Konfokale Laser-Scanning-Mikroskopie-basierte quantitative Analyse der Aspergillus fumigatus Conidia-Verteilung in der optisch geklärten Mauslunge

Unser Ansatz ermöglicht es uns, die quantitative Analyse einer Aspergillus fumigatus Conidia-Verteilung in optisch gereinigten Mauslungen durchzuführen. Aspergillus fumigatus Conidia kann in die Atemwege eindringen und bei immungeschwächten Patienten lebensbedrohliche Erkrankungen verursachen. Die Atemwege von Säugetieren sind ein System von Atemwegen verschiedener Generationen.

Jede Generation zeichnet sich durch die unterschiedlichen Strukturen von Atemwegswänden und Immunzellpopulationen aus. In den Bronchialästen wird Aspergillus fumigatus Conidia durch mukokiliäre Clearance eliminiert. Auf dem verfügbaren Raum funktioniert die mukopoliliare Clearance jedoch nicht und Conidia muss von den Immunzellen wie Alveolarmakrophagen und Neutrophilen geklärt werden.

Ebenso wichtig sind die räumlich-zeitlichen Aspekte der Conidia-Verteilung in den Atemwegen. Allerdings nicht richtig untersuchte Frage zum Verständnis der Krankheitsmechanismen. Hier stellen wir einen Versuchsaufbau zur quantitativen Analyse der Verteilung von Aspergillus fumigatus Conidia in den Atemwegen infizierter Mäuse vor.

Ich trage 50 Mikroliter beschrifteten Aspergillus fumigatus Conidia auf die Maus auf. Sechs Stunden später ernten Sie die Lunge. Über Nacht in 2% Formaldehyd fixieren und mit markiertem Streptavidin-Konjugat beflecken.

Anschließend wird die Probe der optischen Lichtung unterzogen. Legen Sie die Probe in die mit 50% Methanolwasserlösung gefüllte Glasflasche und legen Sie sie eine Stunde lang bei Raumtemperatur auf den Probenmischer. Ersetzen Sie 50% Methanol durch 100% Methanol und legen Sie es für zwei Stunden unter den Probenmischer.

Bereiten Sie eine Mischung vor, die aus einem Teil Benzylalkohol und zwei Teilen Benzylbenzoat besteht. Die Probe auf die 24-Well-Platte geben und mindestens 30 Minuten mit der Benzyl-Benzoat-Mischung abdecken. Die Probe ist bereit für die Bildgebung.

Legen Sie die Probe auf den Probenhalter. Und legen Sie die Halterung in das Mikroskop. Nachdem Sie das Mikroskopsystem eingeschaltet und die Software geöffnet haben, schalten Sie das Durchlicht ein und wählen Sie ein X-Objektiv aus.

Lokalisieren Sie Ihre Probe visuell im Durchlicht und fahren Sie mit der Registerkarte Erfassung fort. Wählen Sie den Lambda-Modus für konfokale Lasermikroskopie. Schalten Sie die entsprechenden Laser ein.

Stellen Sie den Spektralbereich des Detektors ein und wählen Sie den dichroitischen Spiegel aus. Stellen Sie die Detektorverstärkung ein und verengen Sie das Loch auf eine Flächeneinheit. Stellen Sie die Pixelauflösung auf 512 x 512 ein.

Schalten Sie den zed-stack-Modus ein und starten Sie das Live-Imaging. Suchen Sie die Fokusebene, auf der beide Würfel sichtbar sind. Erweitern Sie das Bedienfeld "zed-stack".

Suchen und wählen Sie mithilfe des Fokussierens die unterste und die höchste Ebene der Probe aus. Positionieren Sie die Fokusebene neben dem Boden der Probe. Schalten Sie den Zed-Stack-Modus aus und wählen Sie den Scan-Modus ein.

Passen Sie bei Bedarf die Position X, Y und die Anzahl der Kacheln an. Aktivieren Sie den Zed-Stack- und Dial-Scan-Modus. Setzen Sie den zed-sectioning-Schritt auf fünf Mikrometer.

Stellen Sie die Scangeschwindigkeit ein. Starten Sie das Experiment. Die Bildgebung dauert in der Regel mehrere Stunden, abhängig von der Landgröße und der Scangeschwindigkeit.

Das erhaltene Bild wird dann spektral ungemischt. Verwenden Sie für die spektrale Entmischung die Option zum linearen Entmischen. Wählen Sie die Regionen aus, die den mit Streptavidin und Conidia gekennzeichneten Flächen entsprechen.

Beginnen Sie mit dem Entmischen. Speichern Sie nach dem Entmischen die nicht gemischte Datei. Um Kacheln aus dem erhaltenen Bild zu stichen, öffnen Sie das Bild.

Wählen Sie Methoden, geometrisches Nähen. Wählen Sie das Bild im Eingabefenster aus. Wählen Sie unter Stitching-Optionen die Option Neue Ausgabe und Sicherungskacheln aus.

Verwenden Sie den Referenzmodus mit ausgewähltem Kanal, der der Fluoreszenz der Atemwege entspricht. Öffnen Sie das Bild in einer überschüssigen 3D-Ansicht. Ändern Sie bei Bedarf die für die Präsentation verwendeten Farben.

Hier zeigen wir den Airways-Kanal in Grautönen und den Conidia-Kanal in Lila. Um eine Atemwegsmaske zu erstellen, verwenden Sie das Werkzeug Neue Fläche hinzufügen. Wählen Sie den Atemwegskanal und wählen Sie den Glättungsparameter von 10 Mikrometern.

Verschiedene Filter können verwendet werden, um signale aus den Atemwegen auszuschließen. Untersuchen Sie zunächst die Oberfläche visuell und legen Sie die Intensitätsschwelle fest. Zusätzliche Filter, wie die Oberfläche, können auch ausschließlich auf ausgewählte Atemwege angewendet werden, jedoch nicht auf Pleura oder Blutgefäße.

Löschen Sie als Nächstes manuell das ausgewählte Oberflächenfragment, das nicht zu den Atemwegen gehört. Jetzt können Sie die erzeugte Oberfläche beobachten und die fehlenden Teile untersuchen, um sie später zu korrigieren. Erstellen Sie eine Maske für die Atemwegsoberfläche mit den Optionen Bearbeiten und Alle maskieren.

Wählen Sie den Atemwegskanal aus, und setzen Sie Arbeitszellen außerhalb der Oberfläche auf 0,001. Hier haben wir die resultierende Maske in Orange gezeigt. Speichern Sie den Conidia-Kanal und die Atemwegsmaske in zwei separaten Ordnern als T der F-Serie.

Öffnen Sie die Datei mit dem Bild der Atemwegsmaske. Machen Sie das Bild binär. Folgen Sie dem binären Prozess, machen Sie binär.

Um der Maskendicke zu ähneln, wenden Sie mehrere erweiterte 3D-Funktionen an. Plugins folgen, verarbeiten, 3D erweitern. Sie können dazu auch Makrofunktionen verwenden.

Verwenden Sie nach mehreren Zyklen des Dilatprozesses die Funktion Fülllöcher. Folgen Sie dem Prozess, binär, füllen Sie Löcher. Um die Restlöcher in der Maske manuell zu füllen, öffnen Sie den Bereichs-Of-Interest-Manager.

Folgen Sie Analysen, Tools, ROI-Manager. Wählen Sie mit dem Polygonauswahlwerkzeug einen Bereich aus, der bei einer bestimmten Projektion gefüllt werden soll. Tun Sie dies mehrmals für wenige Projektionen in zed-stack, damit Sie Formen der interessierenden Bereiche interpolieren können.

Um die ausgewählten Formen zu interpolieren, wählen Sie alle aus und drücken Sie mehr, interpolieren Sie ROIs. Füllen Sie dann alle ROIs mit Weiß. Verwenden Sie erneut das Verfahren zum Füllen von Löchern.

Um die Maskendicke nach dem Füllen der Löcher wieder zusammenzustellen, wenden Sie die Erode-3D-Funktion an. Plugins folgen, verarbeiten, 3D erodieren. Sie können dafür auch Mikros verwenden.

Die Anzahl der Iterationen in Erode 3D und LA 3D sollte gleich sein. Starten Sie die Conidia count Anwendung. Drücken Sie die Schaltfläche Dateien hinzufügen und wählen Sie die Ordner mit DIFF-Dateien mit der vorbereiteten Atemwegsmaske und den Conidia-Fluoreszenzbildern aus.

Legen Sie einen benutzerdefinierten Schwellenwert zwischen Null und Eins fest. Drücken Sie OK und sehen Sie die Ergebnisse. Mit diesem Ansatz führen wir sechs Stunden nach der Anwendung von Conidia die quantitative Analyse der Conidia innerhalb und außerhalb des Bronchialbaums von Mäusen durch.

Die Daten deuten darauf hin, dass bei unserer ursprünglichen Anwendung der Großteil der Conidia in den Alveola-Raum eindringt und dort zu Beginn der entzündlichen Immunantwort zugeordnet wird. Die dreidimensionale Abbildung der Mauslunge mit konfokaler Laserscanning-Mikroskopie ermöglicht die Identifizierung von Aspergillus fumigatus Conidia in den Atemwegen. Die Verarbeitung dreidimensionaler Bilder mit diesem Protokoll ermöglicht eine quantitative Analyse der Conidia-Verteilung innerhalb und außerhalb der Bronchialäste.

Unser Ansatz kann auch verwendet werden, um die Kinetik der Conidia-Elimination aus den Abwesenheiten von Mäusen abzuschätzen und die anatomische Conidienverteilung bei immunkompetenten und immungeschwächten Mäusen zu vergleichen. Zusätzlich kann man mit diesem Ansatz die Verteilung der Mikropartikel oder Nanopartikel agglomerate in den Atemwegen analysieren.