Name: Etablierung und genetische Manipulation von murinen Hepatozyten-Organoiden (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-02-12T12:30:00.000+00:00
Duration: 14 min 54 s
Description: Erfahren Sie die Etablierung und genetische Manipulation muriner Hepatozyten-Organoide mittels Lentivirus-Infektion, siRNA-Transfektion und CRISPR-Cas9. Diese Methode ermöglicht Langzeitkulturen für Leberforschung.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Wir danken Professor Hans Clevers für die freundliche Bereitstellung der Zelllinien zur Herstellung von rekombinantem R-Spondin1. Diese Arbeit wurde durch die Zuschüsse des National Key R&D Program of China (2019YFA0111400), der National Natural Science Foundation of China (31970779) an H.H. und der Funds for Youth Interdisciplinary and Innovation Research Group der Shandong University (2020QNQT003) an H.H. unterstützt.

Alle Mäuseexperimente wurden vom Animal Care and Use Committee der School of Basic Medical Sciences an der Shandong University genehmigt und gemäß der Lizenz gemäß den Richtlinien und Vorschriften des Innenministeriums (Nr. ECSBMSSDU2019-2-079).
HINWEIS: Dieses Protokoll wird hauptsächlich verwendet, um 3D-Organoide aus isolierten primären Hepatozyten zu kultivieren.
1. Etablierung der Murinen Hepatozyten-Organoidkultur
HINWEIS: Extrazelluläre Matrix wie Matrigel oder BME werden als Basalmatrix zur Kultivierung von Organoiden verwendet. Lagern Sie die extrazelluläre Matrix bei -20 °C und tauen Sie sie bei 4 °C oder auf Eis auf. Bewahren Sie die extrazelluläre Matrix während der Experimente auf Eis auf. Das Waschmedium ist Advanced DMEM/F12, ergänzt mit GlutaMAX, HEPES und Penicillin/Streptomycin. Für die Organoidkultur wird ein Standard-Inkubator (37 °C, befeuchtete Atmosphäre, 5% CO2) verwendet.
<ol><li>Vorbereitung von Materialien<ol>
<li>Bereiten Sie die für das Experiment erforderlichen Instrumente vor: das Mauskissen, sterile chirurgische Instrumente wie Pinzette, Schere, Röhrchen und eine Pumpe mit einer Durchflussrate von 2-10 ml / min.</li>
		<li>Bereiten Sie die Reagenzien einschließlich des Perfusionspuffers und des Verdauungspuffers vor und machen Sie sie steril für die Hepatozytenisolierung. Frische Kollagenase Typ IV (0,10 mg/ml) und CaCl2 (0,50 m) zugeben und den Puffer bei 37 °C in einem Wasserbad vorwärmen.</li>
		<li>Bereiten Sie das bedingte Medium vor, um R-spondin 1 und alle Chemikalien- und Wachstumsfaktorbestände gemäß den Anweisungen des Herstellers herzustellen. HINWEIS: Vermeiden Sie es, das bedingte Medium und die Bestände häufig einzufrieren und aufzutauen. Bereiten Sie das Kulturmedium frisch zu und verwenden Sie es innerhalb eines Monats. Dies ist entscheidend für die Effizienz der Organoidbildung.</li>
	</ol></li>
	<li>Murine Hepatozytenisolierung durch Leberperfusion und Verdauung HINWEIS: Männliche oder weibliche Mäuse im Alter zwischen 12 Wochen und 6 Monaten wurden für die Organoidkultur verwendet. Es wurden keine offensichtlichen Unterschiede in der Effizienz der Organoidbildung gegenüber dem Alter der Spendermaus innerhalb dieses Bereichs gefunden.<ol>
<li>Euthanasieren Sie die Maus mit einer ethisch anerkannten Methode.</li>
		<li>Fixieren Sie die Maus auf dem Mauskissen und reinigen Sie das Bauchfell und die Haut mit 70% Alkohol. Legen Sie den Bauch frei und heben Sie die Leber über den Rest des Körpers. Machen Sie einen Mittellinienschnitt, um die Leber freizulegen.</li>
		<li>Füllen Sie das an der Pumpe befestigte Röhrchen mit Perfusionspuffer. Machen Sie einen Schnitt der Pfortader (etwa 1/3 des Durchmessers der Vene) und legen Sie vorsichtig einen Katheter hinein. Heben Sie die Verdauungsorgane an, um die Kanüle einzuführen. Eine Verbindung mit der Operationslinie ist optional, um ein Herausrutschen und Reißen zu vermeiden.</li>
		<li>Starten Sie die Pumpe und führen Sie die Perfusion mit einer Durchflussrate von 5-7 ml / min mit Perfusionspuffer durch. Wenn die Leber sofort blass wird, schneiden Sie die untere Hohlvene ab, damit der Perfusionspuffer durch die gesamte Leber fließen und das Blut austreiben kann.</li>
		<li>Wenn der Abfluss sauber wird, entfernen Sie die Kanüle. Es dauert ca. 5-10 Minuten.</li>
		<li>Ändern Sie den Perfusionspuffer mit einem vorgewärmten Verdauungspuffer mit einer Rate von 5 ml / min. Stoppen Sie die Pumpe nicht, bis die Leber weich wird und anschwillt. Entfernen Sie den Katheter, wenn die Leber aufhört zu schwellen. HINWEIS: Es ist sehr wichtig, die richtige Verdauungszeit einzuhalten, um eine übermäßige Verdauung zu vermeiden und einzelne Leberzellen zu erhalten.</li>
		<li>Schneiden Sie die Leber ab und legen Sie sie in eine 100 mm Platte, die mit 15 ml kaltem Waschmedium gefüllt ist. Schneiden Sie die Bänder mit einer kleinen Schere ab. Reißen Sie die Leber mit Pipettenspitzen oder Pinzette in Stücke.</li>
		<li>Vorsichtig auf und ab pipettieren, um die Zellen freizusetzen, bis der Puffer mit Zellen gesättigt ist (12-15 mal). Gießen Sie die Zellsuspension durch 70 μm-Filter in ein 50-ml-Röhrchen.</li>
		<li>Zentrifuge für 1-3 Minuten bei 50 x g und 4 °C. Dekantieren Sie den Überstand. Optional werden die Zellen mit Waschmedium resuspendiert oder die Zellen direkt mit Kulturmedium resuspendiert. Zählen Sie die Zellen mit einem Hämacytometer.</li>
		<li>Unterscheiden Sie lebende oder abgestorbene Zellen durch die Zellzählmaschine nach der Färbung lebender Zellfarbstoffe. HINWEIS: Es ist am besten, Hepatozyten mit kaltem 40% Percoll zu reinigen. Nach diesem Schritt befinden sich lebensfähige Hepatozyten am Boden der Röhrchen.</li>
	</ol></li>
	<li>Organoidkultur und -passage<ol>
<li>Entfernen Sie den Überstand und resuspenieren Sie die Hepatozyten mit einer Mischung aus extrazellulärer Matrix und Kulturmedium im Verhältnis 3: 1. HINWEIS: 10.000-20.000 Zellen in einer 50-60 μL-Mischung pro Vertiefung für eine 24-Well-Platte werden empfohlen. Es ist wichtig, schnell zu arbeiten und die Mischung während des gesamten Prozesses auf Eis zu halten. In dieser Konzentration konnten 200-500 Organoide gebildet werden.</li>
		<li>Fügen Sie den Zell- / Mischungstropfen mit kleinen Tröpfchen auf die Platte hinzu, um zu verhindern, dass sich das Tröpfchen miteinander verbindet. Inkubieren Sie die Platte im Zellinkubator bei 37 °C, 5% CO2 für 5-10 min und nehmen Sie die Platte dann für 20-25 min heraus, bis die extrazelluläre Matrix fest wird.</li>
		<li>Kulturmedium (500 μL pro Vertiefung für eine 24-Well-Platte) in die Vertiefungen geben und die Platte zur Organoidkultur in den Inkubator zurückgeben. Wechseln Sie das Medium alle 3-4 Tage. Beobachten Sie die Organoide, bis sie groß genug sind, um durchquert zu werden. HINWEIS: Ein Durchmesser mit etwa 400-500 μm eignet sich für die Passage von Hepatozyten-Organoiden.</li>
		<li>Isolieren Sie Organoide aus der extrazellulären Matrix mit dem detaillierten Prozess unten. Halten Sie eine Pasteurpipette aus Glas in eine Flamme, um ihre Öffnung zu verengen (um ~ 1/2). Mechanisch 5-10 Mal nach oben und unten pipettieren, um die Organoide während des Passierens in kleinere Organoide zu dissoziieren. HINWEIS: Bereiten Sie während des Passierens vorgewaschene Mikropipettenspitzen und -röhrchen mit Tip-Wash-Puffer vor, um den Verlust von Organoiden zu vermeiden, die an den Schläuchen oder Spitzen haften.</li>
	</ol></li>
</ol>2. Genetische Manipulation von murinen Hepatozyten-Organoiden
<ol><li>Einzelzellen aus Hepatozyten-Organoiden<ol>
<li>Geben Sie 500 μL Kaltwaschmittel/ Zellrückgewinnungslösung zu jeder Vertiefung hinzu. Pipettieren Sie auf und ab, um das Zell- / extrazelluläre Matrixgemisch mit einer Mikropipette zu zerstören, und übertragen Sie dann die Organoidsuspension in ein 15-ml-Zentrifugenröhrchen auf Eis. Optional drehen Sie das Röhrchen von Zeit zu Zeit auf und ab, um die Mischung gründlich aufzutauen.</li>
		<li>5 min bei 500-800 x g und 4 °C zentrifugieren und den Überstand verwerfen. Fügen Sie 1 ml Trypsinlösung zum Pellet hinzu und pipettieren Sie es zum Mischen. Bei 37 °C für 5-10 min inkubieren und dann die Verdauung durch Zugabe eines 2-fachen Volumens Waschmedium stoppen.</li>
		<li>5 min bei 800 x g und 4 °C zentrifugieren und den Überstand entsorgen. Resuspendieren Sie das Pellet mit Kulturmedium und zählen Sie die Zellen mit einem Hämacytometer.</li>
	</ol>
</li>
	<li>siRNA- oder Plasmidtransfektion HINWEIS: Kleinere Organoide mit einem Durchmesser von weniger als 50 μm oder einzelne Zellen aus Hepatozyten-Organoiden werden mit siRNA unter Verwendung von Lipofektamin oder Plasmiden unter Verwendung von Transfektionsreagenzien gemäß den Anweisungen des Herstellers transfiziert.<ol>
<li>Mischen Sie siRNA oder Plasmide mit Transfektionsreagenz. Einzelne Zellen aus Organoiden und die Lipofectamin-RNA/Lipo-Plasmid-Mischung (z. B. RNAiMAX) in 1-2 Vertiefungen in der 24-Well-Platte und Zentrifuge für 1 h bei 500 x g und 32 °C geben. Nach der Zentrifugation die Platte im Inkubator für 4-5 h bei 37 °C inkubieren.</li>
		<li>Sammeln Sie die Zellen und samen Sie in extrazellulärer Matrix mit Kulturmedium in einer Konzentration von 10.000 Zellen pro Vertiefung. Ändern Sie das Medium zwei Tage nach der Transfektion in die Selektionsbedingung. Beurteilen Sie die Organoidbildungseffizienz nach 10 Tagen.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Lentivirale Infektion HINWEIS: Kleine Organoide mit einem Durchmesser von weniger als 50 μm oder einzelne Zellen aus Hepatozyten-Organoiden werden mit Lentivirus unter Verwendung von Infektionsreagenzien medium gemäß den Anweisungen des Herstellers infiziert.<ol>
<li>Mischen Sie 250 μL der Einzelzellsuspension aus dem Organoid und 250 μL virale Partikel in einem 1,5 ml Röhrchen.</li>
		<li>Das Gemisch und die Zentrifuge für 1 h bei 500 x g und 32 °C zentrifugieren. 4-5 h bei 37 °C inkubieren.</li>
		<li>Sammeln Sie die Zellen und samen Sie in extrazellulärer Matrix mit Kulturmedium. Ändern Sie das Medium zwei Tage nach der Transfektion in die Selektionsbedingung. Beurteilen Sie die Organoidbildungseffizienz nach 10 Tagen.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Gentechnik von CRISPR/Cas9 HINWEIS: Wir stellen ein Video zu dieser Aufführung in den ergänzenden Materialien zur Verfügung. Einzelne Zellen von Organoiden wurden mit Lentivirus infiziert oder durch Plasmide transfiziert, die sgRNA und Cas9 trugen.<ol>
<li>Verdauen Sie einzelne Zellen aus Hepatozyten-Organoiden, die nach der oben genannten Methode kultiviert und durchlaufen werden.</li>
		<li>Infizieren Sie einzelne Zellen mit sgRNA unter Verwendung von Opti-MEM-Medium und Infektionsreagenzien gemäß den Anweisungen des Herstellers.</li>
		<li>Mischen Sie 250 μL einer Einzelzellsuspension und 250 μL virale Partikel in einem 1,5 ml Röhrchen zusammen.</li>
		<li>Zentrifugieren Sie die 500 μL-Mischung für 1 h bei 500 x g und 32 °C und inkubieren Sie dann für 4-5 h bei 37 °C.</li>
		<li>Sammeln Sie die Zellsuspension und den Samen in extrazellulärer Matrix. Beurteilen Sie die Organoidbildungseffizienz nach 10 Tagen.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

<ol><li>Lancaster, M. A., Knoblich, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Organogenesis+in+a+dish%3A+modeling+development+and+disease+using+organoid+technologies%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Organogenesis in a dish: modeling development and disease using organoid technologies.</a> Science. 345 (6194), 124-125 (2014).</li>
<li>Sasai, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Next-generation+regenerative+medicine%3A+organogenesis+from+stem+cells+in+3D+culture%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Next-generation regenerative medicine: organogenesis from stem cells in 3D culture.</a> Cell Stem Cell. 12 (5), 520-530 (2013).</li>
<li>Sato, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single+Lgr5+stem+cells+build+crypt-villus+structures+in+vitro+without+a+mesenchymal+niche%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Single Lgr5 stem cells build crypt-villus structures in vitro without a mesenchymal niche.</a> Nature. 459 (7244), 262-265 (2009).</li>
<li>Paola, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Individual+brain+organoids+reproducibly+form+cell+diversity+of+the+human+cerebral+cortex%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Individual brain organoids reproducibly form cell diversity of the human cerebral cortex.</a> Nature. 570, 523-527 (2019).</li>
<li>Atsuhiro, T., Ryuichi, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Higher-Order+Kidney+Organogenesis+from+Pluripotent+Stem+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Higher-Order Kidney Organogenesis from Pluripotent Stem Cells.</a> Cell Stem Cell. 21 (6), 730-746 (2017).</li>
<li>Huch, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+expansion+of+single+Lgr5%2B+liver+stem+cells+induced+by+Wnt-driven+regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">In vitro expansion of single Lgr5+ liver stem cells induced by Wnt-driven regeneration.</a> Nature. 494 (7436), 247-250 (2013).</li>
<li>Wang, D. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long-Term+Expansion+of+Pancreatic+Islet+Organoids+from+Resident+Procr+%2B+Progenitors%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Long-Term Expansion of Pancreatic Islet Organoids from Resident Procr + Progenitors.</a> Cell. 180 (6), 1198-1211 (2020).</li>
<li>Jarno, D., Hans, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Organoids+in+cancer+research%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Cancer%22%5BJournal%5D)">Organoids in cancer research.</a> Nature Reviews Cancer. 18, 407-418 (2018).</li>
<li>Hans, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modeling+Development+and+Disease+with+Organoids%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Modeling Development and Disease with Organoids.</a> Cell. 165 (7), 1586-1597 (2016).</li>
<li>Forbes, S. J., Newsome, P. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Liver+regeneration-mechanisms+and+models+to+clinical+application%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Gastroenterol+Hepatol%22%5BJournal%5D)">Liver regeneration-mechanisms and models to clinical application.</a> Nat Rev Gastroenterol Hepatol. 13 (8), 473-485 (2016).</li>
<li>Zhang, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+Vitro+Expansion+of+Primary+Human+Hepatocytes+with+Efficient+Liver+Repopulation+Capacity%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">In Vitro Expansion of Primary Human Hepatocytes with Efficient Liver Repopulation Capacity.</a> Cell Stem Cell. 23 (6), 806-819 (2018).</li>
<li>Katsuda, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Conversion+of+Terminally+Committed+Hepatocytes+to+Culturable+Bipotent+Progenitor+Cells+with+Regenerative+Capacity%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Conversion of Terminally Committed Hepatocytes to Culturable Bipotent Progenitor Cells with Regenerative Capacity.</a> Cell Stem Cell. 20 (1), 41-55 (2017).</li>
<li>Hu, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long-Term+Expansion+of+Functional+Mouse+and+Human+Hepatocytes+as+3D+Organoids%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Long-Term Expansion of Functional Mouse and Human Hepatocytes as 3D Organoids.</a> Cell. 175 (6), 1591-1606 (2018).</li>
<li>Peng, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inflammatory+Cytokine+TNFalpha+Promotes+the+Long-Term+Expansion+of+Primary+Hepatocytes+in+3D+Culture%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Inflammatory Cytokine TNFalpha Promotes the Long-Term Expansion of Primary Hepatocytes in 3D Culture.</a> Cell. 175 (6), 1607-1619 (2018).</li>
<li>Xiang, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long-term+functional+maintenance+of+primary+human+hepatocytes+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Long-term functional maintenance of primary human hepatocytes in vitro.</a> Science. 364 (6438), 399-402 (2019).</li>
<li>Huch, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long-term+culture+of+genome-stable+bipotent+stem+cells+from+adult+human+liver%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Long-term culture of genome-stable bipotent stem cells from adult human liver.</a> Cell. 160 (1-2), 299-312 (2015).</li>
<li>Broutier, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Culture+and+establishment+of+self-renewing+human+and+mouse+adult+liver+and+pancreas+3D+organoids+and+their+genetic+manipulation%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocol%22%5BJournal%5D)">Culture and establishment of self-renewing human and mouse adult liver and pancreas 3D organoids and their genetic manipulation.</a> Nature Protocol. 11 (9), 1724-1743 (2016).</li>
</ol>

Die Autoren offenbaren keine Konflikte.

Die Fähigkeit, reife Hepatozyten über lange Zeiträume zu kultivieren, ist von grundlegender Bedeutung für das Studium der Lebergrundforschung, der Arzneimitteltoxikologie und der hepatotropen Wirtsmikrobiologie-Infektionen wie Malaria und Hepatitis-Viren. Mit einer klar definierten Nische richtet das Protokoll hier ein Kultursystem für Hepatozyten ein. Dieses Protokoll treibt reife Hepatozyten dazu, sich in 3D-Kultur mit einer Heterogenität auszudehnen, die die Zell-Zell-Interaktion, die meisten Hepatozytenfunktionen und...

Organoide sind selbstorganisierte, dreidimensionale (3D) In-vitro-Cluster, die selbsterneuernde Stammzellen und mehrliniendifferenzierte Zellen umfassen1,2. Die Organoide vieler Organe wurden entweder aus pluripotenten oder adulten Stammzellen durch genau definierte Nischenfaktoren wie Darm, Gehirn, Dickdarm, Niere, Leber, Bauchspeicheldrüse, Schilddrüse, Magen, Haut und Lunge hergestellt3,4,5,6,7 . Die Organoide rekapitulieren physikalische Zellfunktionen, indem sie entweder die Entwicklung (entstanden aus embryonalen oder induzierten pluripotenten Stammzellen, PSCs) oder die Homöostase/Regenerationsprogression (entstanden aus adulten Stammzellen, ASCs) nachahmen, was neue Wege in der Krankheitsforschung und -therapie eröffnet8,9.
Als größtes Organ bei Säugetieren ist die Leber vor allem für die Speicherung, den Stoffwechsel und die Entgiftung verantwortlich. Zwei Arten von Epithelzelltypen, Hepatozyten und Cholangiozyten, konstruieren die Grundeinheit eines Leberläppchens. Hepatozyten sind für 70-80% der Leberfunktion verantwortlich10. Obwohl die Leber eine bemerkenswerte Regenerationsfähigkeit aufweist, kommt es während der traditionellen Monolayer-Kultivierung durch dysregulierte Zellpolarisation und -dedifferenzierung zu einem schnellen Verlust von Hepatozytenmerkmalen, was die Notwendigkeit von Forschern und Klinikern erhöht, "lückenüberbrückende" Lebermodelle in einer Schale zu erstellen. Bis vor kurzem waren die Ex-vivo-Expansionsmodelle von primären Hepatozyten jedoch nicht gut etabliert11,12,13,14,15. Leberorganoide können aus embryonalen/induzierten pluripotenten Stammzellen, Fibroblastenumwandlung in hepatozytenähnliche Zellen und gewebeabgeleiteten Zellen hergestellt werden. Die Entwicklung von Leberorganoiden fördert die Anwendung eines In-vitro-Modells für Arzneimittelscreenings und Lebertoxizitätstests16,17.
Hier beschreiben wir ein detailliertes Protokoll zur Etablierung von Leberorganoiden aus murinen primären Hepatozyten. Mit diesem Protokoll haben wir ein In-vitro-Kultursystem aus Hepatozyten-Organoiden mit zwei Kollagenase-Perfusionen aufgebaut. Diese Organoide können für eine langfristige Expansion für Monate durchquert werden. Ihre physiologische Funktion ist sehr konsistent mit Hepatozyten. Darüber hinaus bieten wir auch eine detaillierte Beschreibung der Durchführung von Genmanipulationen, wie Lentivirus-Infektion, siRNA-Transduktion und CRISPR-Cas9-Engineering mit Organoiden. Die Vermehrung von Hepatozyten-Organoiden beleuchtet die Möglichkeit, Organoide zu verwenden, um die Leberbiologie zu verstehen und personalisierte und translationale medizinische Ansätze zu entwickeln.

<table><tbody><tr><td>Perfusionspuffer</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>EGTA</td><td>Sangon Bitech</td><td>A600077-0100</td><td>3,50 g/L</td></tr><tr><td>Glukose</td><td>Sangon Bitech</td><td>A100188-0500</td><td>9,00 g/L</td></tr><tr><td>KCl</td><td>Sangon Bitech</td><td>A100395-0500</td><td>4,00 g/L</td></tr><tr><td>Na2HPO4&middot; 12H2O</td><td>Sangon Bitech</td><td>A501727-0500</td><td>1,51 g/L</td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Sangon Bitech</td><td>A501218-0001</td><td>80,0 g/L</td></tr><tr><td>NaH2PO4&middot; 2H2O</td><td>Sangon Bitech</td><td>A610404-0500</td><td>0,78 g/L</td></tr><tr><td>NaHCO3</td><td>Sangon Bitech</td><td>A500873-0500</td><td>3,50 g/L</td></tr><tr><td>Phenolrot</td><td>Sangon Bitech</td><td>A100882-0025</td><td>0,06 g/L</td></tr><tr><td>Aufschlusspuffer</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>CaCl2</td><td>Sangon Bitech</td><td>A501330-0005</td><td>0,50 M</td></tr><tr><td>Kollagenase IV</td><td>Sigma</td><td>C1639</td><td>0,10 mg/ml</td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sangon Bitech</td><td>C621110-0010</td><td>23,80 g/L</td></tr><tr><td>KCl</td><td>Sangon Bitech</td><td>A100395-0500</td><td>4,00 g/L</td></tr><tr><td>Na2HPO4&middot; 12H2O</td><td>Sangon Bitech</td><td>A501727-0500</td><td>1,51 g/L</td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Sangon Bitech</td><td>A501218-0001</td><td>80,0 g/L</td></tr><tr><td>NaH2PO4&middot; 2H2O</td><td>Sangon Bitech</td><td>A610404-0500</td><td>0,78 g/L</td></tr><tr><td>NaHCO3</td><td>Sangon Bitech</td><td>A500873-0500</td><td>3,50 g/L</td></tr><tr><td>Tip-wash Buffer</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Fötales Rinderserum</td><td>Gibco</td><td>10091148</td><td>gelagert bei 4 &de; C</td></tr><tr><td>DPBS</td><td>Gibco</td><td>C14190500BT0</td><td>bei 4 Grad gelagert; C</td></tr><tr><td>Wash Medium</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Advanced DMEM/F12</td><td>Invitrogen</td><td>12634-010</td><td>gelagert bei 4 > C</td></tr><tr><td>GlutaMAX</td><td>Gibco</td><td>35050-061</td><td>100 x</td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Gibco</td><td>15630-080</td><td>100 x</td></tr><tr><td>Penicillin/Streptomycin</td><td>Sangon Bitech</td><td>&nbsp; A600135-0025</td><td>100 X</td></tr><tr><td>Culture Medium</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>A83-01</td><td>Tocris</td><td>2939</td><td>Bestandskonzentration 500 & micro; M, final Konzentration 2 &Mikro; M</td></tr><tr><td>Advanced DMEM/F12</td><td>Invitrogen</td><td>12634-010</td><td>gelagert bei 4 > C</td></tr><tr><td>B-27 Supplement 50x, minus Vitamin A</td><td>Gibco</td><td>1704-044</td><td>50 X</td></tr><tr><td>Chir 99021</td><td>Tocris</td><td>4423</td><td>Stammkonzentration 30 mM, end Konzentration 3 &micro; M</td></tr><tr><td>DMEM/F12</td><td>Gibco</td><td>11330032</td><td>bei 4 Grad gelagert; C</td></tr><tr><td>Gastrin I</td><td>Tocris</td><td>3006</td><td>Stammkonzentration 100 mM, End Konzentration 10 nM</td></tr><tr><td>GlutaMAX</td><td>Gibco</td><td>35050-061</td><td>100 X</td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Gibco</td><td>15630-080</td><td>100 X</td></tr><tr><td>Matrigel martix</td><td>BD</td><td>356231</td><td>gelagert bei -20 &deg; C</td></tr><tr><td>N-Acetylcystein</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A9165</td><td>Stammkonzentration 500 mM, End Konzentration 1 mM</td></tr><tr><td>Nictinamid</td><td>Sigma Aldrich</td><td>N0636</td><td>Stammkonzentration 1 M, Endkonzentration 3 mM</td></tr><tr><td>Penicillin/Streptomycin</td><td>Sangon Bitech</td><td>&nbsp; A600135-0025</td><td>100 X</td></tr><tr><td>Rekombinant humaner EGF</td><td>Peprotech</td><td>AF-100-15</td><td>Stammkonzentration 100 & Mikro; g/ml, Endkonzentration 50 ng/ml</td></tr><tr><td>Rekombinant human FGF10</td><td>Peprotech</td><td>100-26</td><td>Stammkonzentration 100 & Mikro; g/ml, Endkonzentration 100 ng/ml</td></tr><tr><td>Rekombinant human HGF</td><td>Peprotech</td><td>100-39</td><td>Stammkonzentration 100 & Mikro; g/ml, Endkonzentration 25 ng/ml</td></tr><tr><td>Rekombinantes humanes TGF-& alpha;</td><td>Peprotech</td><td>100-16A</td><td>Lagerkonzentration 100 & Mikro; g/ml, Endkonzentration 100 ng/ml</td></tr><tr><td>Rekombinantes humanes TNF-& alpha;</td><td>Origene</td><td>TP750007-1000</td><td>Stammkonzentration 100 & Mikro; g/ml, Endkonzentration 100 ng/ml</td></tr><tr><td>Rho-Kinase-Inhibitor Y-27632</td><td>Abmole Bioscience</td><td>Y-27632 Dihydrochlorid</td><td>Stammkonzentration 10 mM, Endkonzentration 10 & Mikro; M</td></tr><tr><td>Rspondin-1-konditioniertes Medium</td><td></td><td></td><td>Stabile Zelllinie, die im Hu-Labor erzeugt wurde. Endkonzentration 15%.</td></tr><tr><td><stark>Andere</stark></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>0,22 & Mikro; m Filter</td><td>Millipore</td><td>SCGPT01RE 16</td><td></td></tr><tr><td># Silikonschlauch</td><td>LangerPump</td><td></td><td></td></tr><tr><td>24 Well, Suspension</td><td>Greiner bio-one</td><td>GN662102-100EA</td><td></td></tr><tr><td>37 &deg; C Wasserbad</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>70 & Mikro; m Filter</td><td>BD</td><td>352350</td><td></td></tr><tr><td>Accutase Stammzelle</td><td></td><td>AT-104</td><td>gelagert bei 4 &deg; C</td></tr><tr><td>Anti-CTNNB1</td><td>BD</td><td>610154</td><td>Maus</td></tr><tr><td>Anti-GAPDH</td><td>CST</td><td>5174S</td><td>Kaninchen</td></tr><tr><td>Anti-HDAC7</td><td>Abcam</td><td>ab50212</td><td>Maus</td></tr><tr><td>Anti-KI67</td><td>Abcam</td><td>ab15580</td><td>Kaninchen</td></tr><tr><td>Biologische Sicherheitswerkbank</td><td>ESCO</td><td>CCL-170B-8</td><td></td></tr><tr><td>Zellrückgewinnungslösung</td><td>Corning</td><td>354253</td><td>gelagert bei 4 & Grad; C</td></tr><tr><td>Zentrifuge 5430</td><td>eppendorf</td><td>542700097</td><td></td></tr><tr><td>CO2 Inkubator</td><td>ESCO</td><td>AC2-4S1</td><td></td></tr><tr><td>DMSO</td><td>Sangon Bitech</td><td>&nbsp; A100231</td><td>gelagert bei RT</td></tr><tr><td>EVOS FL Color Imaging Systems</td><td>Invitrogen</td><td>AME4300</td><td></td></tr><tr><td>Hdac3 siRNA</td><td>Guangzhou RiboBio Co., Ltd.</td><td>siG2003180909192555</td><td>bei -20 Grad gelagert; C</td></tr><tr><td>Hdac7 Lentivirus</td><td>ShanghaiGenePharmaCo.,Ltd</td><td>LV2020-2364</td><td>gelagert bei -80 &deg; C</td></tr><tr><td>Hitrans G A</td><td>Shanghai Genechem Co.,Ltd.</td><td>REVG004</td><td>Erhöhte Effizienz bei Virusinfektionen</td></tr><tr><td>Image Pro Plus Software</td><td>Media Cybernetics, Bethesda, MD, USA</td><td>Version 6.0</td><td></td></tr><tr><td>Lipofectamin RNAiMAX Transfektionsreagenz</td><td>Invitrogen</td><td>13778150</td><td>Erhöhte Effizienz bei Virusinfektionen</td></tr><tr><td>Lebendzellfarbstoff</td><td>Luna</td><td>F23001</td><td>gelagert bei 4 &deg; C</td></tr><tr><td>Desktop-Zentrifugensteuerung mit niedriger Geschwindigkeit</td><td></td><td>TD5A-WS/TD5AWS</td><td></td></tr><tr><td>Nukleofaktor-& Alpha-Gerät</td><td>Lonza</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Opti-MEM</td><td>Gibco</td><td>31985070</td><td>bei 4 &/Grad gelagert; C</td></tr><tr><td>Pasteurpipette</td><td>Sangon Bitech</td><td>F621006-0001</td><td></td></tr><tr><td>Schlauchpumpe</td><td>LangerPump</td><td>BT100-2J</td><td></td></tr><tr><td>PVDF-Membran</td><td>Millipore</td><td>IPVH00010</td><td>Aktivieren mit Methanol</td></tr><tr><td>PX458</td><td>Addgene</td><td>48138</td><td>gelagert bei -80 &deg; C</td></tr><tr><td>Kühlzentrifuge</td><td>Thermo Scientific Heraeus</td><td>Labofuge 400</td><td></td></tr><tr><td>RSL3</td><td>MCE</td><td>HY-100218A</td><td>Stammkonzentration 10 mM, Endkonzentration 4 & Mikro; M</td></tr><tr><td>Trypsin/EDTA</td><td>Gibico</td><td>25200072</td><td>gelagert bei 4 > Verifizierter</td></tr><tr>Lieferant - C<td>Wee1 siRNA</td><td>Guangzhou RiboBio Co., Ltd.</td><td>siG2003180909205971</td><td>bei -20 Grad gelagert; C</td></tr></tbody></table>

etablierung und genetische manipulation von murinen hepatozyten-organoiden

Establishment and Genetic Manipulation of Murine Hepatocyte Organoids

Die Leber ist das größte Organ bei Säugetieren. Es spielt eine wichtige Rolle bei der Glukosespeicherung, der Proteinsekretion, dem Stoffwechsel und der Entgiftung. Als Vollstrecker für die meisten Leberfunktionen haben primäre Hepatozyten eine begrenzte Proliferationskapazität. Dies erfordert die Etablierung von ex vivo Hepatozytenexpansionsmodellen für die leberphysiologische und pathologische Forschung. Hier isolierten wir murine Hepatozyten durch zwei Schritte der Kollagenase-Perfusion und etablierten eine 3D-Organoidkultur als "Mini-Leber", um Zell-Zell-Interaktionen und physikalische Funktionen zu rekapitulieren. Die Organoide bestehen aus heterogenen Zellpopulationen, einschließlich Vorläufern und reifen Hepatozyten. Wir stellen den Prozess im Detail vor, um die murinen Hepatozyten oder fetalen Hepatozyten zu isolieren und zu kultivieren, um innerhalb von 2-3 Wochen Organoide zu bilden und zu zeigen, wie man sie durch mechanisches Pipettieren auf und ab durchläuft. Darüber hinaus werden wir auch vorstellen, wie die Organoide in einzelne Zellen für die Lentivirus-Infektion der shRNA / ektopischen Konstruktion, die siRNA-Transfektion und das CRISPR-Cas9-Engineering verdaut werden können. Die Organoide können für Drogenscreenings, Krankheitsmodellierung und grundlegende Leberforschung verwendet werden, indem Leberbiologie und Pathobiologie modelliert werden.

Die Hepatozyten-Organoide von weiblichen Alb-Cre; Rosa26-GFP-Maus (8 Wochen) wurde fünf Tage nach der Aussaat beobachtet (Abbildung 1A). Die Organoide vermehren sich mit Ki67-positiver Färbung (Abbildung 1B). Die interferierende Expression repräsentativer Gene in Hepatozyten-Organoiden entweder durch siRNA-Transfektion oder Lentivirus-Infektion wurde mittels qRT-PCR und Western Blot untersucht. Die Ergebnisse sind in den Abbildungen 2A</stro...

Aus Maushepatozyten wurde ein langfristiges Ex-vitro-3D-Organoidkultursystem etabliert. Diese Organoide können durch Lentivirus-Infektion der shRNA /ektopischen Konstruktion, siRNA-Transfektion und CRISPR-Cas9-Engineering durchpasst und genetisch manipuliert werden.

Etablierung und genetische Manipulation von murinen Hepatozyten-Organoiden

The liver is the largest organ in mammals. It plays an important role in glucose storage, protein secretion, metabolism and detoxification. As the ...

Die Leber ist das größte Organ bei Säugetieren. Es spielt eine sehr wichtige Rolle im Stoffwechsel und bei der Entgiftung. Obwohl die Leber in vitro über eine bemerkenswerte Regenerationsfähigkeit verfügt, ist es langfristig immer noch eine sehr große Herausforderung, Hepatozyten in vitro zu kultivieren.Hier etablieren wir die Hepatozyten-Organoide aus reifen Hepatozyten. Es behält die Hauptmerkmale von Hepatozyten in Morphologie und Funktion bei. In diesem Video werden wir vorstellen, wie man diese Organoide kultiviert und durchquert und wie man die genetische Veränderung dieser Organoide im Detail durchführt.Erstens, Leberdurchblutung und Verdauung. Bereiten Sie alle Regionen und Instrumente vor und machen Sie sie steril. Waschen Sie die Maus und öffnen Sie den Epidermis und die Haut, und versuchen Sie dann, den Beutelofen der Leber zu finden.Injizieren Sie die Nadeln hinein und fangen Sie dies dann ein. Machen Sie die Durchblutung mit einer Geschwindigkeit von fünf Millilitern pro Minute, bis die Leber blass wird. Wechseln Sie sie in den Perfusionspuffer, legen Sie sie sorgfältig auf, beobachten Sie die Leber, bis sie weich wird.Normalerweise dauert es drei bis fünf Minuten, dan

establishment-and-genetic-manipulation-of-murine-hepatocyte-organoids

Research

Forschung

JoVE Journal

Biology

Biologie

Dieses Protokoll beschreibt die Herstellung einer Maus extrahepatische Gallenwege 3-dimensionale organoide Systems. Diese biliären Organellen können in Kultur Cholangiocyte Biologie gepflegt werden. Biliären Organellen express Marker der Stammvater und biliären Zellen und polarisierten epithelialen Zellen zusammengesetzt sind.

Generation von Organellen von Maus extrahepatische Gallenwege

Dieses Protokoll bietet detaillierte Anweisungen zur Etablierung von murinen Dünndarmorganoiden, zur Isolierung angeborener Lymphzellen des Typs 1 aus der murinen Dünndarmlamina propria und zur Etablierung von 3-dimensionalen (3D) Kokulturen zwischen beiden Zelltypen, um bidirektionale Wechselwirkungen zwischen Darmepithelzellen und angeborenen lymphatischen Typ-1-Zellen zu untersuchen.

Kokultur von murinen Dünndarm-Epithelorganoiden mit angeborenen lymphatischen Zellen

Dieses Protokoll beschreibt die Erzeugung von schnellen und reproduzierbaren endodermalen Leberorganoiden (eHEPOs). Mit diesem Protokoll können eHEPOs innerhalb von 2 Wochen hergestellt werden und langfristig (mehr als 1 Jahr) expandieren, ohne ihre Differenzierung und Funktionalität zu verlieren.

Erzeugung von funktionellen endodermalen Leberorganoiden

Dieses Protokoll beschreibt, wie Tränendrüsenorganoide, die aus primärem Maus- und menschlichem Gewebe gewonnen werden, hergestellt, erhalten, genetisch verändert, differenziert, funktionell charakterisiert und transplantiert werden.

Etablierung, Erhaltung, Differenzierung, genetische Manipulation und Transplantation von Tränendrüsenorganoiden von Mäusen und Menschen

Organoide revolutionieren die personalisierte Gewebemodellierung für die Organentwicklung, Wirkstoffforschung und Krankheitsforschung. Die Organoid-Technik schreitet voran und führt zur Herstellung komplizierter synthetischer Gewebe. Ziel ist es, Morphogenese, Assembloid-Technologie und Biomatrizen zu integrieren, um das Tissue Engineering voranzutreiben. Dieses Protokoll hilft bei der Modellierung der Leberorganogenese und der Festlegung von Richtlinien für den Aufbau synthetischer Gewebe.

In-vitro-Kultivierungstechniken zur Modellierung der Leberorganogenese, zum Aufbau von Assembloiden und zum Design synthetischer Gewebe unter Verwendung menschlicher Zelllinien

Organoide, die aus Patiententumoren erzeugt werden, werden orthotopisch in die Leber der Maus injiziert. Die Resektion von nicht-tumorösem Lebergewebe führt zu einer regenerativen Umgebung im Lebergewebe, in dem sich der Tumor befindet.

Ein von Patienten mit hepatozellulärem Krebs abgeleitetes Organoid-Xenotransplantat-Modell zur Untersuchung des Einflusses der Leberregeneration auf das Tumorwachstum

Dieses Protokoll stellt eine optimierte zweistufige Kollagenase-Leberperfusionstechnik in einem Rattenmodell vor und zeigt die Verwendung von isolierten Hepatozyten für die in vitro Langzeitkultur von 3D-Organoiden.

Perfusion der Rattenleber und Isolierung primärer Hepatozyten: ein altes Verfahren, das für die hochmoderne 3D-Organoidkultur entscheidend ist

Wir beschreiben konfokale Bildgebungs- und Tracking-Pipelines, die auf zwei Reporterstrategien angewandt werden: Mosaikorganoide zur Auflösung einzelner Zellverhalten und Schicksalsreporter-Organoide zur Überwachung von Zelltypübergängen in menschlichen und murinen Darmorganoiden.

Live-Zell-Bildgebung und Einzelzell-Tracking zur Überwachung der klonalen Dynamik und Schicksalsübergänge in menschlichen und murinen Darmorganoiden

Dieses Video zeigt neue Kultur, eine Methode, durch die Hühnerembryonen außerhalb der Eizelle bis zu 24 h kultiviert. Diese Methode ermöglicht ein bis frühen Entwicklung (Primitivstreifens bis 14 som.), Ein Zeitraum entsprechend E7-9 in der Maus zu studieren. Anwendungen dieser Technik sind die Elektroporation, in situ Hybridisierung und Immunhistochemie.

Method for Culture of Early Hühnerembryonen ex vivo (New Culture)

Dieses Video zeigt 2-Farben-whole mount in situ Hybridisierung, eine Methode, durch die die räumliche und zeitliche Expressionsmuster von 2 unterschiedlichen Genen visualisiert werden bei jungen Hühnerembryonen kann. Diese Methode wurde ursprünglich von David Wilkinson, Domingos Henrique, Phil Ingham und David Ish-Horowicz eingeführt.

Doppel Whole Mount in situ Hybridisierung von Anfang Hühnerembryonen

Erfahren Sie die Etablierung und genetische Manipulation muriner Hepatozyten-Organoide mittels Lentivirus-Infektion, siRNA-Transfektion und CRISPR-Cas9. Diese Methode ermöglicht Langzeitkulturen für Leberforschung.

Etablierung und genetische Manipulation von murinen Hepatozyten-Organoiden

Weitere Videos entdecken