erzeugen. HINWEIS: Dies ist ein wichtiger Schritt. Pipetetten Sie die Zellen nicht zu oft, da EB-ähnliche Aggregate aus einzelnen Zellen von hPSCs schwer zu bilden sind.</li>
		<li>Die Zellsuspension (ca. 2 x10 6 Zellen) in eine 100 mm ultra-low attachment Petrischale geben und 9 mL MM mit 10 μM Blebbistatin in die Schale geben.</li>
		<li>Schütteln Sie die Schüssel zweimal vorsichtig, um die Zellen gleichmäßig zu verteilen, und stellen Sie die Schüssel bei 37 °C und 5% CO2in den Inkubator.</li>
		<li>Auf D1, nachdem die Zellen für mindestens 24 h kultiviert wurden, nehmen Sie die Schale heraus und beobachten Sie sie unter dem Mikroskop. Ein Großer Teil der kleinzelligen Aggregate wird sich zu diesem Zeitpunkt spontan bilden (Abbildung 1C).</li>
		<li>12 ml Mischung mit MM und NIM im Verhältnis 3:1 (9 ml MM und 3 ml NIM) in einem 15 ml Röhrchen vorbereiten.</li>
		<li>Die Zellkulturen werden senkrecht in ein 15 mL Zentrifugenröhrchen mit einer 10 mL Pipette gegeben und 10 ml der vorgewärmten Mischung in die Schüssel gegeben.</li>
		<li>Zentrifugieren Sie das Röhrchen bei 60 x g für 3 min, um die Aggregate zu sammeln, entfernen Sie den Überstand mit einer 5 mL Pipette und lassen Sie etwa 500 μL zurück, um den Verlust von Zellen zu vermeiden.</li>
		<li>2 ml der Mischung in das Röhrchen geben und die Suspension in dieselbe Schüssel geben (Schritt 2.2.7).</li>
		<li>Schütteln Sie die Schüssel vorsichtig, um die Zellaggregate gleichmäßig zu verteilen, und legen Sie die Schüssel wieder in den Inkubator.</li>
		<li>Auf D2 werden 12 ml einer neuen Mischung mit MM und NIM im Verhältnis 1:1 (6 ml MM und 6 ml NIM) in einem 15-ml-Röhrchen vorbereitet. Wechseln Sie das Zellmedium mit der frisch zubereiteten Mischung, indem Sie die Schritte von 2.2.5 bis 2.2.10 wiederholen.</li>
		<li>Wechseln Sie auf D3 das Zellmedium mit 15 ml NIM wie oben beschrieben. Kulturieren Sie die Zellen für mindestens 5 Tage unter den Suspensionsbedingungen. HINWEIS: Während D1 bis D3 sollte das Medium jeden Tag gewechselt werden, um genügend Nahrung bereitzustellen. Seit D3 kann NIM jeden zweiten Tag geändert werden. EBs können auch in mehrere Gerichte unterteilt werden, um reichlich Nahrung zu bieten.</li>
	</ol></li>
	<li>Aussäen der EBs HINWEIS: Wählen Sie bei D5 bis D7 einen geeigneten Zeitpunkt, um die EBs auf den ECM-beschichteten Schalen entsprechend der Größe der EBs zu plattieren. EBs mit einem ungefähren Durchmesser von 200 μm sind für die netzhautliche Differenzierung geeignet. Im Allgemeinen kann eine Bohrung von hPSCs in einer 6-Well-Platte etwa 300 bis 1.000 EBs produzieren. Die Variation der EB-Ausbeute wird durch die hPSC-Linien variiert.<ol>
<li>Bereiten Sie auf D4 ECM-beschichtetes Geschirr für die EBs-Haftkultur zu. Fügen Sie 5 ml ECM zu jeder 100 mm Gewebekulturschale (oberflächenbehandelt) hinzu und legen Sie sie über Nacht in den Inkubator.</li>
		<li>Entfernen Sie auf D5 ECM aus dem vorbeschichteten Geschirr und fügen Sie jedem Gericht 10 ml vorgewärmtes NIM hinzu.</li>
		<li>Nehmen Sie das Gericht mit EBs heraus. Überprüfen Sie die Qualität von EBs unter dem Mikroskop und stellen Sie sicher, dass sie recht hell und rund sind. Die Größe der EBs beträgt ungefähr 200 μm Durchmesser. Sammeln Sie alle EBs in einem 15-ml-Röhrchen. Die EBs vom Geschirr in ein 15-ml-Röhrchen mit einer 5-ml-Pipette geben. Lassen Sie die EBs für 5 Minuten beruhigen. Entfernen Sie den größten Teil des Überstands und lassen Sie etwa 2 ml Medium zurück.</li>
		<li>Verteilen Sie die EBs in die beschichteten Schalen mit 10 ml NIM Tropfen für Tropfen mit einer 1 ml Pipette. Säen Sie die EBs mit einer Dichte von ca. 2-3 EBs procm2. Fügen Sie beispielsweise etwa 120-180 EBs in eine 100-mm-Schüssel hinzu. Um die EB-Zahl grob zu beurteilen, legen Sie einen Tropfen EB-Suspension auf einen Coverlip und zählen Sie die Anzahl der EBs unter dem Mikroskop. HINWEIS: Die Beschichtungsdichte von EBs ist einer der Schlüsselfaktoren, die die Effizienz der Netzhautinduktion beeinflussen. Die Dichte kann auch von jeder hPSC-Linie eingestellt werden.</li>
		<li>Schütteln Sie das Geschirr vorsichtig, um die EBs gleichmäßig zu verteilen. Legen Sie sie bei 37 °C und 5% CO2in den Inkubator. HINWEIS: Bewegen Sie das Geschirr nicht mindestens 24 Stunden lang, um die Adhärenz von EBs zu verbessern.</li>
	</ol></li>
	<li>Induktion von optischen Vesikeln (OVs) und retinalem Pigmentepithel (RPE) unter adhärentem Zustand HINWEIS: Nachdem EBs auf der ECM-beschichteten Oberfläche ausgesät wurden, können hPSCs OV-ähnliche Strukturen entwickeln, die bereits nach der Differenzierung von D20 beobachtet werden können. In diesem Protokoll sind keine spezifischen Wachstumsfaktoren oder Signalmoleküle erforderlich, um die hPSCs in das Netzhautschicksal zu leiten, außer der Zugabe von N2- und B27-Ergänzungen in den Medien.<ol>
<li>Entfernen Sie auf D8-D9 das Geschirr und beobachten Sie die EBs unter dem Mikroskop. Alle EBs werden auf dem Geschirr angebracht und verteilt (Abbildung 1D). Fügen Sie 10 ml frisches NIM zu jeder 100-mm-Schüssel hinzu, die 10 ml altes Medium enthält. Legen Sie sie wieder in den Inkubator. HINWEIS: Entfernen Sie nicht das alte Medium.</li>
		<li>Wechseln Sie bei D12 die Hälfte des Mediums mit NIM mit einer 10-ml-Pipette. Bewahren Sie die Kultur im Inkubator auf.</li>
		<li>Entfernen Sie auf D16 das gesamte NIM mit einem Vakuum-Aspirationssystem aus dem Geschirr. Fügen Sie 20 ml RDM zu jedem Gericht hinzu. Kultivieren Sie weiter in RDM und wechseln Sie jeden zweiten Tag die Hälfte des Mediums.</li>
		<li>Beobachten Sie während D10-D30 zweimal wöchentlich die morphologischen Veränderungen der Zellen unter einem Mikroskop und bewerten Sie die Effizienz der Netzhautdifferenzierung. HINWEIS: Seit D10 sind Augenfelddomänen (EF) in den peripheren Zonen adhärenter EBs selbstorganisiert. Die OV-ähnlichen Strukturen treten zwischen D20 und D25 auf, ragen allmählich aus der Schale heraus und bilden selbst einen optischen Becher, der von der pigmentierten RPE umgeben ist (Abbildung 1E). Die OVs können leicht mit dem hellen, refraktiven und dicken NR-Ring erkannt werden.</li>
	</ol></li>
	<li>Lösen und kultivieren Sie OVs und RPE in Suspension, um netztinale Organoide (ROs) zu erhalten
	<ol>
<li>Auf D28-D35 erscheinen die meisten OVs in den Schalen. Verwenden Sie eine Wolframnadel oder eine Nadel mit 1 ml Spritze, um die morphologisch identifizierbaren OVs zusammen mit dem benachbarten RPE mechanisch zu lösen. Kultur sie in Schwebe. HINWEIS: Das Aussehen und die Ausbeute von OVs und RPE variieren stark in verschiedenen hPSC-Linien. Somit ist der Zeitpunkt der Trennung von OV und RPE flexibel. Offensichtliche OVs mit dem angrenzenden RPE können abgelöst und dann in eine Kulturschale mit niedrigem Aufsatz verschoben werden, die RDM enthält. Kultivieren Sie den Rest der Zellen weiter, bis alle OVs und RPEs angehoben sind.</li>
		<li>Legen Sie 50-60 OVs in jede 100 mm Kulturschale mit niedrigem Aufsatz, die 15 ml RDM für die ROs-Bildung enthält (Abbildung 1F).</li>
		<li>Wechseln Sie RDM alle 2-3 Tage bis D42, wenn die ROs gut rund geformt sind.</li>
	</ol></li>
</ol>3. Entwicklung und Reifung der Netzhaut
HINWEIS: In diesem Protokoll ist Serum erforderlich, um die ROs für eine langfristige Kultur wachsen und reifen zu lassen.
<ol><li>
Netzhautkaschierung und Spezifikation in ROs
	<ol>
<li>Bereiten Sie 10 ml 100 mM Taurin (1.000x) in 1x PBS vor. Wiegen Sie 125 mg Taurin und lösen Sie es in 10 ml 1x PBS auf. Filtern Sie die Lösung mit einem 0,22 μm Spritzenfilter. Aliquot bei 500 μL/Röhrchen und bei -20 °C lagern.</li>
		<li>Retinakulturmedium 1 (RC1) vorbereiten. Mischen Sie die folgenden Komponenten: 250 ml DMEM / F-12, 175 ml DMEM-Basis, 50 ml fetales Rinderserum, 10 ml 2% B27-Ergänzung, 5 ml 1% Antibiotikum Antimykotika, 5 ml 1% MEM NEAA, 0,5 ml 100 μM Taurin und 5 ml 2 mM L-Alanyl-L-Glutamin.</li>
		<li>Bereiten Sie das Netzhautkulturmedium 2 (RC2) vor, das 450 ml DMEM/F-12, 50 ml fetales Rinderserum, 5 ml 1% N2-Ergänzung, 5 ml 1% Antibiotikum Antimykotika, 0,5 ml 100 μM Taurin, 5 ml 1% MEM NEAA und 5 ml 2 mM L-Alnyl-L-Glutamin enthält. HINWEIS: RC1 und RC2 werden nicht gefiltert, sondern einem Sterilitätstest unterzogen. 1 ml Medium herausnehmen, in eine 35-mm-Schüssel geben und 3-7 Tage im Inkubator bei 37 °C und 5% CO2ankulturieren, um die Sterilität vor dem Gebrauch zu gewährleisten. Das Medium kann bei 4 °C gelagert werden und sollte innerhalb von 2 Wochen verwendet werden, um die Aktivität der Komponenten zu gewährleisten. Alle Medien und Reagenzien sollten vor Gebrauch 30 Minuten bei RT vorgewärmt werden.</li>
		<li>Schalten Sie auf D42 das Kulturmedium von RDM auf RC1 um.</li>
		<li>Kippen Sie das Geschirr um ca. 30° und lassen Sie die ROs für 30 s absetzen. Entfernen Sie das alte RDM mit einer 10-ml-Pipette, die etwa 1 ml Medium zurücklässt, um den Verlust von ROs zu vermeiden. Fügen Sie 15 ml frisches RC1 zu jedem Gericht hinzu.</li>
		<li>Schütteln Sie das Geschirr vorsichtig, um die ROs gleichmäßig zu verteilen. Stellen Sie das Geschirr wieder in den Inkubator. Wechseln Sie danach zweimal pro Woche das gesamte Medium.</li>
		<li>Wählen Sie während der D50-D90 eine hohe Qualität der ROs für die Langzeitkultur aus, die rund mit einem dicken und hellen NR sind. Legen Sie 30-40 ROs in eine 100 mm niedrige Aufsatzschale mit 20 ml RC1 und wechseln Sie das gesamte Medium zweimal pro Woche.</li>
		<li>Für die langfristige Suspensionskultur von ROs pipetieren Sie die ROs, um ein wiederanbringen von RO-RO mit einer Pipette zu vermeiden. Übertragen Sie ROs einmal im Monat auf neue Kulturgerichte, um zu vermeiden, dass ROs an der Oberfläche des Geschirrs haften bleiben. HINWEIS: Unter den Bedingungen der Suspensionskultur sind ROs rund geformt, mit einem hellen und dicken NR-Ring, der mit mehr oder weniger RPE an einer Seite befestigt ist. Laminierte neuronale Netzhaut entwickeln sich und retinale Zellsubtypen erscheinen sequenziell mit retinalen Ganglienzellen, die zuerst generiert werden, gefolgt von Photorezeptorzellen, amakrinen Zellen und bipolaren Zellen.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Menschliche Photorezeptorreifung mit Anreicherung von Zapfen in ROs
	<ol>
<li>Schalten Sie nach der D90 das Medium von RC1 auf RC2 um, das für die Photorezeptorreifung geeignet ist.</li>
		<li>Ändern Sie das Medium wie in den Schritten 3.1.7-3.1.8 beschrieben. HINWEIS: Unter dieser Kulturbedingung können ROs langfristig wachsen (Abbildung 1G), bis zu D300 getestet. Netzhautzellen in ROs werden reif, und alle Zellsubtypen der neuronalen Netzhaut, einschließlich Müller-Gliazellen, Stäbchen und Zapfen, werden ebenfalls erworben. Ohne Zusatz von RA sind Zapfenphotorezeptoren auch reich an ROs.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

<ol><li>Flaxman, S. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Global+causes+of+blindness+and+distance+vision+impairment+1990-2020%3A+a+systematic+review+and+meta-analysis%5BTitle%5D)+AND+%22The+Lancet+Global+Health%22%5BJournal%5D)">Global causes of blindness and distance vision impairment 1990-2020: a systematic review and meta-analysis.</a> The Lancet Global Health. 5 (12), 1221-1234 (2017).</li>
<li>Sayed, N., Liu, C., Wu, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Translation+of+human-induced+pluripotent+stem+cells%3A+From+clinical+trial+in+a+dish+to+precision+medicine%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+American+College+of+Cardiology%22%5BJournal%5D)">Translation of human-induced pluripotent stem cells: From clinical trial in a dish to precision medicine.</a> Journal of American College of Cardiology. 67 (18), 2161-2176 (2016).</li>
<li>Capowski, E. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reproducibility+and+staging+of+3D+human+retinal+organoids+across+multiple+pluripotent+stem+cell+lines%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Reproducibility and staging of 3D human retinal organoids across multiple pluripotent stem cell lines.</a> Development. 146 (1), (2019).</li>
<li>Brooks, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Improved+retinal+organoid+differentiation+by+modulating+signaling+pathways+revealed+by+comparative+transcriptome+analyses+with+development+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">Improved retinal organoid differentiation by modulating signaling pathways revealed by comparative transcriptome analyses with development in vivo.</a> Stem Cell Reports. 13 (5), 891-905 (2019).</li>
<li>Zerti, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Developing+a+simple+method+to+enhance+the+generation+of+cone+and+rod+photoreceptors+in+pluripotent+stem+cell-derived+retinal+organoids%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells%22%5BJournal%5D)">Developing a simple method to enhance the generation of cone and rod photoreceptors in pluripotent stem cell-derived retinal organoids.</a> Stem Cells. 38 (1), 45-51 (2020).</li>
<li>Osakada, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Toward+the+generation+of+rod+and+cone+photoreceptors+from+mouse%2C+monkey+and+human+embryonic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Toward the generation of rod and cone photoreceptors from mouse, monkey and human embryonic stem cells.</a> Nature Biotechnology. 26 (2), 215-224 (2008).</li>
<li>Nakano, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Self-formation+of+optic+cups+and+storable+stratified+neural+retina+from+human+ESCs%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Self-formation of optic cups and storable stratified neural retina from human ESCs.</a> Cell Stem Cell. 10 (6), 771-785 (2012).</li>
<li>Zhong, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+three-dimensional+retinal+tissue+with+functional+photoreceptors+from+human+iPSCs%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communication%22%5BJournal%5D)">Generation of three-dimensional retinal tissue with functional photoreceptors from human iPSCs.</a> Nature Communication. 5, 4047(2014).</li>
<li>Liu, C., Oikonomopoulos, A., Sayed, N., Wu, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modeling+human+diseases+with+induced+pluripotent+stem+cells%3A+from+2D+to+3D+and+beyond%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Modeling human diseases with induced pluripotent stem cells: from 2D to 3D and beyond.</a> Development. 145 (5), (2018).</li>
<li>Lamba, D. A., Gust, J., Reh, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transplantation+of+human+embryonic+stem+cell-derived+photoreceptors+restores+some+visual+function+in+Crx-deficient+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Transplantation of human embryonic stem cell-derived photoreceptors restores some visual function in Crx-deficient mice.</a> Cell Stem Cell. 4 (1), 73-79 (2009).</li>
<li>Reichman, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((From+confluent+human+iPS+cells+to+self-forming+neural+retina+and+retinal+pigmented+epithelium%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences%22%5BJournal%5D)">From confluent human iPS cells to self-forming neural retina and retinal pigmented epithelium.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 111 (23), 8518-8523 (2014).</li>
<li>Maeda, A., Mandai, M., Takahashi, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gene+and+Induced+Pluripotent+Stem+Cell+Therapy+for+Retinal+Diseases%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+Genomics+and+Human+Genetics%22%5BJournal%5D)">Gene and Induced Pluripotent Stem Cell Therapy for Retinal Diseases.</a> Annual Review Genomics and Human Genetics. 20, 201-216 (2019).</li>
<li>Kruczek, K., Swaroop, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pluripotent+stem+cell-derived+retinal+organoids+for+disease+modeling+and+development+of+therapies%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells%22%5BJournal%5D)">Pluripotent stem cell-derived retinal organoids for disease modeling and development of therapies.</a> Stem Cells. 38 (10), 1206-1215 (2020).</li>
<li>O'Hara-Wright, M., Gonzalez-Cordero, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Retinal+organoids%3A+a+window+into+human+retinal+development%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Retinal organoids: a window into human retinal development.</a> Development. 147 (24), (2020).</li>
<li>Eckert, P., Knickmeyer, M. D., Schutz, L., Wittbrodt, J., Heermann, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Morphogenesis+and+axis+specification+occur+in+parallel+during+optic+cup+and+optic+fissure+formation%2C+differentially+modulated+by+BMP+and+Wnt%5BTitle%5D)+AND+%22Open+Biology%22%5BJournal%5D)">Morphogenesis and axis specification occur in parallel during optic cup and optic fissure formation, differentially modulated by BMP and Wnt.</a> Open Biology. 9 (2), 180179(2019).</li>
<li>Patel, A., Sowden, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genes+and+pathways+in+optic+fissure+closure%5BTitle%5D)+AND+%22Seminals+in+Cell+and+Development+Biology%22%5BJournal%5D)">Genes and pathways in optic fissure closure.</a> Seminals in Cell and Development Biology. 91, 55-65 (2019).</li>
<li>Chan, B. H. C., Moosajee, M., Rainger, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Closing+the+Ggap%3A+Mechanisms+of+epithelial+fusion+during+optic+fissure+closure%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Cell+and+Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">Closing the Ggap: Mechanisms of epithelial fusion during optic fissure closure.</a> Frontiers in Cell and Developmental Biology. 8, (2021).</li>
<li>Li, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+retinal+organoids+with+mature+rods+and+cones+from+urine-derived+human+induced+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells+International%22%5BJournal%5D)">Generation of retinal organoids with mature rods and cones from urine-derived human induced pluripotent stem cells.</a> Stem Cells International. 2018, 4968658(2018).</li>
<li>Liu, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Self-formation+of+RPE+spheroids+facilitates+enrichment+and+expansion+of+hiPSC-derived+RPE+generated+on+retinal+organoid+induction+platform%5BTitle%5D)+AND+%22Investigative+Ophthalmology+and+Visual+Science%22%5BJournal%5D)">Self-formation of RPE spheroids facilitates enrichment and expansion of hiPSC-derived RPE generated on retinal organoid induction platform.</a> Investigative Ophthalmology and Visual Science. 59 (13), 5659-5669 (2018).</li>
<li>Luo, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+optimized+system+for+effective+derivation+of+three-dimensional+retinal+tissue+via+Wnt+signaling+regulation%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells%22%5BJournal%5D)">An optimized system for effective derivation of three-dimensional retinal tissue via Wnt signaling regulation.</a> Stem Cells. 36 (11), 1709-1722 (2018).</li>
<li>Li, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+and+characterization+of+induced+pluripotent+stem+cells+and+retinal+organoids+from+a+leber%27s+congenital+amaurosis+patient+with+novel+RPE65+mutations%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Molecular+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Generation and characterization of induced pluripotent stem cells and retinal organoids from a leber's congenital amaurosis patient with novel RPE65 mutations.</a> Frontiers in Molecular Neuroscience. 12, 212(2019).</li>
<li>Matsa, E., Ahrens, J. H., Wu, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+induced+pluripotent+stem+cells+as+a+platform+for+personalized+and+precision+cardiovascular+medicine%5BTitle%5D)+AND+%22Physiology+Reviews%22%5BJournal%5D)">Human induced pluripotent stem cells as a platform for personalized and precision cardiovascular medicine.</a> Physiology Reviews. 96 (3), 1093-1126 (2016).</li>
<li>Wahlin, K. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Photoreceptor+outer+segment-like+structures+in+long-term+3d+retinas+from+human+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Science+Reports%22%5BJournal%5D)">Photoreceptor outer segment-like structures in long-term 3d retinas from human pluripotent stem cells.</a> Science Reports. 7 (1), 766(2017).</li>
<li>Eiraku, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Self-organizing+optic-cup+morphogenesis+in+three-dimensional+culture%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Self-organizing optic-cup morphogenesis in three-dimensional culture.</a> Nature. 472 (7341), 51-56 (2011).</li>
<li>Reichman, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+storable+retinal+organoids+and+retinal+pigmented+epithelium+from+adherent+human+iPS+cells+in+xeno-free+and+feeder-free+conditions%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells%22%5BJournal%5D)">Generation of storable retinal organoids and retinal pigmented epithelium from adherent human iPS cells in xeno-free and feeder-free conditions.</a> Stem Cells. 35 (5), 1176-1188 (2017).</li>
<li>Lamba, D. A., Karl, M. O., Ware, C. B., Reh, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+generation+of+retinal+progenitor+cells+from+human+embryonic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Science+U.+S.+A%22%5BJournal%5D)">Efficient generation of retinal progenitor cells from human embryonic stem cells.</a> Proceedings of the National Academy of Science U. S. A. 103 (34), 12769-12774 (2006).</li>
<li>Kuwahara, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+a+ciliary+margin-like+stem+cell+niche+from+self-organizing+human+retinal+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communication%22%5BJournal%5D)">Generation of a ciliary margin-like stem cell niche from self-organizing human retinal tissue.</a> Nature Communication. 6, 6286(2015).</li>
<li>da Silva, S., Cepko, C. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fgf8+expression+and+degradation+of+retinoic+acid+are+required+for+patterning+a+high-acuity+area+in+the+retina%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Cell%22%5BJournal%5D)">Fgf8 expression and degradation of retinoic acid are required for patterning a high-acuity area in the retina.</a> Developmental Cell. 42 (1), 68-81 (2017).</li>
<li>Mitchell, D. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Retinoic+acid+signaling+regulates+differential+expression+of+the+tandemly-duplicated+long+wavelength-sensitive+cone+opsin+genes+in+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Genetics%22%5BJournal%5D)">Retinoic acid signaling regulates differential expression of the tandemly-duplicated long wavelength-sensitive cone opsin genes in zebrafish.</a> PLoS Genetics. 11 (8), 1005483(2015).</li>
<li>Stevens, C. B., Cameron, D. A., Stenkamp, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Plasticity+of+photoreceptor-generating+retinal+progenitors+revealed+by+prolonged+retinoic+acid+exposure%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">Plasticity of photoreceptor-generating retinal progenitors revealed by prolonged retinoic acid exposure.</a> BMC Developmental Biology. 11 (1), (2011).</li>
<li>Eldred, K. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Thyroid+hormone+signaling+specifies+cone+subtypes+in+human+retinal+organoids%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Thyroid hormone signaling specifies cone subtypes in human retinal organoids.</a> Science. 362 (6411), (2018).</li>
<li>Yang, F., Ma, H., Ding, X. Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Thyroid+hormone+signaling+in+retinal+development%2C+survival%2C+and+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Vitamins+and+Hormones%22%5BJournal%5D)">Thyroid hormone signaling in retinal development, survival, and disease.</a> Vitamins and Hormones. 106, 333-349 (2018).</li>
<li>Brzezinski, J. A., Reh, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Photoreceptor+cell+fate+specification+in+vertebrates%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Photoreceptor cell fate specification in vertebrates.</a> Development. 142 (19), 3263-3273 (2015).</li>
<li>Kim, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation%2C+transcriptome+profiling%2C+and+functional+validation+of+cone-rich+human+retinal+organoids%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Science+U.+S.+A%22%5BJournal%5D)">Generation, transcriptome profiling, and functional validation of cone-rich human retinal organoids.</a> Proceedings of the National Academy of Science U. S. A. 116 (22), 10824-10833 (2019).</li>
<li>Lowe, A., Harris, R., Bhansali, P., Cvekl, A., Liu, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intercellular+adhesion-dependent+cell+survival+and+ROCK-regulated+actomyosin-driven+forces+mediate+self-formation+of+a+retinal+organoid%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">Intercellular adhesion-dependent cell survival and ROCK-regulated actomyosin-driven forces mediate self-formation of a retinal organoid.</a> Stem Cell Reports. 6 (5), 743-756 (2016).</li>
<li>Carcamo-Orive, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+transcriptional+variability+in+a+large+human+ipsc+library+reveals+genetic+and+non-genetic+determinants+of+heterogeneity%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Analysis of transcriptional variability in a large human ipsc library reveals genetic and non-genetic determinants of heterogeneity.</a> Cell Stem Cell. 20 (4), 518-532 (2017).</li>
<li>DeBoever, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Large-scale+profiling+reveals+the+influence+of+genetic+variation+on+gene+expression+in+human+induced+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Large-scale profiling reveals the influence of genetic variation on gene expression in human induced pluripotent stem cells.</a> Cell Stem Cell. 20 (4), 533-546 (2017).</li>
</ol>

Xiufeng Zhong ist der Patenterfinder im Zusammenhang mit der Erzeugung von Netzhautzellen aus humanen pluripotenten Stammzellen.

In diesem mehrstufigen netztinalen Induktionsprotokoll wurden hPSCs Schritt für Schritt geführt, um das Retinalschicksal zu erlangen, und selbstorganisiert in retinale Organoide, die laminiertes NR und RPE enthalten. Während der Differenzierung rekapitulierten hPSCs alle wichtigen Schritte der menschlichen Netzhautentwicklung in vivo, von EF, OV und RPE bis zur netztinalen Laminierung, wobei alle Subtypen von Netzhautzellen, einschließlich retinaler Ganglienzellen, amakrinen Zellen, bipolaren Zellen, Stäbchen- u...

Retinale degenerative Erkrankungen (RDs), wie altersbedingte Makuladegeneration (AMD) und Retinitis pigmentosa (RP), sind durch die Dysfunktion und den Tod von Photorezeptorzellen gekennzeichnet und führen typischerweise zu irreversiblem Sehverlust ohne wirksame Heilungsmöglichkeiten1. Der Mechanismus, der diesen Krankheiten zugrunde liegt, ist weitgehend unbekannt, teilweise aufgrund fehlender menschlicher Krankheitsmodelle2. In den letzten Jahrzehnten wurden in der regenerativen Medizin durch die Stammzelltechnologie bedeutende Fortschritte erzielt. Viele Forscher, einschließlich uns, haben gezeigt, dass menschliche pluripotente Stammzellen (hPSCs), einschließlich menschlicher embryonaler Stammzellen (hESCs) und humaner induzierter pluripotenter Stammzellen (hiPSCs), sich durch verschiedene Differenzierungsansätze in alle Arten von Netzhautzellen, sogar in Mini-Netzhautgewebe, differenzieren können3,4,5,6,7,8,9,10, 11, bietet ein enormes Potenzial in der Krankheitsmodellierung und Zelltherapie12,13,14.
Der Induktionsprozess von hPSCs zu Netzhautzellen ist jedoch sehr kompliziert und zeitaufwendig mit geringer Wiederholbarkeit, was Forscher mit reicher Erfahrung und hohen Fähigkeiten erfordert. Während des komplexen und dynamischen Induktionsprozesses beeinflussen eine Reihe von Faktoren die Ausbeute an Netzhautgeweben15,16,17. Außerdem unterscheiden sich verschiedene Induktionsmethoden oft erheblich im Timing und in der robusten Expression von Netzhautmarkern, was die Probenentnahme und Dateninterpretation verwirren könnte3. Daher wäre ein einfaches Protokoll der netztinalen Differenzierung von hPSCs mit Schritt-für-Schritt-Anleitung gefragt.
Hier wird basierend auf unseren veröffentlichten Studien18,19,20,21, ein optimiertes retinales Induktionsprotokoll zur Erzeugung von Netzhautorganoiden (ROs) mit reichen Zapfenphotorezeptoren aus hPSCs beschrieben, die keine Ergänzung von Retinsäure (RA) erfordern. Dieses Protokoll konzentriert sich auf die Beschreibung der mehrstufigen Methode zur Erzeugung neuronaler Netzhaut und RPE. Die EB-Bildung ist der wesentliche Teil der frühen Induktionsphase. Sowohl Größe als auch Beschichtungsdichte von EBs sind quantitativ optimiert, was die Ausbeute von Netzhautgewebe wissenschaftlich erhöht und die Wiederholbarkeit fördert. Im zweiten Teil der Induktion organisieren sich optische Vesikel (OVs) in der Adhärenzkultur selbst und ROs bilden sich in der Suspensionskultur; Die Zeit- und Effizienzgewinne dieses Teils variieren in den verschiedenen hPSC-Linien erheblich. Die Reifung und Spezifizierung von Netzhautzellen in ROs erfolgt hauptsächlich im mittleren und späten Stadium der Induktion. Ohne die Zugabe von RA können reife Photorezeptoren mit sowohl reichen Zapfen als auch Stäbchen hergestellt werden.
Der Zweck dieses Protokolls besteht darin, jeden Schritt quantitativ zu beschreiben und zu beschreiben, damit unerfahrene Forscher ihn wiederholen können. Verschiedene hPSC-Linien wurden durch dieses Protokoll erfolgreich in ROs induziert, mit einer robusten Ausbeute an kegelreichem Netzhautgewebe und hoher Wiederholbarkeit. HPSCs-abgeleitete ROs mit diesem Protokoll können die wichtigsten Schritte der Netzhautentwicklung in vivorekapitulieren und langfristig überleben, was nachgelagerte Anwendungen wie Krankheitsmodellierung, Arzneimittelscreening und Zelltherapie erleichtert.

<table><tbody><tr><td>(&minus;)-Blebbistatin</td><td>Sigma</td><td>B0560-5mg</td><td>ROCK-Inhibitor</td></tr><tr><td>1 ml Spitzen</td><td>Kirgen</td><td>KG1313</td><td>1 ml</td></tr><tr><td>10 ml Pipette</td><td>Sorfa</td><td>3141001</td><td>Pipette</td></tr><tr><td>100 mm Gewebekultur</td><td>BIOFIL</td><td>TCD000100</td><td>100 mm Petrischale</td></tr><tr><td>100 mm Gewebekultur</td><td>Falcon</td><td>353003</td><td>100 mm Petrischale</td></tr><tr><td>15 ml Zentrifugenröhrchen</td><td>BIOFIL</td><td>CFT011150</td><td>Zentrifugenröhrchen</td></tr><tr><td>35 mm Gewebekulturschalen</td><td>Falcon</td><td>353001</td><td>35 mm Petrischale</td></tr><tr><td>5 ml Pipette</td><td>Sorfa</td><td>313000</td><td>Pipette</td></tr><tr><td>50 ml Zentrifugenröhrchen</td><td>BIOFIL</td><td>CFT011500</td><td>Zentrifugenröhrchen</td></tr><tr><td>6 Vertiefungen Gewebekulturplatten</td><td>Costar</td><td>3516</td><td>Kulturplatten</td></tr><tr><td>Anti-AP2&alpha; Antikörper</td><td>DSHB</td><td>3b5</td><td>primär&nbsp; Antikörper</td></tr><tr><td>ANTIBIOTIC ANTIMYCOTIC 100X</td><td>Gibco</td><td>15240062</td><td>Antibiotikum-Antimykotikum</td></tr><tr><td>Anti-ISL1 Antikörper</td><td>Boster</td><td>BM4446</td><td>Primär&nbsp; Antikörper</td></tr><tr><td>Anti-Ki67 Antikörper</td><td>Abcam</td><td>ab15580</td><td>Primär&nbsp; Antikörper</td></tr><tr><td>Anti-L/M Opsin Antikörper</td><td>Geschenk von Dr. jeremy</td><td>/</td><td>Primary&nbsp; Antikörper</td></tr><tr><td>Anti-PAX6 Antikörper</td><td>DSHB</td><td>pax6</td><td>Primär&nbsp; Antikörper</td></tr><tr><td>Anti-Kaninchen 555</td><td>Invitrogen</td><td>A31572</td><td>Esel Anti-Kaninchen IgG (H+L) Sekundärantikörper, Alexa Fluor 555</td></tr><tr><td>Anti-Recoverin Antikörper</td><td>Millipore</td><td>ab5585</td><td>Primär Antikörper</td></tr><tr><td>Anti-Rhodopsin Antikörper</td><td>Abcam</td><td>ab5417</td><td>Primär Antikörper</td></tr><tr><td>Anti-Schaf 555</td><td>Invitrogen</td><td>A21436</td><td>Esel Anti-Schaf IgG (H+L) Sekundärer Antikörper, Alexa Fluor 555</td></tr><tr><td>Anti-SOX9 Antikörper</td><td>Abklonal</td><td>A19710</td><td>Primär Antikörper</td></tr><tr><td>Anti-VSX2 Antikörper</td><td>Millipore</td><td>ab9016</td><td>Primär Antikörper</td></tr><tr><td>B-27 Supplement W/O VIT A (50X)</td><td>Gibco</td><td>12587010</td><td>Supplement</td></tr><tr><td>Cryotube Fläschchen</td><td>Thermo scientific-NUNC</td><td>375418</td><td>1,8 ml</td></tr><tr><td>DAPI</td><td>DOJINDO</td><td>D532</td><td>4',6-Diamidino-2-phenylindole dihydrochlorid; mehrere Lieferanten</td></tr><tr><td>Dimethylsulfoxid (DMSO) Hybri-max</td><td>Sigma</td><td>D2650-100ML</td><td>Mehrere Lieferanten</td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Gibco</td><td>C11995500BT</td><td>Medium</td></tr><tr><td>DMEM /F12</td><td>Gibco</td><td>C11330500BT</td><td>Medium</td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Invitrogen</td><td>15575-020</td><td>0.5 M PH 8.0</td></tr><tr><td>FBS</td><td>NATOCOR</td><td>SFBE</td><td>Serum</td></tr><tr><td></td><td>Filter Millipore</td><td>SLGP033RB</td><td>0.22&mu; m, steriler Millex-Filter</td></tr><tr><td>GlutaMax, 100X</td><td>Gibco</td><td>35050061</td><td>L-Alanyl-L-Glutamin</td></tr><tr><td>Heparin</td><td>Sigma</td><td>H3149</td><td>2 mg/ml in PBS zur Verwendung</td></tr> von <tr><td>Matrigel, 100x</td><td>Corning</td><td>354277</td><td>Extrazelluläre Matrix (ECM)</td></tr><tr><td>MEM Nicht-essentielle Aminosäuren Lösung (100X)</td><td>Gibco</td><td>11140050</td><td>MEM NEAA</td></tr><tr><td>mTeSR1</td><td>STAMMZELLE</td><td>85850</td><td>hPSCs Erhaltungsmedium (MM)</td></tr><tr><td>N2 Ergänzung</td><td>Gibco</td><td>17502048</td><td>Ergänzung</td></tr><tr><td>Phosphatgepufferte Kochsalzlösung (PBS) Puffer</td><td>GNM</td><td>GNM10010</td><td>Ohne Ca+,Mg+,PH7,2&plusmn; 0.1 0.1M</td></tr><tr><td>Taurin</td><td>Sigma</td><td>T0625</td><td>Ergänzung</td></tr><tr><td>Kulturschalen mit extrem niedrigem Aufsatz 100 mm Petrischale,</td><td>Corning</td><td>CLS3262-20EA</td><td>Petrischale</td> mit niedrigem Aufsatz</tr></tbody></table>

retinale organoid-induktionssystem zur ableitung von 3d-netzhautgewebe aus humanen pluripotenten stammzellen

Retinal Organoid Induction System for Derivation of 3D Retinal Tissues from Human Pluripotent Stem Cells

Degenerative Erkrankungen der Netzhaut sind die Hauptursachen für irreversible Erblindung ohne wirksame Behandlung. Pluripotente Stammzellen, die das Potenzial haben, sich in alle Arten von Netzhautzellen zu differenzieren, sogar in Mini-Netzhautgewebe, sind für Patienten mit diesen Krankheiten vielversprechend und bieten viele Möglichkeiten bei der Krankheitsmodellierung und dem Arzneimittelscreening. Der Induktionsprozess von hPSCs zu Netzhautzellen ist jedoch kompliziert und zeitaufwendig. Hier beschreiben wir ein optimiertes retinales Induktionsprotokoll zur Erzeugung von Netzhautgewebe mit hoher Reproduzierbarkeit und Effizienz, das für verschiedene humane pluripotente Stammzellen geeignet ist. Dieses Protokoll wird ohne Zusatz von Retinsäure durchgeführt, was der Anreicherung von Zapfenphotorezeptoren zugute kommt. Der Vorteil dieses Protokolls ist die Quantifizierung der EB-Größe und der Beschichtungsdichte, um die Effizienz und Wiederholbarkeit der Netzhautinduktion signifikant zu verbessern. Mit dieser Methode erscheinen alle wichtigen Netzhautzellen nacheinander und rekapitulieren die Hauptschritte der Netzhautentwicklung. Es wird nachgelagerte Anwendungen wie Krankheitsmodellierung und Zelltherapie erleichtern.

Der retinale Induktionsprozess in diesem Protokoll ahmt die Entwicklung der menschlichen fetalen Netzhaut nach. Um die netzhautale Differenzierung einzuleiten, wurden hPSCs in kleine Klumpen dissoziiert und in Suspension kultiviert, um die Bildung von EBs zu induzieren. Auf D1 bildeten sich die uniformierten Zellaggregate oder EBs (Abbildung 1C). Das Kulturmedium wurde schrittweise in NIM überführt. Auf D5 wurden EBs auf die ECM-beschichteten Kulturschalen auftätigt. Zellen wanderten allmähl...

Hier beschreiben wir ein optimiertes retinale Organoid-Induktionssystem, das für verschiedene humane pluripotente Stammzelllinien geeignet ist, netzhautähnliche Gewebe mit hoher Reproduzierbarkeit und Effizienz zu erzeugen.

Retinale Organoid-Induktionssystem zur Ableitung von 3D-Netzhautgewebe aus humanen pluripotenten Stammzellen

Retinal degenerative diseases are the main causes of irreversible blindness without effective treatment. Pluripotent stem cells that have the potential to ...

Der Induktionsprozess von hPSCs zu Netzhautzellen ist kompliziert und zeitaufwendig. Dieses optimierte Protokoll kann Netzhautgewebe mit hoher Reproduzierbarkeit und ohne Kosten erzeugen. Der Vorteil dieses Protokolls ist die Quantifizierung der EB-Größe und der Beschichtungsdichte, um die Effizienz und Wiederholbarkeit der Netzhautinduktion von hPSCs deutlich zu verbessern.Mit dieser Methode erscheinen alle wichtigen Netzhautzellen nacheinander und rekapitulieren die Hauptschritte der Netzhautentwicklung. Es wird die Krankheitsmodellierung und Zelltherapie bei degenerativen Erkrankungen der Netzhaut erleichtern. Bei der Demonstration des Verfahrens sind wir mit Yuanyuan Guan, einem Doktoranden, und Bingbing Xie, einem Techniker aus dem Labor, zusammen.Beginnen Sie mit der Vorbereitung von 50 ml ECM-Lösung, indem Sie 1 ml der dritten 50-fachen Stammlösung zu 50 ml DMEM hinzufügen. Dann fügen Sie 1 ml dieser vorbereiteten ECM-Lösung zu jeder Vertiefung einer Sechs-Well-Platte hinzu und inkubieren Sie sie für eine Stunde bei 37 Grad Celsius und 5% Kohlendioxid. Bereiten Sie das hPSC-Wartungsmedium gemäß den Anweisungen des Herstellers vor und wärmen Sie es für 30 Minuten auf Raumtemperatur vor.Gießen Sie eine kryogene Durchstechflasche mit hPSCs aus einem Flüssigstickstofftank, indem Sie sie 30 Sekunden lang in einem Wasserbad bei 37 Grad Celsius inkubieren. Desinfizieren Sie es vorsichtig mit einem 75% Alkoholspray und legen Sie es in eine Biosicherheitswerkbank. Übertragen Sie die Zellsuspension aus der Durchstechflasche in eine 15-Millimeter-Tube.Dann fügen Sie 5 ml vorgewärmtes Wartungsmedium Tropfen für Tropfen mit einer 5-ml-Pipette in das Röhrchen hinzu, während Sie das Rohr vorsichtig schütteln, um die hPSCs zu mischen. Zentrifugieren Sie das Röhrchen bei 170 mal G für fünf Minuten. Entfernen Sie vorsichtig den größten Teil des Überstands mit einer 1-ml-Pipette und lassen Sie etwa 50 Mikroliter Überstand zurück, um den Verlust der Zellen zu vermeiden.Suspendieren Sie das Pellet mit 1 ml Pflegemedium durch Pipettieren nach oben und unten. Entfernen Sie ECM aus den vorbeschichteten Vertiefungen und fügen Sie jeder Vertiefung 1,5 Milliliter Pflegemedium hinzu. Verteilen Sie dann 0,5 Milliliter Zellsuspension in jede Vertiefung.Schütteln Sie die Platte vorsichtig, um die hPSCs gleichmäßig zu verteilen. Legen Sie die Platte für mindestens 24 Stunden in einen Inkubator bei 37 Grad Celsius und 5% Kohlendioxid, um die Zelladhärenz zu fördern. Wechseln Sie jeden Tag das Medium und die hPSCs bei 80% Konfluenz.Initiieren Sie am Tag 0 die Differenzierung, indem Sie die 80% Konfluenzzellen aus einer Vertiefung der Sechs-Well-Platte entfernen. Sammeln Sie die Zellen mit EDTA-Dissoziationslösung, wie im Textmanuskript beschrieben. Entfernen Sie die EDTA-Lösung und fügen Sie 1 ml Erhaltungsmedium hinzu, das 10 mikromolare Fluvastatin enthält, um die Zelldissoziation zu stoppen.Sammeln Sie die Zellen mit einer 1 mL Pipette. Die Zellsuspension wird in eine 100 Millimeter ultratief angebrachte Petrischale überführen und 9 ml Erhaltungsmedium mit 10 mikromolarem Fluvastatin in die Schale geben. Schütteln Sie die Schüssel vorsichtig zweimal, um die Zellen gleichmäßig zu verteilen.Dann legen Sie es in den Inkubator bei 37 Grad Celsius und 5% Kohlendioxid. Nachdem die Zellen mindestens 24 Stunden kultiviert wurden, beobachten Sie sie unter dem Mikroskop. Fügen Sie 9 ml Wartungsmedium und 3 ml NIM in ein 15-ml-Rohr hinzu.Die Zellkulturen in ein 15-ml-Zentrifugenröhrchen geben und 10 ml der vorgewärmten NIM-Mischung in die Schüssel geben. Zentrifugieren Sie das Röhrchen bei 60 mal G für 3 Minuten, um die Aggregate zu sammeln. Entfernen Sie dann den Überstand mit einer 5-ml-Pipette und lassen Sie etwa 500 Mikroliter zurück, um den Verlust von Zellen zu vermeiden.2 ml der Mischung in das Röhrchen geben und die Suspension wieder in dieselbe Petrischale geben. Schütteln Sie die Schüssel vorsichtig, um die Zellaggregate gleichmäßig zu verteilen. Dann legen Sie die Schüssel wieder in den Inkubator.Entfernen Sie am 5. Tag ECM aus dem vorbeschichteten Geschirr und fügen Sie jedem Gericht 10 ml vorgewärmtes NIM hinzu. Nehmen Sie die Schüssel mit Ebs heraus und überprüfen Sie die Qualität der EBs unter dem Mikroskop, um sicherzustellen, dass sie hell und rund sind. Sammeln Sie alle EBs in einem 15-ml-Röhrchen und lassen Sie sie 5 Minuten ruhen.Entfernen Sie dann den größten Teil des Überstands und lassen Sie etwa 2 ml Medium zurück. Nachdem Sie die EBs gezählt haben, säen Sie sie Tropfen für Tropfen mit einer Dichte von etwa 2-3 EBs pro Quadratzentimeter in beschichtete Schalen mit 10 ml NIM. Schütteln Sie das Geschirr vorsichtig, um die EBs gleichmäßig zu verteilen, und legen Sie sie für mindestens 24 Stunden in den Inkubator.Verwenden Sie eine Wolframnadel oder eine Nadel mit einer 1-ml-Spritze, um die morphologisch identifizierbaren optischen Vesikel zusammen mit dem angrenzenden retinalen Pigmentepithel an den Tagen 28 bis 35 mechanisch zu lösen. Kultur sie in Schwebe. Geben Sie 50-60 optische Vesikel in jede 100 Millimeter niedrige Befestigungskulturschale, die 15 ml RDM für die retinale Organoidbildung enthält.Wechseln Sie das Medium alle 2 bis 3 Tage bis Tag-42. Um die netzhautale Differenzierung einzuleiten, wurden hPSCs in kleine Klumpen dissoziiert und in Suspension kultiviert, die seit Tag 1 EBs bildeten. Am Tag 5 wurden EBs auf die ECM-beschichteten Kulturschalen plattiert und die Zellen wanderten allmählich aus den EBs aus.Am 16. Tag wurde das Induktionsmedium durch RDM ersetzt, wodurch sich die neuralen Netzhautdomänen bildeten und allmählich aus der Schüssel herausragten, sowie zellbildende optische Vesikel-ähnliche Strukturen, die von RPE-Zellen umgeben sind. Während der Tage-28 bis 35 retinale Organoide, bestehend aus der neuronalen Netzhaut, an einer RPE-Kugel befestigt. Auf einer Seite bildeten sich Zellen.Als die Netzhautdifferenzierung und -spezifikation voranschritt, produzierten hPSCs Subtypen der neuronalen Netzhaut, die sich allmählich in Schichten anlehnten und die architektonischen Merkmale einer einheimischen menschlichen Netzhaut nachahmten. Retinale Ganglienzellen wurden zuerst aus retinalen Vorläuferzellen erzeugt und in der basalen Seite der Neuro-Netzhaut akkumuliert. Mit diesem Protokoll entwickelten sich Netzhautorganoide zu hochreifen Photorezeptoren mit sowohl reichen Stäbchen als auch Zapfen.Photorezeptorzellen befanden sich auf der apikalen Seite, während sich amakrine Zellen, horizontale Zellen, bipolare Zellen und Müller-Gliazellen alle in der Zwischenschicht der neuronalen Netzhaut befanden. Die Wichtigsten dieses Protokolls sind die Schaffung einer hohen Qualität von Ebs und die Aussaat mit der richtigen Dichte.

retinal-organoid-induction-system-for-derivation-3d-retinal-tissues

Research

Forschung

JoVE Journal

Medicine

Medizin

Die Produktion von spezialisierten netzhautzellen aus pluripotenten Stammzellen ist ein Wendepunkt in der Entwicklung der Stammzell-Therapie für Erkrankungen der Netzhaut. Der vorliegende Beitrag beschreibt eine einfache Methode für eine effiziente Erzeugung von retinalen Organellen und retinalen Pigment Epithel für Grund-, translationalen und klinischen Forschung.

Definierten Xeno-frei und Feeder-freie Kulturbedingungen für die Generation der menschlichen iPSC-abgeleitete Retinal Zellmodellen

Hier stellen wir ein Schritt-für-Schritt-Protokoll vor, um reife menschliche Netzhautorganoide zu erzeugen und sie in einem Photorezeptor-Toxizitätstest zu verwenden, um pharmazeutische Kandidaten für die altersbedingte retinale degenerative Erkrankung Makulateleangiektasien Typ 2 (MacTel) zu identifizieren.

Toxizitätsscreens in humanen Netzhautorganoiden für die pharmazeutische Forschung

Mit einer selbstorganisierenden Methode entwickeln wir ein Protokoll mit dem Zusatz von COCO, das die Bildung von Photorezeptoren signifikant erhöhen könnte.

Gerichtete Induktion retinaler Organoide aus humanen pluripotenten Stammzellen

Dieses Protokoll beschreibt eine effiziente Methode zur Differenzierung von hiPS-Zellen in Augenfeld-Cluster und zur Erzeugung neuro-retinaler Organoide unter Verwendung vereinfachter Kulturbedingungen, die sowohl adhärente als auch Suspensionskultursysteme umfassen. Auch andere Augenzelltypen, wie das RPE und das Hornhautepithel, können aus reifen Augenfeldern in Netzhautkulturen isoliert werden.

Erzeugung retinaler Organoide aus gesunden und netzhautspezifischen, human-induzierten pluripotenten Stammzellen

Das vorliegende Protokoll beschreibt ein optimiertes 3D-System zur Induktion neuronaler Netzhaut, das die Adhäsion und Fusion von Netzhautorganoiden mit hoher Wiederholbarkeit und Effizienz reduziert.

Erzeugung neuronaler Netzhaut aus humanen pluripotenten Stammzellen

Mikroglia sind einzigartige residente Immunzellen in der Netzhaut, die eine entscheidende Rolle bei verschiedenen degenerativen Erkrankungen der Netzhaut spielen. Die Generierung eines Co-Kulturmodells von retinalen Organoiden mit Mikroglia kann ein besseres Verständnis der Pathogenese und des Entwicklungsfortschritts von Netzhauterkrankungen ermöglichen.

Assemblierung von Netzhaut-Organoiden mit Mikroglia

Dieses Protokoll kombiniert optisches Clearing und Immunmarkierung für die konfokale Bildgebung des gesamten Volumens von Netzhautorganoiden in der gesamten Halterung. Es bewahrt die 3D-Struktur und ermöglicht eine detaillierte Visualisierung wichtiger neuronaler Signalwege und verbessert die Untersuchung der Netzhautreifung, der räumlichen Organisation und ihrer potenziellen Anwendungen in der Krankheitsmodellierung und personalisierten Medizin.

Visualisierung von retinalen Organoiden mit zellulärer Auflösung

Das Papier beschreibt ein vereinfachtes Verfahren zur Hornhaut-und Verbrauchssteuern zu retinalen Gewebe aus dem Augapfel von menschlichen Leichen Spendern auszuhöhlen. Die hier beschriebene Technik wird verbrauchsteuerpflichtige guter Qualität zu Geweben zur Transplantation oder chirurgische Zwecke oder Forschungszwecke ohne Beschädigung anderer Gewebe des Augapfels verwendet werden zu helfen.

Ein vereinfachtes Verfahren für<em&gt; In-situ</em&gt; Exzision der Hornhaut und der Netzhaut Ausweiden von Gewebe aus menschlichen Augapfel

Das beschriebene Verfahren Isolierung und Charakterisierung von menschlichen Zahnpulpa Stammzellen (hDPSCs) unter Verwendung...

Isolation, Charakterisierung und vergleichende Differenzierung humaner Dental Pulp Stammzellen aus bleibenden Zähne mit zwei verschiedenen Methoden abgeleitet

Wir verwendeten Retina Proben aus Retinektomie für eine Transkriptom-Analyse der Netzhautablösung. Wir entwickelten ein Verfahren, das RNA Konservierung zwischen den chirurgischen Blöcke und Labor ermöglicht. Wir standardisierten ein Protokoll zur RNA durch Caesiumchlorid Ultrazentrifugation, um sicherzustellen, dass die gereinigten RNAs geeignet für Microarray-Analyse sind zu reinigen.

Transkriptom-Analyse der menschlichen Retina chirurgischen Proben mit Journal

Lernen Sie ein optimiertes Protokoll zur Induktion retinaler Organoide aus humanen pluripotenten Stammzellen. Diese Methode ermöglicht die effiziente und reproduzierbare Generierung von 3D-Netzhautgewebe für Krankheitsmodellierung und Zelltherapie.

Retinale Organoid-Induktionssystem zur Ableitung von 3D-Netzhautgewebe aus humanen pluripotenten Stammzellen

Weitere Videos entdecken