Etablierung und genetische Manipulation von murinen Hepatozyten-Organoiden

Aus Maushepatozyten wurde ein langfristiges Ex-vitro-3D-Organoidkultursystem etabliert. Diese Organoide können durch Lentivirus-Infektion der shRNA /ektopischen Konstruktion, siRNA-Transfektion und CRISPR-Cas9-Engineering durchpasst und genetisch manipuliert werden.

Die Leber ist das größte Organ bei Säugetieren. Es spielt eine sehr wichtige Rolle im Stoffwechsel und bei der Entgiftung. Obwohl die Leber in vitro über eine bemerkenswerte Regenerationsfähigkeit verfügt, ist es langfristig immer noch eine sehr große Herausforderung, Hepatozyten in vitro zu kultivieren.

Hier etablieren wir die Hepatozyten-Organoide aus reifen Hepatozyten. Es behält die Hauptmerkmale von Hepatozyten in Morphologie und Funktion bei. In diesem Video werden wir vorstellen, wie man diese Organoide kultiviert und durchquert und wie man die genetische Veränderung dieser Organoide im Detail durchführt.

Erstens, Leberdurchblutung und Verdauung. Bereiten Sie alle Regionen und Instrumente vor und machen Sie sie steril. Waschen Sie die Maus und öffnen Sie den Epidermis und die Haut, und versuchen Sie dann, den Beutelofen der Leber zu finden.

Injizieren Sie die Nadeln hinein und fangen Sie dies dann ein. Machen Sie die Durchblutung mit einer Geschwindigkeit von fünf Millilitern pro Minute, bis die Leber blass wird. Wechseln Sie sie in den Perfusionspuffer, legen Sie sie sorgfältig auf, beobachten Sie die Leber, bis sie weich wird.

Normalerweise dauert es drei bis fünf Minuten, dann schneiden Sie die Leber und legen Sie sie in die Teller, und schneiden Sie sie in kleine Stücke mit der Schere. Peppen Sie es häufig auf und ab. Normalerweise dauert es 10 bis 15 Minuten, um sie in die einzelne Zelle zu verwandeln.

Und dann peppen Sie es mit 10 bis 15 Minuten auf und ab und füttern Sie es durch den Fitter. Machen Sie sie zu den einzelnen Zellen. Sammeln Sie alle Zellen in der 50-Milliliter-Röhre und zentrifugieren Sie sie mit der Geschwindigkeit und sammeln Sie dann alle pro Platte.

Versuchen Sie, sie immer im kalten Eis zu halten. Machen Sie die Einzelzellsuspensionen und zählen Sie sie mit dem Zellzähler. Normalerweise haben die Hepatozyten, wenn sie glücklich sind, die lebhafte Fluoreszenz.

Im zweiten Teil versuchen wir, die Zellen zu setzen und die Organoidkultur durchzuführen. Wir sammeln alle Zellsuspensionen und zählen die Zellen mit einer bestimmten Konzentrationsfusion Und dann mischen wir die. Metrogels. und das Codemedium.

Normalerweise nehmen wir mit dem Medium und den Metrogelen im Verhältnis 1 zu 2 oder 1 zu 3. Nachdem wir sie vorsichtig gemischt haben, setzen wir sie auf die Gradientenplatten. Normalerweise fügen wir 100 Mikroliter am 24-Platten-Brunnen hinzu.

Legen Sie sie bei einer Temperatur von 37 Grad in den Inkubator. Nach 20 Minuten legen wir sie rückwärts nach vorne, wobei der Boden unten und dann am Medium ist. Mit zwei oder drei Tagen Konter sehen wir normalerweise, wie die Organoide herauskommen.

Dies ist das typische Bild unserer Organoide. Wir brauchen normalerweise einzelne Zellen von Organoiden, wenn wir die Passage machen oder eine genetische Modifikationsmethode durchführen wollen Wir sammeln alle Organoide von den Gegenplatten mit dem Mantelwaschpuffer. Wir lassen den Überstand fallen, dann am Mantel Waschpuffer in den Teller, mischen sie, also peppen Sie ihn auf und ab.

Und dann waschen wir in der Regel alle Spitzen mit dem Waschbandpuffer vor. Um zu vermeiden, dass alle Organoide auf die Spitzen kippen. Und dann sammeln wir mit der, einer neuen Charge auf Eis oder ohne, alle Organoide durch Centro-Fusion.

Wir behandeln sie, es gibt einen Conning Radienten, um alle Metrogele zu entfernen. Nach 20 bis 30 Minuten Inkubation auf Eis werden alle Metrogele entfernt. Wir sammeln alle sauberen Organoide und fügen Trypsin hinzu, um sie zu einzelnen Zellen zu machen.

Nachdem Trypsin hinzugefügt wurde, behandeln wir die Organoide in den Inkubator. Es dauert 5 bis 10 Minuten, bis Leberorganoide zu Einzelzellen werden. Wir fügen weitere Waschpuffer hinzu, um das Triplatin zu stoppen.

Und dann peppen Sie es auf und ab zu ihnen. Für den Optionsprozess können Sie sie noch einmal waschen, um das gesamte Trypsin zu entfernen. Nach dem Waschen durch Centrofusion können wir sie unter der Zelltheke zählen.

Dann werden wir zeigen, wie man Transaktion oder Transfektion dieser Hepatozyten-Organoide durchführt. Beschriften Sie zuerst die Röhrchen von dem, was Sie tun werden, und dann werden wir die Sehtransfektion gemäß den Anweisungen des Herstellers durchführen. Sie brauchen, der Regent der Lipoyl-Tatsache zähmt INI MaX.

Wir fügen die hinzu. kontrollieren und das spezifische Gen siRNA, und inkubieren Sie sie mit dem Optimum, nach den Anweisungen des Herstellers. Und dann fügen wir entsprechend der Zellkonzentration das RANmax hinzu und mischen sie gründlich.

Dann fügen wir auch die RAN max mit dem Optimum separat hinzu und legen sie auf Eis. Nach 5 Minuten peppen wir eine separate RANmax-Mischung mit verschiedenen siRNAs, spezifischer Gen-RANi- und II-Kontrolle separat auf und mischen sie gründlich. Legen Sie sie wieder auf Eis, und dann sammeln wir alle Organoide, verlangsamen die Zentrfusion, lassen den gesamten Überstand fallen, wir fügen das RNAi max, die siRNA-Mischung in diese Zellplatte ein und peppen sie gründlich auf und ab.

Kurz gesagt, die Zellen und die Markierung RNAi max und siRNA-Mischung waren gentrifiziert und inkubieren für 4 bis 5 Stunden bei 37 Grad. Im letzten Teil könnten diese Hepatozyten-Organoide auch mit dem Lenti-Virus infiziert sein. Die ähnliche Nachricht wurde als siRNA-Transfektion durchgeführt.

Die Kontrolle und die siRNA-Virusröhrchen wurden gut vorbereitet, und das Optimum wurde gemäß den Anweisungen des Herstellers hinzugefügt. Dann mit den Infektionsregionen wie Polygrün und dann fügen wir verschiedene Lenti-Viren hinzu, gemäß der Anweisungen des Herstellers Konstitution. Mischen Sie die Einzelzellsuspensionen in Organoidkultur und verschiedene Partikel in den 1,5 Milliliter Eppendorfröhrchen, fügen Sie sie hinzu, mischen Sie sie, mischen Sie diese Mischung und konzentrieren Sie sie für 1 Stunde bei 32 Grad.

Die Konzentratfusion wird bei 500 G durchgeführt.Und nach 4 bis 5 Stunden Inkubation bei 37 Grad wird die Zellsuspension dann gesammelt und in Metrogel gesetzt. Und legen Sie sie wieder in den Inkubator. Das Organ auf die Formation Effizienz oder eine andere funktionelle Analyse könnte 7 bis 10 Tage später durchgeführt werden.

Hier sind unsere repräsentativen Ergebnisse. In Abbildung 1A sehen Sie unser ALB-Cre Rosa 26-GFP- oder RFP-Hepatozyten-Organoid aus der Maus. In Abbildung 1B konnten Sie das Ki67-positive Signal bei der Färbung sehen, das gezeigt hat, dass sich unsere Hepatozyten-Organoide vermehren.

In Abbildung 2A und 2B ist hier eine repräsentative Genexpression unserer interferierenden Expression unserer Gene. Nach genetischer Manipulation in Hepatozyten-Organoiden ist die interferierende Wirkung sehr effizient. Hier ist Abbildung 2C, die Sie nach genetischer Manipulation mit Carsonit-Technologie in unseren murinen Organoiden sehen konnten.

Unsere Ergebnisse zeigten, dass die Hepatozyten-Organoide in vitro expandiert und genetisch manipuliert werden konnten. Zusammenfassend zeigen wir in diesem Video, wie man die Leberperfusion und Verdauung macht, um die Hepatozyten zu bekommen. Wie man die Hepatozyten erfasst und die Hepatozyten-Organoide durchquert.

Außerdem haben wir gezeigt, wie man die siRNA- und Vektortransfektion oder Lenti-Virus-Infektion durchführt, um die Genetische dieser Organoide zu modifizieren. Außerdem haben wir zwei Engpässe in unseren Organoiden. Erstens haben wir nicht pro Kern oder Fellkern verwendet, um die Hepatozyten zu reinigen.

Und zweitens denke ich, dass mehr Wachstumsfaktoren und Signalisierung versucht werden sollten, um die Wachstumszeit der Organoide zu verbessern.