Analyse der Lebermikroumgebung während des frühen Fortschreitens des nicht-alkoholischen Fettlebererkrankung-assoziierten hepatozellulären Karzinoms im Zebrafisch

Unsere Zebrafisch-Leberkrebsmodelle und -protokolle bieten eine einzigartige Gelegenheit, die Lebermikroumgebung und die Immunlandschaft mittels intravitaler Mikroskopie in vivo und nicht-invasiv zu visualisieren. Die Transparenz der Zebrafischlarven ist zweifellos der Hauptvorteil dieses Systems, das es uns ermöglicht, nicht-invasive intravitale Mikroskopie durchzuführen und Einblicke in die Mikroumgebung und die Immunzellinfiltration eines tiefen Gewebes und Organs wie der Leber zu gewinnen. Unser ernährungsinduziertes nephrotisches Modell und die in diesem Protokoll beschriebenen bildgebenden Verfahren können leicht auf die verworrenen Zell-Zell-Interaktionen in anderen Lebererkrankungen oder Forschungsgebieten, einschließlich metabolischem Syndrom und Herz-Kreislauf-Erkrankungen, angewendet werden.

Cassia Michael, unsere Labortechnikerin, und Dr. Francisco Juan Martinez-Navarro, Postdoktorand in meinem Labor, demonstrieren das Verfahren. Wiegen Sie zunächst vier Gramm kommerzielles Trockenfutter für Zebrafischlarven in zwei 25-Milliliter-Glasbechergläser, eines für die normale Ernährung und das andere für die 10% High-Cholesterol-Diät oder HCD. Wiegen Sie 0,4 Gramm Cholesterin in einem 10-Milliliter-Glasbecher und decken Sie das Becherglas mit Folie ab.

Messen Sie in einem Abzug fünf Milliliter Diethylether mit einer 10-Milliliter-Spritze mit einer 20-Gauge-Nadel. Dann den Diethylether in das normale Diätbecherglas geben und sofort mit einem Spatel mit dem Trockenfutter vermischen. Messen Sie weitere fünf Milliliter Diethylether mit derselben Spritze und Nadel ab und geben Sie sie in das HCD-haltige Becherglas.

Sofort mischen, indem Sie mit der Spritze auf und ab saugen. Geben Sie die Cholesterinlösung schnell in das HCD-Becherglas und mischen Sie sie sofort mit einem Spatel, bis die Lösung gleichmäßig ist. Lassen Sie die Becher bis zu 24 Stunden in der Haubecher, um den Diethylether vollständig zu verdampfen.

Am nächsten Tag mahlen Sie die Diäten mit einem Stößel und Mörser zu feinen Partikeln. Jede Diät in einen kleinen, beschrifteten Plastikbeutel oder ein 50-Milliliter-Zentrifugenröhrchen geben und bei minus 20 Grad Celsius lagern. Richten Sie transgene Fischschnüre am Tag minus eins ein.

Am Tag Null sammeln Sie Eier in einem Sieb, nachdem die Fische gelaicht haben. Spülen Sie die Eier mit einer Waschflasche mit E3 gründlich aus und geben Sie sie vorsichtig in 10-Zentimeter-Petrischalen mit E3-Medium. Reinigen Sie die Platten von allen Trümmern, die sich in den Zuchtboxen angesammelt haben könnten, einschließlich toter oder unbefruchteter Eier, um das unkontrollierte Wachstum von Mikroorganismen und daraus resultierende Defekte in der Larvenentwicklung zu vermeiden.

Dann teilen Sie die Eier bei einer Dichte von 70 oder 80 Eiern pro Schale, die 25 Milliliter E3 enthält. Am ersten Tag überprüfen und reinigen Sie tote Embryonen oder Embryonen mit Entwicklungsdefekten unter einem mit einer Transilluminationsbasis ausgestatteten Sezierbereich. Am fünften Tag Larven aus allen Gerichten in einer 15 Zentimeter großen Petrischale kombinieren und E3 ohne Methylenblau hinzufügen. Teilen Sie die Larven in die Futterboxen und füttern Sie sie wie im Textmanuskript beschrieben.

Halten Sie die Larven im Zebrafischraum oder einem Brutkasten bei 28 Grad Celsius in einem Dunkellichtzyklus und füttern Sie sie zweimal täglich von Tag 5 bis Tag 12. Entfernen Sie täglich Speisereste sowie 90 bis 95% des Mediums mit einem Vakuumsystem, das an einer Ein-Milliliter-Pipettenspitze befestigt ist. Dann gießen Sie das neue E3 ohne Methylenblau vorsichtig in eine Ecke der Futterbox, um die Larven nicht zu beschädigen.

Alternativ können die Larven in Drei-Liter-Tanks mit Systemwasser aufgeteilt und als eigenständige Systemeinheit mit geringem Wasserdurchfluss platziert werden. Diese Alternative spart die Zeit, die für den täglichen Reinigungsprozess benötigt wird, und das Filtersystem hilft, die Larven bis zum Endpunkt gesund zu halten. Bereiten Sie am 13. Tag das Sammelgeschirr entsprechend der Anzahl der Versuchsbedingungen vor, die eingerichtet wurden.

Gießen Sie genug E3 ohne Methylenblau, um den Boden jeder Schale zu bedecken. Dann saugen Sie vorsichtig mit dem Vakuumsystem das Wasser aus den Fütterungsboxen ab. Wenn der Wasserstand niedrig wird, heben Sie die Futterbox langsam an, damit die Larven zu einer der Ecken schwimmen, und saugen Sie dann in die entgegengesetzte Richtung ab.

Sobald nur noch etwa 20 bis 30 Milliliter der Flüssigkeit übrig sind, dekantieren Sie die Larven vorsichtig in die vorbereitete Auffang-Petrischale und legen Sie das beschriftete Band aus der Fütterungsbox auf den Deckel der Schale. Screenen Sie die anästhesierten Larven auf einem Fluoreszenzstereomikroskop auf gewünschte Fluoreszenzmarker. Fügen Sie dann Tricain E3 in die Kammern des Verwundungs- und Einklemmgeräts hinzu.

Entfernen Sie Luftblasen aus den Kammern und dem Rückhaltekanal mit einer P-200-Mikropipette. Entfernen Sie das gesamte überschüssige Tricain E3 und lassen Sie nur genügend Volumen übrig, um die Kammern zu füllen. Als nächstes übertragen Sie eine betäubte Larve in die Ladekammer des Verwundungs- und Einklemmgeräts und positionieren sie für die Abbildung des linken Lappens mit einem Wimpernwerkzeug.

Stellen Sie sich die Morphologie aller benötigten Zellen in der Leber unter einem konfokalen Mikroskop vor, wie im Textmanuskript beschrieben. Öffnen Sie die Fidschi-Software. Öffnen Sie dann die Bilddatei und aktivieren Sie die Option Kanäle teilen auf der Registerkarte Bio-Format-Importoptionen.

Nachdem Sie Projektionen mit maximaler Intensität für jeden Kanal erstellt haben, erstellen Sie einen ROI um die Larvenleber und messen Sie den Leberbereich. Fügen Sie dann einen Maßstabsbalken als Referenz hinzu und erstellen Sie einen zweiten ROI einschließlich des Leberbereichs und 75 Mikrometer der Umgebung. Wählen Sie im Menü Plugins die Option Analysieren, gefolgt von Zellzähler und zählen Sie die Immunzellen im Rekrutierungsbereich.

Notieren Sie die Anzahl der rekrutierten Immunzellen in einer Tabelle. Berechnen Sie die Neutrophilen-, Makrophagen- und T-Zell-Dichten, indem Sie die Anzahl der Immunzellen pro Leberbereich normalisieren. HCC-Zebrafischlarven, die mit normaler Ernährung gefüttert werden, zeigen keine Lebersteatose, gemessen durch Ölrot-O-Färbung.

HCC-Larven, die mit HCD gefüttert werden, zeigen jedoch einen signifikanten Anstieg der Lebersteatose. Nach acht Tagen Exposition gegenüber einem Cholesterinüberschuss wurde bei HCC-Larven eine Lebervergrößerung beobachtet. Zur Beurteilung der Hepatomegalie wurden der Leberbereich, die Leberoberfläche und das Lebervolumen ausgewertet.

Bei nicht-alkoholischem Steatohepatitis-assoziiertem HCC waren der Hepatozytenbereich zusammen mit dem Kernbereich und das Verhältnis von Kern- zu Zytoplasma erhöht. Eine signifikante Abnahme der Kernzirkularität wurde auch in der fettreichen HCC-Gruppe beobachtet. Unter Verwendung des H2B-mCherry-Markers wurde eine größere Inzidenz von Mikrokernen in den HCC-Larven nachgewiesen, die mit HCD gefüttert wurden.

Die Untersuchung des Lebergefäßsystems zeigte eine signifikante Zunahme der Gefäßdichte bei HCC-Larven, die mit HCD gefüttert wurden. Die Infiltration von Makrophagen und Neutrophilen trat sowohl bei HCC als auch bei HCC auf, die mit HCD-Larven gefüttert wurden. Die Quantifizierung von Neutrophilen in Makrophagen in der Leber und ihrer Umgebung zeigte eine signifikante Zunahme der Anzahl und Dichte der Zellen in HCC-Larven, die mit HCD gefüttert wurden.

Im Gegensatz dazu wurde eine signifikante Abnahme der T-Zelldichte in der Gesamtzahl bei HCC-Larven beobachtet, die mit HCD gefüttert wurden. Die Reinigung der Tanks und die Fütterung sind die wichtigsten Schritte, um die Lebensfähigkeit der Larven zu gewährleisten und die Entwicklung von Steatose oder Leber und systemischen chronischen Entzündungen in den Kontrollen aufgrund schlechter Wasserqualität oder unsachgemäßer Fütterung zu vermeiden. Andere Methoden wie die Zeitraffermikroskopie und die Analyse der Interaktion zwischen den verschiedenen Zellen, die die Leber bevölkern, können durchgeführt werden.

Darüber hinaus kann eine einzellige RNA-Suche von präparierten Lebern in verschiedenen Leberkrebsstadien durchgeführt werden, um vollständig zu verstehen, wie sich die Leberimmunlandschaft mit dem Fortschreiten der Krankheit entwickelt.