Name: Analyse der Lebermikroumgebung während des frühen Fortschreitens des nicht-alkoholischen Fettlebererkrankung-assoziierten hepatozellulären Karzinoms im Zebrafisch (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-04-01T15:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 27 s
Description: Erfahren Sie, wie Sie die Lebermikroumgebung und Immunzellinfiltration bei NASH-assoziiertem hepatozellulärem Karzinom in Danio rerio untersuchen. Dieses Protokoll nutzt nicht-invasive intravitalmikroskopische Bildgebung.

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Der Autor möchte den Technikern des Albert Einstein College of Medicine Zebrafish Core Facility, Clinton DePaolo, und Spartak Kalinin für die Unterstützung und Wartung unserer Zebrafischlinien danken. FJMN wird vom Cancer Research Institute und der Fibrolamellar Cancer Foundation unterstützt.

<ol><li>Pocha, C., Kolly, P., Dufour, J. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nonalcoholic+Fatty+Liver+Disease-Related+Hepatocellular+Carcinoma%3A+A+Problem+of+Growing+Magnitude%5BTitle%5D)+AND+%22Seminals+in+Liver+Disease%22%5BJournal%5D)">Nonalcoholic Fatty Liver Disease-Related Hepatocellular Carcinoma: A Problem of Growing Magnitude.</a> Seminals in Liver Disease. 35 (3), 304-317 (2015).</li>
<li>El-Serag, H. B., Kanwal, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epidemiology+of+hepatocellular+carcinoma+in+the+United+States%3A+where+are+we%3F+Where+do+we+go%5BTitle%5D)+AND+%22Hepatology%22%5BJournal%5D)">Epidemiology of hepatocellular carcinoma in the United States: where are we? Where do we go.</a> Hepatology. 60 (5), 1767-1775 (2014).</li>
<li>Estes, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modeling+NAFLD+disease+burden+in+China%2C+France%2C+Germany%2C+Italy%2C+Japan%2C+Spain%2C+United+Kingdom%2C+and+United+States+for+the+period+2016-2030%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Hepatology%22%5BJournal%5D)">Modeling NAFLD disease burden in China, France, Germany, Italy, Japan, Spain, United Kingdom, and United States for the period 2016-2030.</a> Journal of Hepatology. 69 (4), 896-904 (2018).</li>
<li>Estes, C., Razavi, H., Loomba, R., Younossi, Z., Sanyal, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modeling+the+epidemic+of+nonalcoholic+fatty+liver+disease+demonstrates+an+exponential+increase+in+burden+of+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Hepatology%22%5BJournal%5D)">Modeling the epidemic of nonalcoholic fatty liver disease demonstrates an exponential increase in burden of disease.</a> Hepatology. 67 (1), 123-133 (2018).</li>
<li>Meli, R., Mattace Raso, G., Calignano, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+of+innate+immune+response+in+non-alcoholic+Fatty+liver+disease%3A+metabolic+complications+and+therapeutic+tools%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Immunology%22%5BJournal%5D)">Role of innate immune response in non-alcoholic Fatty liver disease: metabolic complications and therapeutic tools.</a> Frontiers in Immunology. 5, 177(2014).</li>
<li>Ganz, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Progression+of+non-alcoholic+steatosis+to+steatohepatitis+and+fibrosis+parallels+cumulative+accumulation+of+danger+signals+that+promote+inflammation+and+liver+tumors+in+a+high+fat-cholesterol-sugar+diet+model+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Translational+Medicine%22%5BJournal%5D)">Progression of non-alcoholic steatosis to steatohepatitis and fibrosis parallels cumulative accumulation of danger signals that promote inflammation and liver tumors in a high fat-cholesterol-sugar diet model in mice.</a> Journal of Translational Medicine. 13, 193(2015).</li>
<li>Ma, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((NAFLD+causes+selective+CD4%28%2B%29+T+lymphocyte+loss+and+promotes+hepatocarcinogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">NAFLD causes selective CD4(+) T lymphocyte loss and promotes hepatocarcinogenesis.</a> Nature. 531 (7593), 253-257 (2016).</li>
<li>Reimer, K. C., Wree, A., Roderburg, C., Tacke, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((New+drugs+for+NAFLD%3A+lessons+from+basic+models+to+the+clinic%5BTitle%5D)+AND+%22Hepatology+International%22%5BJournal%5D)">New drugs for NAFLD: lessons from basic models to the clinic.</a> Hepatology International. 14 (1), 8-23 (2020).</li>
<li>Wrighton, P. J., Oderberg, I. M., Goessling, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((There+is+something+fishy+about+liver+cancer%3A+Zebrafish+models+of+hepatocellular+carcinoma%5BTitle%5D)+AND+%22Cellular+and+Molecular+Gastroenterology+and+Hepatology%22%5BJournal%5D)">There is something fishy about liver cancer: Zebrafish models of hepatocellular carcinoma.</a> Cellular and Molecular Gastroenterology and Hepatology. 8 (3), 347-363 (2019).</li>
<li>Goessling, W., Sadler, K. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Zebrafish%3A+An+important+tool+for+liver+disease+research%5BTitle%5D)+AND+%22Gastroenterology%22%5BJournal%5D)">Zebrafish: An important tool for liver disease research.</a> Gastroenterology. 149 (6), 1361-1377 (2015).</li>
<li>Huo, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transcriptomic+profiles+of+tumor-associated+neutrophils+reveal+prominent+roles+in+enhancing+angiogenesis+in+liver+tumorigenesis+in+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Science+Reports%22%5BJournal%5D)">Transcriptomic profiles of tumor-associated neutrophils reveal prominent roles in enhancing angiogenesis in liver tumorigenesis in zebrafish.</a> Science Reports. 9 (1), 1509(2019).</li>
<li>Yan, C., Yang, Q., Gong, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tumor-associated+neutrophils+and+macrophages+promote+gender+disparity+in+hepatocellular+carcinoma+in+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Research%22%5BJournal%5D)">Tumor-associated neutrophils and macrophages promote gender disparity in hepatocellular carcinoma in zebrafish.</a> Cancer Research. 77 (6), 1395-1407 (2017).</li>
<li>Capece, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+inflammatory+microenvironment+in+hepatocellular+carcinoma%3A+A+pivotal+role+for+tumor-associated+macrophages%5BTitle%5D)+AND+%22Biomed+Research+International%22%5BJournal%5D)">The inflammatory microenvironment in hepatocellular carcinoma: A pivotal role for tumor-associated macrophages.</a> Biomed Research International. 2013, 187204(2013).</li>
<li>de Oliveira, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Metformin+modulates+innate+immune-mediated+inflammation+and+early+progression+of+NAFLD-associated+hepatocellular+carcinoma+in+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Hepatology%22%5BJournal%5D)">Metformin modulates innate immune-mediated inflammation and early progression of NAFLD-associated hepatocellular carcinoma in zebrafish.</a> Journal of Hepatology. 70 (4), 710-721 (2019).</li>
<li>Huemer, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long-term+live+imaging+device+for+improved+experimental+manipulation+of+zebrafish+larvae%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Long-term live imaging device for improved experimental manipulation of zebrafish larvae.</a> Journal of Visualized Experiments. (128), e56340(2017).</li>
<li>Huemer, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((zWEDGI%3A+Wounding+and+entrapment+device+for+imaging+live+zebrafish+larvae%5BTitle%5D)+AND+%22Zebrafish%22%5BJournal%5D)">zWEDGI: Wounding and entrapment device for imaging live zebrafish larvae.</a> Zebrafish. 14 (1), 42-50 (2017).</li>
<li>Evason, K. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+chemical+inhibitors+of+beta-catenin-driven+liver+tumorigenesis+in+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Genetics%22%5BJournal%5D)">Identification of chemical inhibitors of beta-catenin-driven liver tumorigenesis in zebrafish.</a> PLoS Genetics. 11 (7), 1005305(2015).</li>
<li>Sapp, V., Gaffney, L., EauClaire, S. F., Matthews, R. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fructose+leads+to+hepatic+steatosis+in+zebrafish+that+is+reversed+by+mechanistic+target+of+rapamycin+%28mTOR%29+inhibition%5BTitle%5D)+AND+%22Hepatology%22%5BJournal%5D)">Fructose leads to hepatic steatosis in zebrafish that is reversed by mechanistic target of rapamycin (mTOR) inhibition.</a> Hepatology. 60 (5), 1581-1592 (2014).</li>
<li>Park, K. H., Ye, Z. W., Zhang, J., Kim, S. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Palmitic+acid-enriched+diet+induces+hepatic+steatosis+and+injury+in+adult+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Zebrafish%22%5BJournal%5D)">Palmitic acid-enriched diet induces hepatic steatosis and injury in adult zebrafish.</a> Zebrafish. 16 (6), 497-504 (2019).</li>
<li>Progatzky, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dietary+cholesterol+directly+induces+acute+inflammasome-dependent+intestinal+inflammation%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communication%22%5BJournal%5D)">Dietary cholesterol directly induces acute inflammasome-dependent intestinal inflammation.</a> Nature Communication. 5, 5864(2014).</li>
</ol>

Die Autoren haben nichts offenzulegen.

Mit einer erhöhten Inzidenz von HCC, insbesondere NASH-induziertem HCC, ist es von großer Bedeutung, effizientere Modelle zu haben, um die zellulären und molekularen Mechanismen zu untersuchen, die an NASH-assoziiertem HCC beteiligt sind. Die Dekonvolution von Zell-Zell-Interaktionen in der Leber ist entscheidend, um das Fortschreiten der Lebererkrankung und die Hepatokarzinogenese besser zu verstehen. Der in diesem Protokoll beschriebene Ansatz bietet eine einzigartige Möglichkeit, das Fortschreiten der Lebererkrankung in vivo und nicht-invasiv zu analysieren.
Die Vorbereitung der Diät ist entscheidend für den Erfolg der Etablierung eines NASH-assoziierten HCC-Modells. Es ist wichtig, Diethylether vollständig im Abzug verdampfen zu lassen, um schädliche Auswirkungen zu vermeiden, während Futter für Zebrafische zubereitet wird. Um diese Diäten mit Larven (5-12 Tage nach der Befruchtung) zu verwenden, ist es äußerst wichtig, die Diäten in feine Partikel zu mahlen, um die Nahrungsaufnahme durch die Larven sicherzustellen. Die Verwendung von fluoreszenzmarkierten Fettsäureanaloga kann verwendet werden, um die Nahrungsaufnahme in Larven zu bewerten.
Bevor die Larven in die Zuchtboxen gelegt und mit dem Fütterungsvorgang begonnen wird, ist es wichtig, sicherzustellen, dass die experimentelle Probenahme durch Mischen von Larven aus verschiedenen Platten einheitlich ist. Dieser Schritt ist wichtig, da verschiedene Mikroumgebungen, beginnend mit Tag 0, in jeder der Platten gefördert werden und die Entzündungsreaktion beeinflussen können.
Ein weiterer wichtiger Schritt besteht darin, die Larven zu zählen, um zu wissen, wie viel Nahrung für jede Futterbox benötigt wird. Wenn die Menge an Nahrung nicht für die Anzahl der in jeder Box vorhandenen Larven ausreicht, tritt eines der beiden Szenarien ein: 1) Larven werden unterernährt; 2) Larven werden überfüttert. Eine ungenaue Fütterung führt zu ungesunden Bedingungen im Zusammenhang mit Unterernährung oder Überernährung, wie z. B. Entzündungen, die die Mikroumgebung der Leber drastisch beeinträchtigen. Wenn eine ungenaue Fütterung auftritt, zeigen Larven Bewegungsprobleme. In diesem Entwicklungsstadium sollten Larven intensiv schwimmen, daher wurden Larven unter ungesunden Bedingungen (Unterernährung oder Exposition gegenüber toxischen Cholesterindosen aufgrund von Überfütterung) aufgezogen, wenn Bewegungsprobleme festgestellt werden. Aus diesem Grund müssen die Fütterungsverfahren für beide Diäten, normale und cholesterinangereicherte Diäten, streng kontrolliert werden. Einige Assays können durchgeführt werden, um die Genauigkeit der Fütterung und Gesundheit von Larven schnell zu verbessern, einschließlich des Vorhandenseins von Hepatomegalie (Lebergröße) und Entzündungen von Geweben und Organen, insbesondere Leber und Darm (sichtbare erhöhte Infiltration von Neutrophilen und Makrophagen).
Die tägliche Reinigung und der Austausch von 95% von E3 ist entscheidend, um das Wachstum von Mikroorganismen in den Futterboxen zu reduzieren und die Gesundheit und das Überleben der Larven zu verbessern. Alternativ können Larven in einem Stand-alone-Rack-System platziert werden. Für beste Ergebnisse legen Sie 60-80 Larven in einen 3-Liter-Tank. Halten Sie den Wasserfluss auf einem minimalen Niveau, indem Sie den Fluss auf einen schnell tropfenden Modus einstellen und die Larven zweimal täglich (morgens und nachmittags) mit 3-4 mg füttern. Der Wasserfluss sollte regelmäßig überprüft werden, um einen korrekten Durchfluss in jedem Tank zu gewährleisten. In unserem Labor gibt uns diese Methode 95-100% Überleben bei kurzfristiger Fütterung von 10% HCD. Darüber hinaus reduzierte diese Methode den Arbeitsaufwand für die tägliche Reinigung und den Wasseraustausch, die im beschriebenen statischen Fütterungsprotokoll erforderlich sind, erheblich.
Während wir eine 10% cholesterinangereicherte Diät verwendeten, um NASH in einer kurzfristigen Exposition zu induzieren (5 Tage reichen aus, um Steatohepatitis zu induzieren), können Ernährungsumstellungen durchgeführt und erweitert werden, um Fructose 18, Fettsäuren (wie Palmitinsäure)19 oder Fütterungsprotokolle zu verwenden, die mit einer 4% cholesterinangereicherten Diät erweitert werden können20. Derzeit gibt es nur wenige erfolgreiche therapeutische Ziele für HCC und keine für NASH. Die Verwendung von Zebrafischmodellen bietet eine einzigartige Gelegenheit, unser Wissen über die Hepatokarzinogenese zu erweitern, aber auch ein beispielloses Wirbeltiersystem, um Medikamentenscreenings mit großem Durchsatz durchzuführen. Die in diesem Protokoll beschriebenen Techniken werden zukünftige Erkenntnisse und therapeutische Ziele für Lebererkrankungen und Hepatokarzinogenese erleichtern.

Das hepatozelluläre Karzinom (HCC) ist eine aggressive Krebserkrankung mit begrenzten therapeutischen Möglichkeiten. Es wurde festgestellt, dass mehr als 30% aller Patienten mit HCC fettleibig sind und NASH, eine aggressive Form von NAFLD 1,2,3,4, haben. Der Verzehr von kalorienreichen Diäten erhöht die Fettsäureverfügbarkeit drastisch, was lokale und systemische Stoffwechselverschiebungen verursacht und Steatose, Hepatozytenverletzungen, Entzündungen und Fibrose auslöst - alles Schlüsselmerkmale von NASH. Die NASH-Progression zu HCC beinhaltet die Ansammlung von Lipiden in der Leber, die Entzündungen und eine veränderte Immunzellzusammensetzung auslöst 5,6,7. Es ist von besonderem Interesse und Bedeutung zu verstehen, wie die Lebermikroumgebung und die Immunzelllandschaft während des Fortschreitens der Lebererkrankung verändert werden und wie sie sich aufgrund bestimmter ätiologischer Faktoren verändert. Um die Auswirkungen des Cholesterinüberschusses auf die Mikroumgebung der Leber und die Immunzelllandschaft besser zu identifizieren, haben wir ein einzigartiges Zebrafischmodell für NASH-assoziiertes HCC entwickelt. Die Verwendung dieses Modells hat uns ein besseres Verständnis der Auswirkungen von Ernährung und Überernährung auf die Mikroumgebung der Leber und das Fortschreiten der Lebererkrankung gegeben.
Säugetiermodelle, wie Mäuse und menschliche Gewebeproben, waren wesentlich für das Verständnis der Pathogenese von Steatohepatitis und Steatose8. Mäuse sind das bevorzugte Modell für Lebererkrankungen und Krebs, aber es fehlt ihnen an optischer Klarheit auf zellulärer Ebene, während menschlichen Gewebeproben oft die 3D-Umgebung fehlt, die Tiermodelle imitieren können. Diese Hindernisse haben Zebrafische zu einem leistungsstarken Modell in der Forschungsgemeinschaft gemacht. Zebrafische haben bemerkenswerte Ähnlichkeiten mit Menschen, mit mindestens 70% Generhaltung. Sie erhalten die Mikroumgebung der Leber, die zelluläre Zusammensetzung, Funktion, Signalübertragung und Reaktion auf Verletzungen 9,10. Unter Verwendung einer cholesterinreichen Diät (HCD) in Kombination mit einem etablierten transgenen Zebrafischmodell von HCC haben wir ein Zebrafischmodell von NASH-assoziiertem HCC entwickelt.
Hier präsentieren wir ein Protokoll, das erklärt, wie man ein NASH-assoziiertes HCC-Zebrafischmodell generiert und wie man die Mikroumgebung der Leber untersucht und frühe Malignitätsmerkmale in vivo behandelt. Mit nicht-invasiver konfokaler Mikroskopie in Kombination mit transgenen Zebrafischlinien mit fluoreszenzmarkierter Hepatozytenmembran und -kern können wir frühe Malignitätsmerkmale durch die Analyse der Lebermorphologie (Fläche, Volumen und Oberfläche), der Zell- und Kernmorphologie (Hepatozytenbereich, Kernbereich, N:C-Verhältnis, Kernzirkularität, Mikrokerne / Kernhernienbewertung) und Angiogenese (Gefäßdichte) untersuchen. Die Mikroumgebung von Immunzellen ist auch ein wichtiges Merkmal der Hepatokarzinogenese11,12,13,14, daher zeigen wir auch, wie die Zusammensetzung von Leberimmunzellen in NASH-assoziierten HCC-Larven unter Verwendung transgener Zebrafischlinien mit markierten Immunzellen (Neutrophile, Makrophagen und T-Zellen) analysiert werden kann. Die beschriebenen Techniken sind einzigartig für das Modell und äußerst nützlich, um die Lebermikroumgebung und die Immunzellzusammensetzung beim Fortschreiten der Lebererkrankung zu bewerten.

<table><tbody><tr><td>Cholesterin</td><td>Sigma</td><td>C8667-25G</td><td>Leicht abbaubar. Lagern -20°C.</td></tr><tr><td>Corning Netwells Trägerkit 15 mm</td><td>Fisher</td><td>07-200-223</td><td></td></tr><tr><td>Corning Netwells Einsätze</td><td>Fisher</td><td>07-200-212</td><td></td></tr><tr><td>Diethylether</td><td>Fisher</td><td>60-046-380</td><td>Leicht flüchtig.</td></tr><tr><td>Dumont Pinzette #55 dumostar</td><td>Fisher</td><td>NC9504088</td><td></td></tr><tr><td>Fisherbrand Pasteur Pipets 5.75in</td><td>Fisher</td><td>22-183624</td><td></td></tr><tr><td>4% Paraformaldehyd (PFA)</td><td>Elektronenmikroskopie Wissenschaft</td><td>15710</td><td></td></tr><tr><td>Golden Pearl Diät 5&ndash; 50 nm Active Spheres</td><td>Brine Shrimp Direct</td> <td>-</td> <td>Jedes handelsübliche Trockenfutter in Pulverform für Larven kann verwendet werden.</td></tr><tr><td>Graduierte Transferpipetten</td><td>Fisher</td><td>22-170-404</td><td></td></tr><tr><td>Isopropanol</td><td>Fisher</td><td>BP26181</td><td></td></tr><tr><td>PBS, pH7.4, 10X, 10er Pack</td><td>Crystalgen</td><td>221-1422-10</td><td></td></tr><tr><td>Petrischalen 100X20MM</td><td>Fisher</td><td>08-747D</td><td></td></tr><tr><td>Tricain</td><td>Sigma</td><td>A-5040</td><td></td></tr><tr><td>Tween 20</td><td>Fisher</td><td>BP337-500</td><td></td></tr><tr><td>Öl Rot O Lösung 0,5% Isopropanol</td><td>Sigma</td><td>O1391-500ML</td><td></td></tr><tr><td>Tricain</td><td>Sigma</td><td>A-5040</td><td></td></tr><tr><td>Tween 20</td><td>Fisher</td><td>BP337-500</td><td></td></tr><tr><td>Vactrap</td><td>VWR</td><td>76207-630</td><td>Vakuumsystem zum Sammeln von Larven</td></tr><tr><td>Mikroskopen</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Fluoreszierendes Stereomikroskop</td><td>Leica</td><td>M205 FCA THUNDER Imager Model Organism Large</td><td></td></tr><tr><td>Spinning Disk Konfokales Mikroskop</td><td>Nikon</td><td>Nikon CSU-W1</td><td></td></tr><tr><td>Stereomikroskop</td><td>Leica</td><td>S9i mit durchleuchteter Basis</td><td></td></tr><tr><td>Software</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Fiji</td><td>Open-Source-Java-Bildverarbeitungsprogramm.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Imaris 9.6</td><td>Bitplane; Oxford Instrumente.</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

analyse der lebermikroumgebung während des frühen fortschreitens des nicht-alkoholischen fettlebererkrankung-assoziierten hepatozellulären karzinoms im zebrafisch

Analysis of Liver Microenvironment During Early Progression of Non-Alcoholic Fatty Liver Disease-Associated Hepatocellular Carcinoma in Zebrafish

Leberkrebs ist derzeit die dritthäufigste krebsbedingte Todesursache weltweit, und das hepatozelluläre Karzinom (HCC) macht 75-90% aller Leberkrebsfälle aus. Mit der Einführung wirksamer Behandlungen zur Vorbeugung und Behandlung von Hepatitis B / C werden die nichtalkoholische Fettlebererkrankung (NAFLD) und die aggressivere Form, die als nichtalkoholische Steatohepatitis (NASH) bekannt ist, schnell zu den Risikofaktoren Nummer eins für die Entwicklung von HCC in modernen Gesellschaften. Um die Rolle von NASH bei der Entwicklung von HCC besser zu verstehen, haben wir einen NASH-assoziierten HCC-Zebrafisch entwickelt. Die optische Klarheit und genetische Nachvollziehbarkeit der Zebrafischlarven machen sie zu einem attraktiven und leistungsstarken Modell, um die Mikroumgebung der Leber und die Zusammensetzung der Immunzellen mit nicht-invasiver fluoreszierender Live-Bildgebung zu untersuchen. Dieses Protokoll beschreibt, wie ein NASH-assoziiertes HCC-Zebrafischmodell verwendet werden kann, um die Wirkung von Cholesterinüberschuss in der Lebermikroumgebung und seine Auswirkungen auf die Zusammensetzung der Immunzellen in frühen Stadien der Krankheit zu untersuchen. Zuerst füttern wir HCC-Larven (s704Tg), die Hepatozyten-spezifisches aktiviertes Beta-Catenin exprimieren, mit einer 10% cholesterinreichen Diät für 8 Tage, um ein NASH-assoziiertes HCC-Modell zu entwickeln. Hier beschreiben wir, wie verschiedene transgene Linien verwendet werden können, um verschiedene frühe Malignitätsmerkmale in der Leber durch nicht-invasive konfokale Mikroskopie zu bewerten, wie Leberbereich, Zell- und Kernmorphologie (Hepatozytenbereich, Kernbereich, Kern-Zytoplasma-Verhältnis (N:C-Verhältnis), Kernzirkularität, Mikrokerne / Kernhernien-Scoring) und Angiogenese. Dann zeigen wir anhand transgener Linien mit markierten Immunzellen (Neutrophile, Makrophagen und T-Zellen), wie die Zusammensetzung von Leberimmunzellen in NASH-assoziierten HCC-Larven analysiert werden kann. Die beschriebenen Techniken sind nützlich, um die Lebermikroumgebung und die Immunzellzusammensetzung in frühen Hepatokarzinogenese-Stadien zu bewerten, aber sie können auch modifiziert werden, um solche Merkmale in anderen Lebererkrankungsmodellen zu untersuchen.

Durch die Einführung einer kurzfristigen cholesterinreichen Diät in ein hepatozelluläres Karzinom (HCC) Zebrafischmodell, das eine hepatozytenspezifische konstitutiv aktive Form von Beta-Catenin (s704Tg; Tg(fabp10a:pt-B-cat, cryaa:Venus)17 sind wir in der Lage, ein Nicht-Säugetier-Wirbeltiermodell von NASH-assoziiertem HCC zu erstellen. Das Fortschreiten der Lebererkrankung kann frühzeitig überwacht werden, indem Lebersteatose, Lebergröße, Hepatozyten, Kernmorphologie, Angiogenese und Immunzellinfiltration gemessen werden (Abbildung 1).
HCC-Larven, die mit normaler Ernährung gefüttert werden, zeigen keine bis leichte Lebersteatose, gemessen durch Ölrot-O-Färbung. HCC-Larven, die mit einer cholesterinreichen Diät gefüttert werden, zeigen jedoch einen signifikanten Anstieg der Lebersteatose (Abbildung 2).
Ein bekannter Marker für Lebererkrankungen ist Hepatomegalie17. Um die Lebergröße zu bewerten, können HCC-Larven mit einer transgenen Linie ausgekreuzt werden, die spezifisch einen fluoreszierenden Marker auf Hepatozyten exprimiert, wie die Tg (fabp10a: H2BmCherry). Zur Beurteilung der Hepatomegalie wird eine Beurteilung des Leberbereichs (2D), der Leberoberfläche und des Lebervolumens (3D) durchgeführt. Nach 8 Tagen Exposition gegenüber einem Cholesterinüberschuss wurde bei HCC-Larven eine Lebervergrößerung beobachtet (Abbildung 3).
Mit nicht-invasiver Live-Bildgebung können transgene Fischlinien, die fluoreszierende Proteine in Hepatozytenmembranen (wie Tg(fabp10a:Life-actin-EGFPP) und in Hepatozytenkernen (wie Tg(Fabp10a:H2B-mCherry) exprimieren, verwendet werden, um zelluläre und nukleäre morphologische Veränderungen im Zusammenhang mit Malignität in Hepatozyten zu beurteilen. Die Hepatozytenfläche war sowohl im NASH-assoziierten HCC (Abbildung 4A,B,D) als auch im Kernbereich (Abbildung 4C,E) und im Kern-Zytoplasma-Verhältnis (Abbildung 4F) erhöht. Eine signifikante Abnahme der Kernzirkularität wurde auch in der HCD+HCC-Gruppe beobachtet (Abbildung 4G). Lipotoxizität löst DNA-Schäden aus, ein Merkmal der Karzinogenese in Gegenwart von Mikrokernen. Unter Verwendung des H2B-mCherry-Markers beobachteten wir eine größere Inzidenz von Mikrokernen in den HCC-Larven, die mit einer cholesterinreichen Diät gefüttert wurden (Abbildung 4H).
Das hepatische Gefäßsystem kann in Zebrafischmodellen leicht mit einer transgenen markierten Linie wie Tg (kdrl:mCherry oder Tg(fli:EGFP) bewertet werden, die das Gefäßsystem kennzeichnen. Ein signifikanter Anstieg der Gefäßdichte wurde bei HCC+HCD-Larven beobachtet (Abbildung 5).
Um die früh ausgelöste Entzündungsreaktion im NASH-assoziierten HCC zu beobachten, wurde eine transgene Fischlinie, die fluoreszierende Proteine in Makrophagen und Neutrophilen wie Tg(mfap4:tdTomato-CAAX; lyz:BFP) exprimiert, mit der transgenen HCC-Linie ausgekreuzt. Die Infiltration von Neutrophilen und Makrophagen tritt sowohl bei HCC als auch bei HCC auf, die mit HCD gefüttert werden, was durch Quantifizierung der Anzahl und Dichte von Neutrophilen/Makrophagen in der Leber und Umgebung (Umgebung bis zu 75 μm) beurteilt wurde (Abbildung 6A-H). Dennoch zeigte das HCC+HCD einen signifikanten Anstieg der Neutrophilenzahl und -dichte (Abbildungen 6F-H). 13 Tage nach der Befruchtung ist das adaptive Immunsystem bereits funktionsfähig. Verwendung einer transgenen Fischlinie, die fluoreszierendes Protein in T-Zellen exprimiert, wie die Tg (lck: EGFP), und in Kombination mit der HCC-transgenen Linie; Wir bewerteten den Einfluss eines Cholesterinüberschusses auf die Rekrutierung von T-Zellen in die Leber. Eine signifikante Abnahme der T-Zelldichte und der Gesamtzahl wurde bei HCC-Larven beobachtet, die mit HCD gefüttert wurden (Abbildung 6I-K).
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td>Transgene Zebrafischlinien</td>
			<td>ZFIN-Referenz</td>
			<td>Probe</td>
		</tr><tr><td>Casper</td>
			<td>RoyA9; MitfaW2</td>
			<td>Lebersteatose</td>
		</tr><tr><td>Tg(fabp10a:pt-β-catenin_cryaa:Venus / fabp10a:H2B-mCherry )</td>
			<td>s704Tg / uwm41Tg</td>
			<td>Lebermorphologie</td>
		</tr><tr><td>Tg(fabp10a:pt-β-catenin_cryaa:Venus; fabp10a:H2B-mCherry; fabp10a:LIFEACT-EGFP)</td>
			<td>s704Tg / uwm41Tg / uwm42Tg</td>
			<td>Hepatozyten und Kernmorphologie</td>
		</tr><tr><td>Tg(fabp10a:pt-β-catenin_ cryaa:Venus; fli:EGFP)</td>
			<td>s704Tg / y1Tg</td>
			<td>Angiogenese</td>
		</tr><tr><td>Tg(fabp10a:pt-β-catenin_cryaa:Venus;  mfap4:Tomaten-CAAX; lyzC:BFP)</td>
			<td>s704Tg / xt6Tg / zf2171Tg</td>
			<td>Rekrutierung von Makrophagen und Neutrophilen</td>
		</tr><tr><td>Tg(fabp10a:pt-β-catenin_cryaa:Venus; lck:EGFP)</td>
			<td>s704Tg / cz1Tg</td>
			<td>T-Zellen Rekrutierung</td>
		</tr></tbody></table>Tabelle 1: Transgene Zebrafischlinien zur Verwendung in verschiedenen Assays.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td>Anzahl der Larven</td>
			<td>Größe der Futterbox</td>
			<td>Menge der Nahrung pro Tag (mg)</td>
			<td>E3 Volumen (ml)</td>
		</tr><tr><td>30-40</td>
			<td>Kleine Zuchtbox</td>
			<td>3-4</td>
			<td>200</td>
		</tr><tr><td>60-80</td>
			<td>Kleine/große Zuchtbox</td>
			<td>6-8</td>
			<td>400</td>
		</tr><tr><td>100-150</td>
			<td>Große Zuchtbox</td>
			<td>10-15</td>
			<td>500</td>
		</tr></tbody></table>Tabelle 2: Richten Sie die Bedingungen für Fütterungsboxen ein.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td>Phänotyp</td>
			<td>Scoring-Methode</td>
		</tr><tr><td>Nichts</td>
			<td>Normale Kerne, keine Mikrokerne oder Hernien</td>
		</tr><tr><td>Leicht</td>
			<td>Geringe Anzahl von Mikrokernen (weniger als 5 pro Sichtfeld) und/oder Hernienvorfall</td>
		</tr><tr><td>Mittelschwer/ Schwer</td>
			<td>Mittlere bis hohe Anzahl von Mikrokernen (mehr als 5 pro Sichtfeld) und/oder Hernien</td>
		</tr></tbody></table>Tabelle 3: Mikrokerne und nukleare Hernienbewertung.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62457/62457fig01.jpg"> Abbildung 1: Protokolldiagramm, das die wichtigsten experimentellen Schritte und den Analyseansatz zusammenfasst. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62457/62457fig01large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62457/62457fig02.jpg"> Abbildung 2: Kontrolltest für Lebersteatose - ORO-Färbung. HCC-Larven wurden mit normaler oder cholesterinreicher Diät gefüttert und eine Ölrot-O-Färbung (ORO) wurde durchgeführt, um die Lebersteatose zu beurteilen. (A) Diagramm der 12-Well-Platte zur Durchführung einer sequentiellen ORO-Färbung unter Verwendung der Netzvertiefungseinsätze. (B) Bild eines Wimpernwerkzeugs, das zur Manipulation von Larven verwendet wird. (C) repräsentative Bilder von Lebern, die mit Ölrot gefärbt sind; HCC und HCC + HCD Larven. (D) Chi-Quadrat-Diagramm, das den Prozentsatz der Larven mit unterschiedlicher Bewertung der Lebersteatose zeigt. Maßstabsbalken= 50 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62457/62457fig02large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62457/62457fig03.jpg"> Abbildung 3: Repräsentative Bilder der Lebergröße. Transgene HCC-Larven, die einen Lebermarker exprimierten (Tg(fabp10a:H2B-mCherry)) wurden live und nicht-invasiv auf einem konfokalen inversen Spinning-Disk-Mikroskop mit einem zWEDGI abgebildet. (A) Repräsentative 3D-Rekonstruktionen von Lebern in HCC- und HCC+HCD-Larven. (B-D) Grafik mit morphologischen Veränderungen der Leber einschließlich Leberfläche (B), Leberoberfläche (C) und Lebervolumen (D) bei HCC- und HCC+HCD-Larven. Maßstabsbalken = 50 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62457/62457fig03large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62457/62457fig04.jpg"> Abbildung 4: Repräsentative Bilder aus Hepatozyten und Zellkernmorphologie. Transgene HCC-Linien, die fluoreszierende Proteine in Hepatozytenmembranen (Tg(fabp10a:Life-actin-EGFP) und in Hepatozytenkernen (Tg(fabp10a:H2B-mCherry) exprimieren, wurden abgebildet. (A-C) Repräsentative 3D-Rekonstruktionen von F-Aktin- und Hepatozytenkernen von HCC- und HCC+HCD-Larven. Offene Pfeilspitzen zeigen vergrößerte Kerne; weiße Pfeilspitzen zeigen Kern mit veränderter Form; und rote Pfeile zeigen Mikrokerne und Kernhernien. (D-G) Grafiken, die Mittelwerte von Zell- und Kernparametern in HCC und HCC+HCD 13 Tage alten Larven zeigen. (D) Hepatozytenbereich. e) Nukleargebiet. (F) Kern-Zytoplasma-Verhältnis. g) Kernzirkularität. Jeder Punkt stellt den Durchschnitt pro Larve dar. Punktdiagramme zeigen mittlere ±SEM (H) Chi-Quadrat-Diagramme, die den Prozentsatz der Larven mit unterschiedlicher Bewertung von Mikrokernen und Kernhernien zeigen. Maßstabsbalken = 10 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62457/62457fig04large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62457/62457fig05.jpg"> Abbildung 5: Repräsentative Bilder aus dem hepatischen Gefäßsystem. Transgene HCC-Linien, die fluoreszierende Proteine in Hepatozytenkernen (Tg(Fabp10a:H2B-mCherry) und in Endothelzellen (Tg)fli:EGFP)) exprimieren. (A) Repräsentative 3D-Rekonstruktionen des Lebergefäßsystems in HCC- und HCC+HCD-Larven. (B-C) Grafik mit Gefäßdichteindex nach Leberoberfläche (B) Volumen (C) in HCC und HCC + HFCD Larven. Punktdiagramme zeigen den Mittelwert ±REM. Maßstabsbalken = 50 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62457/62457fig05large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62457/62457fig06.jpg"> Abbildung 6: Repräsentative Bilder aus der Leber-Immunzelllandschaft. Transgene HCC-Linie, die fluoreszierende Proteine in Makrophagen und Neutrophilen (Tg(mfap4:tdTomato-CAAX; lyz:BFP) oder in T-Zellen (Tg(lck-EGFP) exprimiert. (A,C,F) Repräsentative 3D-Rekonstruktionen von Lebern und Leukozytenrekrutierung in den Leberbereich in 13 Tage alten HCC- und HCC+HCD-Larven. (B) Diagramm des abgebildeten Leberbereichs. (D-E) Grafik mit Makrophagendichte (D) und Anzahl (E) im Leberbereich bei HCC- und HCC+HCD-Larven. (G-H) Grafik mit Neutrophilendichte (G) und Anzahl (H) im Leberbereich bei HCC- und HCC+HCD-Larven. (G) Repräsentative 3D-Rekonstruktionen der T-Zell-Rekrutierung in den Leberbereich in HCC- und HCC+HCD-Larven. (H-I) Grafik mit T-Zelldichte (H) und Anzahl (I) im Leberbereich bei HCC- und HCC+HCD-Larven. Punktdiagramme zeigen den Mittelwert ±REM. Maßstabsbalken = 50 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62457/62457fig06large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.</a>
Zusatztabelle 1: Tabelle der Puffer und Lösungen <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62457/JoVE_Table_of_buffersandsolutions.xlsx" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um diese Tabelle herunterzuladen.</a>

Hier stellen wir vor, wie ein nicht-alkoholisches Fettlebererkrankung (NAFLD)-assoziiertes Hepatozelluläres Karzinom (HCC) Zebrafischmodell generiert werden kann, um die Auswirkungen von Cholesterinüberschuss auf die Lebermikroumgebung und die Immunzelllandschaft zu untersuchen.

Analyse der Lebermikroumgebung während des frühen Fortschreitens des nicht-alkoholischen Fettlebererkrankung-assoziierten hepatozellulären Karzinoms im Zebrafisch

Liver cancer is currently the third&#160;leading cause of cancer related death worldwide, and Hepatocellular Carcinoma (HCC) accounts for 75-90% of all ...

Unsere Zebrafisch-Leberkrebsmodelle und -protokolle bieten eine einzigartige Gelegenheit, die Lebermikroumgebung und die Immunlandschaft mittels intravitaler Mikroskopie in vivo und nicht-invasiv zu visualisieren. Die Transparenz der Zebrafischlarven ist zweifellos der Hauptvorteil dieses Systems, das es uns ermöglicht, nicht-invasive intravitale Mikroskopie durchzuführen und Einblicke in die Mikroumgebung und die Immunzellinfiltration eines tiefen Gewebes und Organs wie der Leber zu gewinnen. Unser ernährungsinduziertes nephrotisches Modell und die in diesem Protokoll beschriebenen bildgebenden Verfahren können leicht auf die verworrenen Zell-Zell-Interaktionen in anderen Lebererkrankungen oder Forschungsgebieten, einschließlich metabolischem Syndrom und Herz-Kreislauf-Erkrankungen, angewendet werden.Cassia Michael, unsere Labortechnikerin, und Dr. Francisco Juan Martinez-Navarro, Postdoktorand in meinem Labor, demonstrieren das Verfahren. Wiegen Sie zunächst vier Gramm kommerzielles Trockenfutter für Zebrafischlarven in zwei 25-Milliliter-Glasbechergläser, eines für die normale Ernährung und das andere für die 10% High-Cholesterol-Diät oder HCD. Wiegen Sie 0,4 Gramm Cholesterin in einem 10-Milliliter-Glasbecher und decken Sie das Becherglas mit Folie ab.Messen Sie in einem Abzug fünf Milliliter Diethylether mit einer 10-Milliliter-Spritze mit einer 20-Gauge-Nadel. Dann den Diethylether in das normale Diätbecherglas geben und sofort mit einem Spatel mit dem Trockenfutter vermischen. Messen Sie weitere fünf Milliliter Diethylether mit derselben Spritze und Nadel ab und geben Sie sie in das HCD-haltige Becherglas.Sofort mischen, indem Sie mit der Spritze auf und ab saugen. Geben Sie die Cholesterinlösung schnell in das HCD-Becherglas und mischen Sie sie sofort mit einem Spatel, bis die Lösung gleichmäßig ist. Lassen Sie die Becher bis zu 24 Stunden in der Haubecher, um den Diethylether vollständig zu verdampfen.Am nächsten Tag mahlen Sie die Diäten mit einem Stößel und Mörser zu feinen Partikeln. Jede Diät in einen kleinen, beschrifteten Plastikbeutel oder ein 50-Milliliter-Zentrifugenröhrchen geben und bei minus 20 Grad Celsius lagern. Richten Sie transgene Fischschnüre am Tag minus eins ein.Am Tag Null sammeln Sie Eier in einem Sieb, nachdem die Fische gelaicht haben. Spülen Sie die Eier mit einer Waschflasche mit E3 gründlich aus und geben Sie sie vorsichtig in 10-Zentimeter-Petrischalen mit E3-Medium. Reinigen Sie die Platten von allen Trümmern, die sich in den Zuchtboxen angesammelt haben könnten, einschließlich toter oder unbefruchteter Eier, um das unkontrollierte Wachstum von Mikroorganismen und daraus resultierende Defekte in der Larvenentwicklung zu vermeiden.Dann teilen Sie die Eier bei einer Dichte von 70 oder 80 Eiern pro Schale, die 25 Milliliter E3 enthält. Am ersten Tag überprüfen und reinigen Sie tote Embryonen oder Embryonen mit Entwicklungsdefekten unter einem mit einer Transilluminationsbasis ausgestatteten Sezierbereich. Am fünften Tag Larven aus allen Gerichten in einer 15 Zentimeter großen Petrischale kombinieren und E3 ohne Methylenblau hinzufügen. Teilen Sie die Larven in die Futterboxen und füttern Sie sie wie im Textmanuskript beschrieben.Halten Sie die Larven im Zebrafischraum oder einem Brutkasten bei 28 Grad Celsius in einem Dunkellichtzyklus und füttern Sie sie zweimal täglich von Tag 5 bis Tag 12. Entfernen Sie täglich Speisereste sowie 90 bis 95% des Mediums mit einem Vakuumsystem, das an einer Ein-Milliliter-Pipettenspitze befestigt ist. Dann gießen Sie das neue E3 ohne Methylenblau vorsichtig in eine Ecke der Futterbox, um die Larven nicht zu beschädigen.Alternativ können die Larven in Drei-Liter-Tanks mit Systemwasser aufgeteilt und als eigenständige Systemeinheit mit geringem Wasserdurchfluss platziert werden. Diese Alternative spart die Zeit, die für den täglichen Reinigungsprozess benötigt wird, und das Filtersystem hilft, die Larven bis zum Endpunkt gesund zu halten. Bereiten Sie am 13. Tag das Sammelgeschirr entsprechend der Anzahl der Versuchsbedingungen vor, die eingerichtet wurden.Gießen Sie genug E3 ohne Methylenblau, um den Boden jeder Schale zu bedecken. Dann saugen Sie vorsichtig mit dem Vakuumsystem das Wasser aus den Fütterungsboxen ab. Wenn der Wasserstand niedrig wird, heben Sie die Futterbox langsam an, damit die Larven zu einer der Ecken schwimmen, und saugen Sie dann in die entgegengesetzte Richtung ab.Sobald nur noch etwa 20 bis 30 Milliliter der Flüssigkeit übrig sind, dekantieren Sie die Larven vorsichtig in die vorbereitete Auffang-Petrischale und legen Sie das beschriftete Band aus der Fütterungsbox auf den Deckel der Schale. Screenen Sie die anästhesierten Larven auf einem Fluoreszenzstereomikroskop auf gewünschte Fluoreszenzmarker. Fügen Sie dann Tricain E3 in die Kammern des Verwundungs- und Einklemmgeräts hinzu.Entfernen Sie Luftblasen aus den Kammern und dem Rückhaltekanal mit einer P-200-Mikropipette. Entfernen Sie das gesamte überschüssige Tricain E3 und lassen Sie nur genügend Volumen übrig, um die Kammern zu füllen. Als nächstes übertragen Sie eine betäubte Larve in die Ladekammer des Verwundungs- und Einklemmgeräts und positionieren sie für die Abbildung des linken Lappens mit einem Wimpernwerkzeug.Stellen Sie sich die Morphologie aller benötigten Zellen in der Leber unter einem konfokalen Mikroskop vor, wie im Textmanuskript beschrieben. Öffnen Sie die Fidschi-Software. Öffnen Sie dann die Bilddatei und aktivieren Sie die Option Kanäle teilen auf der Registerkarte Bio-Format-Importoptionen.Nachdem Sie Projektionen mit maximaler Intensität für jeden Kanal erstellt haben, erstellen Sie einen ROI um die Larvenleber und messen Sie den Leberbereich. Fügen Sie dann einen Maßstabsbalken als Referenz hinzu und erstellen Sie einen zweiten ROI einschließlich des Leberbereichs und 75 Mikrometer der Umgebung. Wählen Sie im Menü Plugins die Option Analysieren, gefolgt von Zellzähler und zählen Sie die Immunzellen im Rekrutierungsbereich.Notieren Sie die Anzahl der rekrutierten Immunzellen in einer Tabelle. Berechnen Sie die Neutrophilen-, Makrophagen- und T-Zell-Dichten, indem Sie die Anzahl der Immunzellen pro Leberbereich normalisieren. HCC-Zebrafischlarven, die mit normaler Ernährung gefüttert werden, zeigen keine Lebersteatose, gemessen durch Ölrot-O-Färbung.HCC-Larven, die mit HCD gefüttert werden, zeigen jedoch einen signifikanten Anstieg der Lebersteatose. Nach acht Tagen Exposition gegenüber einem Cholesterinüberschuss wurde bei HCC-Larven eine Lebervergrößerung beobachtet. Zur Beurteilung der Hepatomegalie wurden der Leberbereich, die Leberoberfläche und das Lebervolumen ausgewertet.Bei nicht-alkoholischem Steatohepatitis-assoziiertem HCC waren der Hepatozytenbereich zusammen mit dem Kernbereich und das Verhältnis von Kern- zu Zytoplasma erhöht. Eine signifikante Abnahme der Kernzirkularität wurde auch in der fettreichen HCC-Gruppe beobachtet. Unter Verwendung des H2B-mCherry-Markers wurde eine größere Inzidenz von Mikrokernen in den HCC-Larven nachgewiesen, die mit HCD gefüttert wurden.Die Untersuchung des Lebergefäßsystems zeigte eine signifikante Zunahme der Gefäßdichte bei HCC-Larven, die mit HCD gefüttert wurden. Die Infiltration von Makrophagen und Neutrophilen trat sowohl bei HCC als auch bei HCC auf, die mit HCD-Larven gefüttert wurden. Die Quantifizierung von Neutrophilen in Makrophagen in der Leber und ihrer Umgebung zeigte eine signifikante Zunahme der Anzahl und Dichte der Zellen in HCC-Larven, die mit HCD gefüttert wurden.Im Gegensatz dazu wurde eine signifikante Abnahme der T-Zelldichte in der Gesamtzahl bei HCC-Larven beobachtet, die mit HCD gefüttert wurden. Die Reinigung der Tanks und die Fütterung sind die wichtigsten Schritte, um die Lebensfähigkeit der Larven zu gewährleisten und die Entwicklung von Steatose oder Leber und systemischen chronischen Entzündungen in den Kontrollen aufgrund schlechter Wasserqualität oder unsachgemäßer Fütterung zu vermeiden. Andere Methoden wie die Zeitraffermikroskopie und die Analyse der Interaktion zwischen den verschiedenen Zellen, die die Leber bevölkern, können durchgeführt werden.Darüber hinaus kann eine einzellige RNA-Suche von präparierten Lebern in verschiedenen Leberkrebsstadien durchgeführt werden, um vollständig zu verstehen, wie sich die Leberimmunlandschaft mit dem Fortschreiten der Krankheit entwickelt.

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Research

Forschung

JoVE Journal

Cancer Research

Krebsforschung

Um die molekularen Mechanismen zu bewerten, die der Gallenleberregeneration von Zebrafischen zugrunde liegen, haben wir ein Leberverletzungsmodell etabliert, in dem die Nitroreduktase-exprimierenden Hepatozyten nach einer Behandlung mit Metronidazol genetisch abgetragen werden.  In diesem Protokoll beschreiben wir, wie die Hepatozytenablation und die gallengetriebene Leberregeneration geschickt manipuliert, überwacht und analysiert werden können.

Hepatozyten-spezifische Ablation in Zebrafische, um Gallengetriebenen Leberregeneration Studieren

Anhaltende Fibrose mit Ablagerung von übermäßigen extrazellulären Matrixproteinen führt zu Zirrhose. Alkoholmissbrauch ist eine der Hauptursachen für schwere Lebererkrankungen. Wir haben ein Ethanol-induziertes Zebrafisch-Modell für fibrotische Lebern etabliert, um die Mechanismen und Strategien zur Förderung der Hepatozytenregeneration nach alkoholinduzierten Verletzungen zu untersuchen.

Entwicklung einer fibrotischen Leber Modell in Zebrabärbling Ethanol-induzierte zur Untersuchung Progenitor-vermittelte Zell Hepatozyten-Regeneration

Zebrafische entwickeln sich zu einem wertvollen Modell für die Verarbeitung von Nahrungslipiden und Stoffwechselkrankheiten. Beschrieben werden Protokolle von lipidreichem Larvenfutter, Live-Imaging von fluoreszierenden Lipidanaloga in der Nahrung und die Quantifizierung der Nahrungsaufnahme. Diese Techniken können auf eine Vielzahl von Screening-, Bildgebungs- und hypothesengesteuerten Untersuchungstechniken angewendet werden.

High-fat Feeding Paradigm für Larval Zebrabärbling: Füttern, Live-Imaging und Quantifizierung der Nahrungsaufnahme

Dieses Protokoll beschreibt histologische Analysen der Leber aus Zebrafisch-Larven, die mit 2% Ethanol für 24 Stunden behandelt wurden. Eine solche akute Ethanolbehandlung führt zu einer hepatischen Steatose und einer Schwellung des Lebergefäßsystems.

Histologische Analysen der akuten alkoholischen Leberverletzung in Zebrafisch

Hier zeigen wir eine Methode zur Quantifizierung der Lebergröße in Larvenzebrafischen, die eine Möglichkeit bietet, die Auswirkungen genetischer und pharmakologischer Manipulationen auf das Leberwachstum und die Leberentwicklung zu bewerten.

Quantifizierung der Lebergröße in Larval Zebrafischen mit Brightfield-Mikroskopie

Hier bieten wir ein Schritt-für-Schritt-Protokoll mit Tipps zur Generierung von Xenografts und Richtlinien für die Tumorverhaltensanalyse, die Immunfluoreszenz mit voller Montätralisierung und die konfokale Bildgebungsquantifizierung.

Generation von Zebrafischen Larval Xenografts und Tumorverhaltensanalyse

Die rezellularisierte extrazelluläre Matrix einer dezellularisierten Rattenleber kann als humanisiertes, dreidimensionales ex vivo-Modell verwendet werden, um die Verteilung und Transgenexpression eines Virus oder viralen Vektors zu untersuchen.

Studie von viralen Vektoren in einem dreidimensionalen Modell der Leber neu besiedelt mit dem menschlichen hepatozellulären Karzinom-Zelllinie HepG2

Die Fähigkeit metastasierender Klone, entfernte Stellen zu besiedeln, hängt von ihrer Proliferationskapazität und/oder ihrer Fähigkeit ab, in der Mikroumgebung des Wirts ohne signifikante Proliferation zu überleben. In dieser Arbeit stellen wir ein Tiermodell vor, das eine quantitative Visualisierung beider Arten der Leberbesiedlung durch metastasierende Klone ermöglicht.

Erweiterte Tiermodell für Colorectal Metastase in der Leber: Imaging-Techniken und Eigenschaften des metastasierten Clones

Wir beschreiben detailliert ein klinisch relevantes Tumormodell der Darmkrebslebermetastasen (CRLM) und den Einfluss der Leberischämie-Reperfusion (I/R) auf Tumorwachstum und Metastasierung. Dieses Modell kann helfen, die Mechanismen, die der chirurgieinduzierten Förderung des metastasierenden Wachstums der Leber zugrunde liegen, besser zu verstehen.

Murine Modell der metastasierenden Lebertumoren in der Einstellung der Ischämie Reperfusionsverletzung

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Generierung einer Leber orthotopischen Human Enuveal Melanom Xenograft Plattform bei immundefizienten Mäusen

Erfahren Sie, wie Sie die Lebermikroumgebung und Immunzellinfiltration bei NASH-assoziiertem hepatozellulärem Karzinom in Danio rerio untersuchen. Dieses Protokoll nutzt nicht-invasive intravitalmikroskopische Bildgebung.

Analyse der Lebermikroumgebung während des frühen Fortschreitens des nicht-alkoholischen Fettlebererkrankung-assoziierten hepatozellulären Karzinoms im Zebrafisch (Video) | JoVE Journal

Analyse der Lebermikroumgebung während des frühen Fortschreitens des nicht-alkoholischen Fettlebererkrankung-assoziierten hepatozellulären Karzinoms im Zebrafisch

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