Name: Laser-Mikrobestrahlung zur Untersuchung der DNA-Rekrutierung während der S-Phase (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-04-16T14:30:00.000+00:00
Duration: 7 min 11 s
Description: Lernen Sie die Laser-Mikrobestrahlung zur Analyse der DNA-Reparaturprotein-Rekrutierung während der S-Phase in lebenden Zellen. Diese Methode ermöglicht hochauflösende, phasenspezifische Untersuchungen.

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Die Autoren danken M. Pagano für seine kontinuierliche Unterstützung sowie D. Simoneschi, A. Marzio und G. Tang für ihre kritische Durchsicht des Manuskripts. B. Miwatani-Minter dankt R. Miwatani und B. Minter für ihre anhaltende Unterstützung. G. Rona dankt K. Ronane Jurasz und G. Rona für ihre anhaltende Unterstützung.

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Die Autoren geben an, dass die Veröffentlichung der präsentierten Arbeit von der Nikon Corporation gesponsert wurde. Die Autoren erklären, dass keine interessenkonflikte bestehen.

Kritische Schritte und mögliche Protokollfehlerbehebung/-änderungen Das richtige Gewebekulturgefäß für die Mikrobestrahlung ist entscheidend für den Erfolg. Die meisten hochauflösenden Bildgebungssysteme sind für eine Deckglasstärke von 0,17 mm optimiert. Die Verwendung von Bildgebungskammern mit höherer oder geringerer Dicke oder aus Kunststoffpolymeren (nicht für die 405-nm-Bildgebung optimiert) kann die Bildqualität erheblich reduzieren. Wenn Sie Glasoberflächen verwenden, stellen Sie sicher, dass sie gewebekulturbehandelt sind, um die Zelladhäsion zu verbessern. Wenn sie nicht mit Gewebekultur behandelt werden, müssen diese Kammern beispielsweise mit Poly-D-Lysin beschichtet werden, bevor die Zellen ausgesät werden. Beim Plattieren von Zellen in das kammerbewältigte Deckglas ist eine ideale Zelldichte von größter Bedeutung, um Unregelmäßigkeiten im Zellzyklus und zusätzliche Belastung der Zellen zu vermeiden. Die richtige thermische Gleichgewichtierung der Mikroskopkomponenten vor dem Experimentieren, um eine stabile Temperatur aufrechtzuerhalten, ist entscheidend für die Aufrechterhaltung des Fokus während der gesamten Zeitrafferaufnahme und ist auch notwendig, um eine homogene DDR über Zeit und Proben hinweg zu gewährleisten.
Es ist wichtig, dass sich die Zellen vor der Mikrobestrahlung in einem gesunden Zustand befinden, um die artefaktischen Daten zu reduzieren. Wenn Zellen nach der Infektion/ Selektion eine unregelmäßige Morphologie aufweisen, lassen Sie die Zellen durch mehrere Passagen fortschreiten, bis sich die Morphologie wieder normalisiert. Achten Sie immer darauf, dass die verwendeten Zelllinien frei von Mykoplasmenkontamination sind. Unter den vielen Nebenwirkungen der Mykoplasmeninfektion verursacht es auch DNA-Schäden an den Wirtszellen und könnte ihre DDR-Signalwege beeinflussen14,15. Der empfindlichste Weg, Mykoplasmen in der Zellkultur nachzuweisen, ist die PCR (versus. Nachweis mit DAPI oder Hoechst).
Eine optimale Überexpression des interessierenden Reparaturproteins sollte mit endogenen Werten vergleichbar sein, jedoch hoch genug für den Nachweis. Der auf den viralen Vektoren verwendete Promotor, der virale Titer während der Infektion und die Länge der Infektionszeit können alle für ideale Expressionsniveaus angepasst werden. Für konsistente Ergebnisse isolieren Sie einzelne Zellklone, um homogene Expressionsniveaus und eine normale Zellmorphologie zu gewährleisten. Es wird empfohlen, Vektorkonstrukte zu verwenden, die markierte PCNA nicht in höheren als endogenen Konzentrationen überexprimieren, um den richtigen Zellzyklus und die DNA-Reparaturmarkerfunktion zu erreichen. Selbst geringe PCNA-Überexpressionsraten reichen aus, um S-Phasen-Zellen zu unterscheiden. Zu diesem Zweck wurden erfolgreich retrovirale pBABE-Vektoren eingesetzt (Addgene #1764, #1765, #1766, #1767). PCNA kann mit beliebigen monomeren roten(z. B. mPlum, mCherry, mRuby usw.) oder monomeren grün fluoreszierenden Proteinen (z. B. mEGFP, AcGFP, mWasabi, mNeonGreen, mEmerald usw.) markiert werden, die dann mit einem abwechselnd markierten POI kombiniert werden können. Die Überexpressierung eines fluoreszierend markierten POI hat einige Einschränkungen und Überlegungen. Fluoreszierende Tags können die normale Proteinfunktion und -lokalisation stören. Somit muss die Position des Tags (N- oder C-Terminal) berücksichtigt werden. Verwenden Sie immer monomere fluoreszierende Proteine, da die Oligomerisierung nicht-monomerer Varianten die Funktion des POI beeinflussen kann.
Die Lasereinstellungen müssen für jedes Bildgebungssystem bestimmt werden, da viele Komponenten des optischen Pfades die tatsächliche Leistung der Zellen beeinflussen. Die Lasermikrobestrahlung kann verschiedene Arten von DNA-Läsionen verursachen, abhängig von der Anregungswellenlänge, der Leistungsabgabe des FRAP-Lasers und ob vorsensibilisierende Mittel (wie Bromodeoxyuridin oder Hoechst) verwendet wurden. 405 nm Laser können oxidative DNA-Schäden verursachen, einzel- und doppelsträngigeBrüche 16,17. Durch die Verwendung höherer Laserausgabeeinstellungen erhöht sich die Anzahl der DSBs. In diesem Protokoll wurden keine Vorsensibilisierungsmethoden verwendet, aber diese Techniken werden in der Literatur ausführlich behandelt und in der folgenden Diskussion erneut behandelt. Unserer Meinung nach ist der beste Weg, um zu testen, ob die gewünschte Läsion erzeugt wird, die Rekrutierung bekannter DNA-Schadensweg-spezifischer Gene. Die Rekrutierung von NTHL1 oder OGG1, Komponenten des BER-Signalwegs, deutet auf die Induktion von oxidierten DNA-Basen10,11,17,18,19hin, während FBXL10 oder XRCC5 das Vorhandensein von DSBs8,20,21anzeigen . Die Rekrutierung von XRCC1 kann sowohl auf das Vorhandensein von oxidierten DNA-Basen als auch auf einzelsträngige Brüche (SSB)hinweisen 22,23. XPC (d.h. RAD4) ist ein guter Indikator für NER, der die sperrigen DNA-Addukte entfernt, die durch ultraviolettes Licht (UV) erzeugt werden17,24. Da die Rekrutierung exogener Proteine zu bestimmten Unregelmäßigkeiten führen kann, kann die immunfluoreszierende Färbung von endogenen DNA-Reparaturproteinen oder Markern (wie γH2A.X für doppelsträngige Brüche) das Vorhandensein spezifischer DNA-Läsionen bestätigen. Alternativ könnten auch Antikörper gegen bestimmte Arten von DNA-Läsionen verwendet werden. Um die gelieferte Laserleistung einzustellen, können sowohl die Verweilzeit als auch die Laserleistung verändert werden.
Mit Hilfe der mathematischen Modellierung konnte eine detaillierte kinetische Analyse durchgeführt werden, die wertvolle Einblicke in die Rekrutierungseigenschaften des POI liefern kann (z. B. Beitrag mehrerer DNA-Bindungsdomänen, Empfindlichkeit gegenüber verschiedenen Signalereignissen usw.). Automatisierte Rekrutierungsauswertung und Zellverfolgung könnten kombiniert werden, um robuste Workflows zu schaffen 1,25.
Vorteile und Grenzen der DNA-Vorsensibilisierung Die Vorsensibilisierung der DNA vor der Mikrobestrahlung ist ein häufig verwendetes Werkzeug zur Rekrutierung von DNA-Reparaturproteinen16,17. Die Sensibilisierung der DNA vor der Mikrobestrahlung macht sie anfälliger für DSBs. Die beiden gebräuchlichsten Methoden zur DNA-Vorsensibilisierung sind die Vorbehandlung von Zellen mit Bromodeoxyuridin (BrdU) oder Hoechst-Farbstoff. Für Systeme, die bei hohen Laserleistungen nicht mikrobestrahlen können, können diese Methoden notwendig sein, um DNA-Läsionen wie DSBs zu induzieren. Darüber hinaus fungiert Hoechst in Ermangelung eines Durchlichtdetektors oder eines fluoreszierenden Signals, das den Zellkern hervorhebt (z. B. bei der Untersuchung der Rekrutierung von nicht markierten endogenen DNA-Reparaturproteinen), sowohl als vorsensibilisierendes Werkzeug als auch als fluoreszierender Kernfleck. Eine DNA-Vorsensibilisierung kann jedoch zu erheblichen Komplikationen führen. BrdU (verwendet in einer Endkonzentration von 10 μM) muss den Zellen 24 Stunden (oder einer Zeit, die einem vollständigen Zellzyklus in der verwendeten Zelllinie entspricht) zugesetzt werden, um sie ordnungsgemäß in die DNA einzubauen, und kann Zellzyklusinterferenz verursachen26. Hoechst 33342 (verwendet in einer Endkonzentration von 1 μg/ml) ist nach langen Inkubationszeitzeiten zytotoxisch, benötigt aber ausreichend Zeit, um den Zellkern mit dem Farbstoff zu sättigen. Daher sollte es nur 15-20 Minuten vor der Mikrobestrahlung angewendet werden; Andernfalls sind die Rekrutierungsdaten nicht konsistent. Die auf diese Weise gefärbten Zellen können nicht länger als ein paar Stunden in Kultur gehalten werden27,28. Achten Sie darauf, Hoechst 33358 nicht zu verwenden, das nicht so zelldurchlässig ist wie der Farbstoff Hoechst 33342. Die Vorsensibilisierung kann auch zu unnötigen Abweichungen zwischen den Experimenten führen und macht das Experiment noch empfindlicher gegenüber Unterschieden in der Zelldichte (da dies die Menge des eingearbeiteten Farbstoffs / der Zelle beeinflusst).
Vorteile und Grenzen der konfokalen Mikroskopie Die Bildgebungsgeschwindigkeit der konfokalen Mikroskopie kann im Vergleich zur Weitfeldmikrokopie einschränkend sein. Ein konfokales Mikroskop, das mit einem Resonanzscanner ausgestattet ist, kann jedoch die Bildgeschwindigkeit (auf Kosten der Auflösung) enorm verbessern und den Geschwindigkeiten der Spinnscheibenmikroskopie nahe kommen. Drei Eigenschaften machen das konfokale System A1R HD25 zu einer ausgezeichneten Wahl für das hier vorgestellte Protokoll. Erstens ermöglicht das 25-mm-Sichtfeld des Systems die Abbildung von 15-20 Zellen in einem einzigen gescannten Feld (im Vergleich zu 5-10 Zellen in normalen Setups), wodurch die Anzahl der Erfassungen begrenzt wird, die erforderlich sind, um genügend Zellen für die statistische Analyse zu erhalten. Zweitens ermöglichen das FRAP-Modul und zwei Scanheads die gleichzeitige Abbildung und Mikrobestrahlung der Zellen, nicht nur nacheinander. Schließlich bietet die Flexibilität, sowohl den Resonanz- als auch den Galvano-Scanner zu haben, die Möglichkeit, einfach zwischen hochauflösender Bildgebung mit außergewöhnlicher Geschwindigkeit, die das Abschrecken von Fluorophoren minimiert, und hochauflösender Bildgebung, die langsamere Scangeschwindigkeiten verwendet, um Bilder mit einem höheren Signal-Rausch-Verhältnis zu erzeugen, zu wechseln. Während das verwendete System die oben genannte Flexibilität ermöglichte, um weiter verbreiteten konfokalen Mikroskopkonfigurationen zu ähneln, wurde in den vorgestellten Experimenten nur der Galvano-Scanner verwendet (sowohl für die Mikrobestrahlung als auch für die anschließende Bildgebung).
Vorteile und Grenzen der Mikrobestrahlung Die Mikrobestrahlung bietet zwar eine konkurrenzlose räumliche und zeitliche Auflösung, ist aber nicht ohne Einschränkungen. DNA-Schäden durch Laser-Mikrobestrahlung sind im Vergleich zu natürlich vorkommenden schädlichen Wirkstoffen stark auf bestimmte Teile des Kerns konzentriert. Daher kann sich die Chromatinreaktion aufgrund von Mikrobestrahlung von homogen verteilten Schäden unterscheiden. Darüber hinaus ist die Mikrobestrahlung zeitaufwendig und kann nur an einigen Dutzend Zellen durchgeführt werden, während große populationsbasierte biochemische Methoden (Chromatinfraktionierung, Immunpräzipitation, ChIP) eine erhöhte Robustheit bieten können, indem Tausende von Zellen gleichzeitig untersucht werden. Die Überprüfung von Beobachtungen durch Mikrobestrahlung mit traditionellen biochemischen Techniken ist eine effektive Strategie für zuverlässige Schlussfolgerungen. Obwohl die gleichzeitige Mikrobestrahlung vieler Zellen in einem bestimmten Sichtfeld möglich ist, benötigt das Bildgebungssystem mehr Zeit, um die Aufgabe auszuführen. Daher begrenzt die Messung der Dynamik von Proteinen, die sich sehr schnell zu DNA-Läsionen rekrutieren, die Anzahl der möglichen ROIs für die Mikrobestrahlung, die gleichzeitig verwendet werden. Auf dem für dieses Protokoll verwendeten Bildgebungssystem dauert die Mikrobestrahlung eines einzelnen 1024 Pixel langen ROI 1032 ms mit 1000 μs Verweilzeit und 3088 ms mit 3000 μs Verweilzeit. Die Verwendung mehrerer RoIs-Linien erhöht die Zeit, die für die Mikrobestrahlung benötigt wird, erheblich (z. B. dauert der ROI von 7 x 1024 Pixeln 14402 ms bei 1000 μs Verweilzeit und 21598 ms bei 3000 μs Verweilzeit). Diese Zeit geht durch die Bildaufnahme verloren und muss berücksichtigt werden. Verwenden Sie bei der Abbildung von schnellen Rekrutierungsereignissen den kürzest möglichen ROI und bestrahlen Sie nur eine Zelle gleichzeitig mit Mikrobestrahlung.
Vorteile und Einschränkungen gegenüber Synchronisationsmethoden Für zellzyklusspezifische Studien beinhalten die bestehenden Methoden entweder die Synchronisation von Zellen in bestimmte Zellzyklusphasen oder die Verwendung von fluoreszierenden Reportern, um die spezifische Zellzyklusphase der Zelle zu identifizieren. Jede dieser Methoden bietet jedoch ihre eigenen Herausforderungen und Grenzen.
Das FUCCI-System3 (basierend auf fluoreszierenden Protein-markierten verkürzten Formen von CDT1 und Geminin) ist ein besonders nützliches Werkzeug für Zellzyklusstudien, hat aber Einschränkungen, wenn es darum geht, zwischen S- und G2-Phasen des Zellzyklus zu unterscheiden. Die Gemininspiegel sind bereits ab der mittleren S-Phase hoch und bleiben bis zur M-Phase hoch, was es schwierig macht, diese Phasen zu trennen. Die Verwendung des FUCCI-Systems bedeutet auch, dass zwei optische Kanäle des Mikroskops nicht für die Abbildung des POI verwendet werden können.
Nicht-Krebszelllinien könnten durch die Entfernung von Wachstumsfaktoren im Serum (Serummangel) in G0 synchronisiert werden, was zu geringen oder keinen DNA-Schäden an den Zellen führt. Die meisten Krebszelllinien werden jedoch teilweise auch ohne ausreichende Mengen an Serum in ihren Medien durch den Zellzyklus fortschreiten. Darüber hinaus beginnen Zellen teilweise die Synchronisation durch die späte G1-, frühe S-Phase zu verlieren. Neben dem Serummangel gibt es zahlreiche chemische Methoden, um eine Zellzyklussynchronisation zu erreichen. Hydroxyharnstoff-, Aphidicolin- und Thymidinblöcke sind Methoden, um die DNA-Replikation zu stoppen, um Zellen in die frühe S-Phase zu synchronisieren. Während diese Methoden billig und einfach sind, führen sie zu Replikationsstress, der zu DNA-Schäden führt. Es wurde gezeigt, dass diese DNA-Replikationsinhibitoren die Phosphorylierung von H2A induzieren. X, ein bekannter Marker von DSBs2,29. Die Methode, Tagged-PCNA als Marker für S-Phasen-Zellen zu verwenden, reduziert das Potenzial für Artefakte, die durch chemische Synchronisation verursacht werden, und kann im Vergleich zum Serummangel auf eine Vielzahl von Zelllinien angewendet werden.
Schlussfolgerung DNA-Schäden sind eine treibende Kraft für genetische Erkrankungen, bei denen mutagene Läsionen zur bösartigen Transformation von Zellen führen können. Das Targeting der DNA-Synthesemaschinerie ist eine grundlegende therapeutische Strategie bei der Behandlung von hyperproliferativen Erkrankungen wie Krebs. Um diese Krankheiten gezielter behandeln zu können, brauchen wir ein besseres Verständnis der Proteine, die DNA-Läsionen reparieren. Das hier beschriebene Protokoll hilft mikrobestrahlungsbasierten Studien in der S-Phase, indem es die Herausforderungen herkömmlicher Synchronisationsmethoden minimiert, um mögliche Artefakte zu reduzieren und die Reproduzierbarkeit der Experimente zu erhöhen.

Mehrere DNA-Reparaturwege haben sich entwickelt, um die verschiedenen Arten von DNA-Läsionen anzugehen, die in Zellen auftreten können, die alle sowohl läsin als auch zeitlich stark reguliert sind. Eine der anfälligsten Perioden des Zellzyklus ist die S-Phase, in der die DNA-Synthese stattfindet. Während die Proliferation für das Leben von grundlegender Bedeutung ist, stellt sie auch eine große Herausforderung dar. Zellen müssen eine originalgetreue Replikation ihres Genoms sicherstellen, um zu vermeiden, dass Mutationen an zukünftige Generationen weitergegeben werden. Folglich bietet die Proliferation einen therapeutischen Interventionspunkt, der für die Entwicklung therapeutischer Ansätze im Bereich der Onkologie eingesetzt wurde.
Alle wichtigen Techniken, die zur Untersuchung der Proteinrekrutierung bei DNA-Läsionen verwendet werden, haben ihre Stärken und Grenzen. Die Mikrobestrahlung hat eine bessere räumliche und zeitliche Auflösung1 als die meisten alternativen Methoden wie immunfluoreszierende Bildgebung von ionisierenden strahlungsinduzierten Herden (IRIF), Chromatin-Immunpräzipitation (ChIP) oder biochemische Fraktionierung. Die Mikrobestrahlung schnürt jedoch die Robustheit der oben genannten Techniken, die eine große Anzahl von Zellen gleichzeitig abtasten können.
Um die DNA-Reparatur in der S-Phase zu untersuchen, muss man in der Lage sein, S-Phasen-Zellen in einer asynchronen Zellkulturpopulation zu unterscheiden. Es gibt viele bekannte Methoden, um dies anzugehen, entweder die Synchronisation von Zellen oder die Visualisierung der verschiedenen Zellzyklusphasen. Beide Ansätze bringen jedoch erhebliche Herausforderungen und mögliche Artefakte mit sich. Chemische Synchronisationsmethoden, die häufig zur Anreicherung von Zellen in der frühen S-Phase verwendet werden (z. B. Doppeltymidinblock, Aphidicolin und Hydroxyharnstoffbehandlung), erreichen eine Synchronisation durch die Induktion von Replikationsstress und schließlich DNA-Schäden selbst. Dies schränkt den Einsatz dieser Methoden zur Untersuchung von DNA-Reparaturprozessen in S-Phase2 ein. Die Synchronisation durch Serummangel und -freisetzung ist nur auf eine begrenzte Anzahl von Zelllinien anwendbar, wobei Krebszelllinien weitgehend ausgeschlossen sind, die im Vergleich zu nicht transformierten Zelllinien weniger auf Wachstumsfaktoren für die Zellzyklusprogression angewiesen sind. Das Fluorescence Ubiquitin Cell Cycle Indicator (FUCCI) System ist ein besonders nützliches Werkzeug zur Untersuchung des Zellzyklus, hat aber eine grundlegende Einschränkung bei der Unterscheidung zwischen S- und G2-Zellzyklusphasen3.
Hier wird gezeigt, dass die Verwendung von fluoreszierend markiertem PCNA als nicht-invasiver Marker für die S-Phase die Nachteile chemischer Zellzyklus-Synchronisationsmethoden begrenzt und gleichzeitig mehr Spezifität und Flexibilität als das FUCCI-System ermöglicht. Als einzelner Marker kann PCNA nicht nur S-Phasen-Zellen in einer asynchronen Population hervorheben, sondern auch die genaue Progression von Zellen innerhalb der S-Phase (d. H. Frühe, Mittlere oder späte S-Phase)4anzeigen. Niedrige Expressionsniveaus von exogener, markierter PCNA sorgen für minimale Interferenzen sowohl bei der Zellzyklusprogression als auch bei DNA-Reparaturprozessen. Wichtig ist, dass PCNA auch als interne Kontrolle für die ordnungsgemäße DNA-Schadensinduktion dient, da es an der Reparatur mehrerer DNA-Läsionen beteiligt ist und an lokal induzierten DNA-Schadensstellen rekrutiert wird1,4.
Die hier vorgestellten Experimente zeigen, wie die Rekrutierungsdynamik von EXO1b in der S-Phase gemessen werden kann und wie diese durch den etablierten PARP-Inhibitor Olaparib beeinflusst wird. Die EXO1b-Nukleaseaktivität ist für eine Vielzahl von DNA-Reparaturwegen relevant, einschließlich Mismatch Repair (MMR), Nukleotid-Exzisionsreparatur (NER) und Doppelsträngenbruchreparatur (DSB). In der S-Phase spielt EXO1b eine wichtige Rolle bei der homologen Rekombination (HR) durch die Bildung von 3' ssDNA-Überhängen während der DNA-Resektion5. EXO1b wurde weiter in die DNA-Replikation involviert, mit Rollen bei der Checkpoint-Aktivierung, um blockierte DNA-Gabeln neu zu starten, sowie die Primerentfernung und okazaki-Fragmentreifung am verzögerten Strang während der Strangverschiebung in der Replikation5. Die EXO1b-Rekrutierung an beschädigten DNA-Stellen wird durch die direkte Interaktion mit Poly (ADP-Ribose) (PAR)6,7reguliert. Aufgrund der zahlreichen zellzyklusspezifischen Implikationen von EXO1b ist es eine ausgezeichnete Wahl für S-Phasen-spezifische Rekrutierungsstudien mit PCNA.

<table><tbody><tr><td>Ammoniumchlorid</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A9434-500G</td><td>Zum Abschrecken von Formaldehyd</td></tr><tr><td>Anti-EXO1 Kaninchen Polyklonaler Antikörper</td><td>Proteintech</td><td>16253-1-AP</td><td>Primärantikörper</td></tr><tr><td>Anti-Phospho-Histon H2A. X (Ser139) Antikörper, Klon JBW301</td><td>Millipore</td><td>05-636</td><td>primärer Antikörper</td></tr><tr><td>Rinderserum Albumin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>3117332001</td><td>BSA zur Blockierung</td></tr> von <tr><td>BrdU (5-Brom-2'-Desoxyuridin)</td><td>Merck</td><td>19-160</td><td>Präsensibilisator</td></tr><tr><td>Citifluor&trade; Eindecklösung AFR3</td><td>Electron Microscopy Sciences</td><td>17973-10</td><td>Antifading-haltige PBS-Lösung für die Bildgebung</td></tr><tr><td>DAPI</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D9542-1MG</td><td>Nukleinsäurefärbung</td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Medium Thermo Fisher Scientific</td><td></td><td>10569010 Zellkulturmedium für HEK293T</td></tr><tr><td>Zellen DMSO</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D2650-100ML</td><td>Vehichle Kontroll- und Auflösungslösungsmittel</td></tr><tr><td>EGFP-FBXL10</td><td>Addgen</td><td>#126542</td><td>viraler Expressionsvektor für EGFP-FBXL10</td></tr><tr><td>EXO1b-AcGFP&nbsp; (in pRetroQ)</td>Die kundenspezifische <td>Klonierung</td><td>der DNA von</td><td>EXO1b cDNA wurde an den NheI- und BamHI-Stellen des pRetroQ-AcGFP1-N1-Vektors kloniert.</td></tr><tr><td>Fötales Kälberserum</td><td>Gibco</td><td>16140071</td><td>Medienergänzung</td></tr><tr><td>FluoroBrite DMEM</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A1896701</td><td>Phenolrot freies Medium für die Mikroskopie</td></tr><tr><td>Ziege Anti-Maus IgG (H+L) Hochgradig kreuzadsorbierter Sekundärantikörper, Alexa Fluor Plus 488</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A32723</td><td>Sekundärantikörper</td></tr><tr><td>HEK293T Zellen</td><td>ATCC</td><td>ATCC CRL-3216</td><td>Zelllinie für Virusverpackung</td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H0887-100ML</td><td>Puffermittel zur Ergänzung des Bildgebungsmediums für lebende Zellen</td></tr><tr><td>Hoechst 33342</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>H3570</td><td>Präsensibilisierungsmittel</td></tr><tr><td>Lipofectamine 3000</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>L3000015</td><td>Transfektionsreagenz</td></tr><tr><td>McCoy' s 5A (modifiziert) Medium</td><td>Life Technologies</td><td>16600-108</td><td>Zellkulturmedium für U-2 OS-Zellen</td></tr><tr><td>mCherry-PCNA</td><td>Addgene</td><td>#55117</td><td>nicht-virales PCNA-Konstrukt geeignet für Zellzyklusmarker</td></tr><tr><td>mPlum-PCNA</td><td>Addgene</td><td>#55994</td><td>nicht-virales PCNA-Konstrukt geeignet für Zellzyklusmarker</td></tr><tr><td>mPlum-PCNA (in pBABE)</td><td>kundenspezifische Klonierung</td><td>na</td><td>mPlum-PCNA cDNA wurde aus Addgene #55994 in den BamHI, SalI-Stellen von pBABE (puro)</td></tr> <tr><td>kloniertNikon A1R-HD25 Konfokaler Scankopf und Controller</td><td>Nikon</td><td>na</td><td>konfokales Bildgebungssystem</td></tr><tr><td>Nikon LUN4 Lasereinheit</td><td>Nikon</td><td>na</td><td>Anregungssystem</td></tr><tr><td>Nikon LUN-F 50 mW 405 nm FRAP-Lasereinheit</td><td>Nikon</td><td>na</td><td>FRAP-Lasereinheit</td></tr><tr><td>Nikon NIS Elements Konfokale Controller-Software</td><td>Nikon</td><td></td><td>Konfokale Steuerungssoftware</td></tr><tr><td>Nikon Ti2-E Inverses Mikroskop</td><td>Nikon</td><td>Na</td><td>Inverses Epifluoreszenzmikroskop</td></tr><tr><td>Basis Nikon Ti2-LAPP Modulares Beleuchtungssystem</td><td>Nikon</td><td>Na</td><td>Beleuchtungssystem</td></tr><tr><td>NTHL1-mCherry (in pRetroQ)</td><td>benutzerdefinierte Klonierung</td><td>na</td><td>NTHL1 cDNA wurde in den NheI- und SalI-Stellen des pRetroQ-mCherry-N1-Vektors kloniert.</td></tr><tr><td>Nunc Lab-Tek II Kammer-Deckglas (4 Well)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>155382PK</td><td>Lebendzellmikroskopie Zellkulturkammer</td></tr><tr><td>Olaparib</td><td>Selleck Chemicals</td><td>S1060</td><td>PARP-Inhibitor</td></tr><tr><td>Opti-MEM Medium mit reduziertem Serum</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>31985062</td><td>Verdünnungsmedium für transiente Transfektion</td></tr><tr><td>Wässrige Paraformaldehyd-Lösung (32%)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>50-980-494</td><td>Fixiermittel</td></tr><tr><td>pBABE (hygro)</td><td>Addgene</td><td>#1765</td><td>retroviraler Expressionsvektor (für niedrige Expressionsniveaus)</td></tr><tr><td>pBABE (neo)</td><td>Addgene</td><td>#1767</td><td>retroviraler Expressionsvektor (für niedrige Expressionsniveaus)</td></tr><tr><td>pBABE (puro)</td><td>Addgen</td><td>#1764</td><td>retroviraler Expressionsvektor (für niedrige Expressionsniveaus)</td></tr><tr><td>pBABE (zeo)</td><td>Addgene</td><td>#1766</td><td>retroviraler Expressionsvektor (für niedrige Expressionsniveaus)</td></tr><tr><td>PCNA Antikörper (PC10)</td><td>Santa Cruz</td><td>sc-56</td><td>primärer Antikörper</td></tr><tr><td>Penicillin-Streptomycin-Glutamin (100x)</td><td>Gibco</td><td>10378016</td><td>Media supplement</td></tr><tr><td>Polybrene</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>TR-1003</td><td>Steigerung der Effizienz von Virusinfektionen</td></tr><tr><td>pRetroQ-AcGFP-C1</td><td>Takara</td><td>632506</td><td>retroviraler Expressionsvektor</td></tr><tr><td>pRetroQ-AcGFP-N1</td><td>Takara</td><td>632505</td><td>retroviraler Expressionsvektor</td></tr><tr><td>pRetroQ-mCherry-C1</td><td>Takara</td><td>632567</td><td>retroviraler Expressionsvektor</td></tr><tr><td>pRetroQ-mCherry-N1</td><td>Takara</td><td>632568</td><td>retroviraler Expressionsvektor</td></tr><tr><td>pUMVC</td><td>Addgene</td><td>#8449</td><td>Viraler Verpackungsvektor</td></tr><tr><td>Natriumpyruvat</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>11360070</td><td>Nahrungsergänzungsmittel für das Bildgebungsmedium für lebende Zellen</td></tr><tr><td>Triton X-100 wässrige Lösung (10%)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>11332481001</td><td>Verdünnung in PBS für Zellpermeabilisierungspuffer</td></tr><tr><td>Trypsin-EDTA Lösung 10X</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>59418C-100ML</td><td>Verdünnung in PBS zur Teilung von Zellen</td></tr><tr><td>U-2 OS-Zellen</td><td>ATCC</td><td>&nbsp; HTB-96</td><td>Optimale Zelllinie für Mikroskopie-Experimente</td></tr><tr><td>Universelles Mykoplasmen-Detektionskit</td><td>ATCC</td><td>30-1012K PCR-basiertes</td><td>Mykoplasmen-Detektionskit</td></tr><tr><td>VSV-G</td><td>Addgene</td><td>#8454</td><td>Viraler Proteinhüllvektor</td></tr></tbody></table>

laser-mikrobestrahlung zur untersuchung der dna-rekrutierung während der s-phase

Laser Micro-Irradiation to Study DNA Recruitment During S Phase

Die Reparatur von DNA-Schäden erhält die genetische Integrität der Zellen in einer hochreaktiven Umgebung. Zellen können verschiedene Arten von DNA-Schäden aufgrund endogener und exogener Quellen wie Stoffwechselaktivitäten oder UV-Strahlung ansammeln. Ohne DNA-Reparatur wird der genetische Code der Zelle beeinträchtigt, was die Strukturen und Funktionen von Proteinen untergräbt und möglicherweise Krankheiten verursacht. 
Das Verständnis der raumzeitlichen Dynamik der verschiedenen DNA-Reparaturwege in verschiedenen Zellzyklusphasen ist im Bereich der DNA-Schadensreparatur von entscheidender Bedeutung. Aktuelle Fluoreszenzmikroskopie-Techniken bieten großartige Werkzeuge, um die Rekrutierungskinetik verschiedener Reparaturproteine nach DNA-Schadensinduktion zu messen. Die DNA-Synthese während der S-Phase des Zellzyklus ist ein besonderer Punkt im Zellschicksal in Bezug auf die DNA-Reparatur. Es bietet ein einzigartiges Fenster, um das gesamte Genom auf Fehler zu überprüfen. Gleichzeitig stellen DNA-Synthesefehler auch eine Bedrohung für die DNA-Integrität dar, die in nicht teilenden Zellen nicht anzutreffen ist. Daher unterscheiden sich DNA-Reparaturprozesse in der S-Phase signifikant von anderen Phasen des Zellzyklus, und diese Unterschiede sind schlecht verstanden. 
Das folgende Protokoll beschreibt die Herstellung von Zelllinien und die Messung der Dynamik von DNA-Reparaturproteinen in der S-Phase an lokal induzierten DNA-Schadensstellen mit einem laserscannenden konfokalen Mikroskop, das mit einer 405-nm-Laserlinie ausgestattet ist. Tagged PCNA (mit mPlum) wird als Zellzyklusmarker in Kombination mit einem AcGFP-markierten Reparaturprotein von Interesse (dh EXO1b) verwendet, um die DNA-Schadensrekrutierung in der S-Phase zu messen.

Zellen adressieren jede Art von DNA-Läsion auf eine bestimmte Weise, die auch davon abhängt, in welcher Zellzyklusphase sie sich befinden. Beispielsweise werden nach der Mikrobestrahlung doppelsträngige Brüche (DSB) je nach Zellzyklusphase entweder durch nicht-homologe Endfügung (NHEJ) oder HR verarbeitet. Nukleasen, die während der S- und G2-Phasen des Zellzyklus am stärksten wirken, erzeugen DNA-Überhänge, die für die richtige HR entscheidend sind. Um die Bewertung von Zellen in der S-Phase zu fördern, wurde PCNA als einfarbiger Zellzyklusmarker eingesetzt. Abbildung 1A zeigt das Lokalisierungsprofil von mPlum-PCNA während des Zellzyklusverlaufs. PCNA hat eine völlig homogene Verteilung im Kern in der G1- und G2-Phase (während es auch weitgehend von den Nukleoli ausgeschlossen ist). In der S-Phase lokalisiert PCNA an Stellen der DNA-Replikation, die als helle Flecken im Zellkern visualisiert werden können. In frühen S-Phasenzellen sind die Flecken relativ klein und gleichmäßig im Zellkern verteilt. Im Verlauf der mittleren S-Phase verschwimmen die Flecken und lokalisieren sich mehr in Richtung des Umfangs des Kerns und der Nukleoli. In der späten S-Phase verringern sich die Flecken in der Anzahl, werden aber immer größer, da sich PCNA an späten Replikationsstellen konzentriert (Abbildung 1B). Wichtig ist, dass die exogene PCNA-Expression aus dem pBABE-Vektor-Rückgrat geringer war als die endogenen Werte, aber für den Nachweis durch Mikroskopie ausreichte, was potenzielle Artefakte in der Zellzyklusprogression und DDR minimiert. Abbildung 1C zeigt das Ausmaß der PCNA-Überexpression im Vergleich zu endogenen Werten. Bitte beachten Sie, dass das Band, das mPlum-PCNA entspricht, aufgrund seiner größeren Größe langsamer migriert.
Unser Ziel war es, DSBs während der Mikrobestrahlung einzuführen, um die PARP1/2-abhängige Rekrutierung von EXO1b für diese Läsionen in der S-Phase zu untersuchen. Abbildung 2A zeigt, dass niedrige Energiedosen (1000 μs Verweilzeit) nicht die Rekrutierung von EGFP-FBXL10, einem DSB-Responder (Bestandteil des FRUCC-Komplexes 8),induzieren, während es ausreichte, um die Rekrutierung von NTHL1-mCherry, einem Base Excision Repair (BER) Pathway Protein, zu induzieren, das an Stellen oxidativer DNA-Schädenrekrutiert 10,11,12. Bei einer Verweilzeit von 3000 μs rekrutieren sowohl EGFP-FBXL10 als auch NTHL1-mCherry und demonstrieren eine Laserleistung, die sowohl oxidative Läsionen als auch DSBs erzeugt. Um diese Ergebnisse zu verstärken, zeigt Abbildung 2B eine Immunfluoreszenzfärbung gegen γH2A.X (DSB-Marker), die bei Verwendung höherer Energiedosen deutlich deutlicher wird. PCNA dient sowohl als Zellzyklusmarker als auch als Marker für eine erfolgreiche Mikrobestrahlung, da es mit beiden Laserverweilzeiteinstellungen adäquat rekrutiert. Wichtig ist, dass sowohl exogene als auch /oder endogene fluoreszierende proteinmarkierte PCNA für diese Reporterfunktion verwendet werden können, da sie sich ähnlich verhalten (Abbildung 3). Endogen markierte PCNA wurde entwickelt, indem mRuby im Rahmen mit dem ersten Exon in ein Allel des PCNA-Locus13 eingefügt wurde (die Zelllinie war ein freundliches Geschenk von Jörg Mansfeld).
Abbildung 4A und Abbildung 4C zeigen die Rekrutierung von AcGFP-markiertem EXO1b in S-Phasenzellen. EXO1b erreicht etwa 1 Minute lang ein maximales Akkumulationsniveau an Mikrobestrahlungsstellen und beginnt sich danach langsam von den DNA-Läsionen zu löst. Anreicherungen an Mikrobestrahlungsstellen werden durch eine relative Fluoreszenzeinheit &gt; 1 auf der Grafik gekennzeichnet. In Gegenwart von Olaparib ist die Akkumulation von EXO1b am Laserstreifen nach 1 Minute im Vergleich zur Fahrzeugsteuerung signifikant geringer. Diese Ergebnisse stehen im Einvernehmen mit der Literatur6,7. Abbildung 4B zeigt repräsentative Regionen für die Quantifizierung (Gebiete A, B und C), wie in Nummer 6 des Protokolls beschrieben. Abbildung 4D zeigt die vergleichbaren Expressionsniveaus von endogenem EXO1b und exogenem EXO1b-AcGFP in Zellen, die für die Mikrobestrahlung verwendet werden.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62466/62466fig01.jpg"> Abbildung 1:Lokalisierungsmuster von PCNA. (A) Bilder zeigen ein Lokalisierungsmuster stabil integrierter, exogener PCNA während des gesamten Zellzyklus in U-2 OS-Zellen. (B) Bilder zeigen PCNA-Herdemuster in verschiedenen Stadien der S-Phase (früh, mittel und spät) in U-2 OS-Zellen. (C) Western Blot, der endogene und exogene PCNA-Spiegel in den für die Bildgebung verwendeten U-2-OS-Zellen zeigt. Der Maßstabsbalken entspricht 20 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62466/62466fig01large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62466/62466fig02.jpg"> Abbildung 2: Induktion von DSBs durch optimierte Laserleistung. (A) Lasereinstellungen können optimiert werden, um verschiedene Formen von DNA-Schäden zu induzieren. U-2 OS-Zellen, die sowohl EGFP-FBXL10 als auch NTHL1-mCherry stabil exprimieren, wurden verwendet, um DSBs bzw. Stellen oxidativer Läsionen zu identifizieren. Die Mikrobestrahlung mit einer 405 nm Laserlinie wurde auf asynchronen U-2 OS-Zellen mit entweder 1000 μs oder 3000 μs Verweilzeit durchgeführt. Der Schuppenbalken stellt 20 μm dar. (B) Immunfluoreszierende Färbung gegen γH2A.X wurde an menschlichen retinalen Pigmentepithelzellen (hTERT RPE-1) mit mRuby-markierter endogener PCNA durchgeführt. Die Zellen wurden 5 Minuten nach der Mikrobestrahlung mit entweder 1000 μs oder 3000 μs Verweilzeit fixiert und verarbeitet. Der Maßstabsbalken entspricht 20 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62466/62466fig02large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62466/62466fig03.jpg"> Abbildung 3: Vergleichbare Rekrutierung von endogener mRuby-PCNA und exogener mPlum-PCNA an Mikrobestrahlungsstellen bei 1000 μs oder 3000 μs Laserverweilzeit. Sowohl endogene als auch exogene markierte PCNA bilden während der S-Phase Replikationsherde. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62466/62466fig03large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62466/62466fig04.jpg"> Abbildung 4: PARP1/2-abhängige Rekrutierung von EXO1b in der S-Phase. U-2 OS-Zellen, die stabil EXO1b-AcGFP und mPlum-PCNA exprimierten, wurden mit einer 405 nm FRAP-Laserlinie unter Verwendung einer Verweilzeit von 3000 μs mikrobestrahlt. (A) Repräsentative Bilder von mikrobestrahlten Zellen zu den angegebenen Zeitpunkten nach der Vorbehandlung mit Fahrzeugkontrolle (DMSO) oder Olaparib (1 μM). Der Maßstabsbalken stellt 20 μm dar. (B) Repräsentative Bilder definierter Regionen von A-, B- und C-Bereichen für die Rekrutierungsanalyse. Der Maßstabsbalken stellt 20 μm dar. (C) Die Rekrutierungsdynamik von DNA-Schäden wurde durch Live-Zell-Bildgebung erfasst. Relative mittlere Fluoreszenzwerte und Bilder wurden alle 5 s für 12 min aufgenommen. Für jede Bedingung wurden ≥30 Zellen ausgewertet. Mittlere relative Fluoreszenzwerte (durchgezogene schwarze Linien) und Standardfehler (Bereich visualisiert durch einen schattierten Bereich) wurden gegen die Zeit aufgezeichnet. Die gestrichelte Linie zeigt Rekrutierungswerte bei 1 minute nach Mikrobestrahlung an. Der Unterschied zwischen DMSO (n=32) und Olaparib (n=31) Behandlung wurde mit einem Mann-Whitney-Test berechnet. Asterix bezeichnet S&lt;0,0001. (D) Western Blot vergleicht die Expressionsniveaus von endogenem EXO1b und exogenem EXO1b-AcGFP in Zellen, die für die Mikrobestrahlung verwendet werden. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62466/62466fig04large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.</a>

Dieses Protokoll beschreibt eine nicht-invasive Methode zur effizienten Identifizierung von S-Phasen-Zellen für nachgelagerte Mikroskopiestudien, wie z. B. die Messung der Rekrutierung von DNA-Reparaturproteinen durch Lasermikrobestrahlung.

Laser-Mikrobestrahlung zur Untersuchung der DNA-Rekrutierung während der S-Phase

DNA damage repair maintains the genetic integrity of cells in a highly reactive environment. Cells may accumulate various types of DNA damage due to both ...

Dieses Protokoll hilft, die räumliche und zeitliche Rekrutierung von DNA-Schadensreparaturproteinen unter Berücksichtigung der Zellzyklusphase zu verstehen. Zur Zellzyklusunterscheidung verwenden wir fluoreszierendes Protein-markiertes PCNA als Marker der S-Phase, die Artefakte umgeht, die durch andere Zellzyklus-Synchronisationsmethoden eingeführt wurden. Dies in Kombination mit laserbasierter Mikrobestrahlung ergibt eine beispiellose räumlich-zeitliche Auflösung der Proteinkinetik von DNA-Schäden.Die erfolgreiche routinemäßige Anwendung unseres Protokolls baut auf Grundkenntnissen der konfokalen Bildgebung auf. 24 Stunden vor der Mikrobestrahlung insgesamt acht mal 10 bis zur vierten Zellen in 500 Mikrolitern zu einem Milliliter Medium auf einem Vier-Brunnen-Deckglas plattieren. Tauschen Sie eine Stunde vor der Mikrobestrahlung das reguläre Wachstumsmedium mit einem Bildmedium aus, das entweder Olaparib oder eine Fahrzeugkontrolle wie DMSO enthält.Schalten Sie mindestens vier Stunden vor der Bildgebung die Umweltkammer und die Mikroskopkomponenten ein. Schalten Sie die Heizung, die Kohlendioxidversorgung und den Feuchtigkeitsregler ein. Initialisieren Sie Lichtquellen zusammen mit den Laserlinien mindestens eine Stunde, bevor Sie die Zellen auf das Mikroskop übertragen.Ölen Sie das Mikroskopobjektiv und legen Sie ein Kammerdeckglas unter das Mikroskop. Um S-Phasenzellen in einer asynchronen Population auszuwählen, suchen Sie durch das Okular nach dem einzigartigen Lokalisierungsmuster der mPlum-markierten PCNA in der S-Phase und wählen Sie ein Sichtfeld aus, das genügend S-Phasenzellen für die Mikrobestrahlung aufweist. Legen Sie den für die Mikrobestrahlung interessanten Bereich fest, indem Sie die zugehörige Software zum Einfügen von Binärlinien verwenden.Um die gewünschte Anzahl von Linien und Abständen festzulegen, klicken Sie auf binär, wählen Sie dann Linie, Kreis und Ellipse einfügen, um die gewünschte Anzahl von Linien zu zeichnen, konvertieren Sie diese binären Linien in Stimulations-ROIs, indem Sie auf ROI klicken, verschieben Sie binär zu ROI, klicken Sie dann mit der rechten Maustaste auf einen der ROIs und wählen Sie als Stimulations-ROI S1 verwenden. Platzieren Sie diese Linien im Sichtfeld, so dass sie durch den Zellkern gehen. Um PCNA-Herde für eine spätere Analyse zu identifizieren, nehmen Sie vor der Mikrobestrahlung ein höher aufgelöstes Bild des Sichtfeldes auf, indem Sie die erforderlichen Parameter in der kompakten A1 LFOV-GUI und den A1 LFOV-Scanbereichsfenstern einstellen, gefolgt von einem Drücken der Erfassungstaste. Um die Mikrobestrahlung einzurichten, öffnen Sie die Registerkarte ND-Stimulation und greifen Sie dann auf das Zeitplanfenster zu, um eine Reihe von Bildern vor der Stimulation und dann eine Reihe von Bildern nach der Stimulation mit den Galvano-Scannern zu erfassen.Richten Sie drei Phasen im Zeitplanfenster ein. Wählen Sie in der Erfassungs- und Stimulationsspalte Die Option Erfassung, Stimulation und Erfassung für die drei Phasen aus. Legen Sie für die Stimulationsphase S1 als ROI fest.Stellen Sie im Galvano XY-Fenster 100% Laserleistung für die 405 Nanometer Laserlinie ein und stellen Sie die Verweilzeit für die Mikrobestrahlung ein. Um timelapse imaging für das gewünschte Zeitfenster und die gewünschten Intervalle einzurichten, verwenden Sie den Zeitplan A1 LFOV compact GUI und die A1 LFOV Scanbereichsfenster. Optimieren Sie die Einstellungen für Prozentsatz, Verstärkung und Offset der Laserleistung, um das Bleichen von Fotos während der Bildgebung im kompakten GUI-Fenster von A1 LFOV zu reduzieren.Verlängern oder verkürzen Sie je nach Kinetik des Proteins das Intervall zwischen den Bildern oder die Dauer des gesamten Zeitraffers, indem Sie das gewünschte Intervall und die gewünschte Dauer für die dritte Phasenerfassungsreihe im Zeitplanfenster einstellen. Drücken Sie jetzt Ausführen, um die Mikrobestrahlung und die anschließende Zeitrafferbildgebung auszuführen. Speichern Sie am Ende der Zeitraffer-Bildgebung die Stimulations-ROIs als separate Bilder, die für die Identifizierung der Koordinaten der Mikrobestrahlung in jeder nachgeschalteten Software, die für die Analyse verwendet wird, nützlich sind.PCNA hat eine völlig homogene Verteilung im Kern in G1- und G2-Phasen. In der S-Phase lokalisiert PCNA an Stellen der DNA-Replikation, die als helle Flecken im Zellkern visualisiert werden können. In frühen S-Phasenzellen sind die Flecken relativ klein und gleichmäßig im Zellkern verteilt.Während des Fortschreitens in die mittlere S-Phase verschwimmen die Flecken und lokalisieren sich mehr in Richtung des Umfangs des Kerns und der Nukleoli. In der späten S-Phase verringern sich die Flecken in der Anzahl, werden aber immer größer, da sich PCNA an späten Replikationsstandorten konzentriert. Niedrige Energiedosen, wie 1.000 Mikrosekunden Verweilzeit, induzieren nicht die Rekrutierung von EGFP-FBXL10, einem doppelsträngigen Break-Responder, sondern reichen aus, um die Rekrutierung von NTHL1-mCherry zu induzieren, einem Basenexzisionsreparaturwegprotein, das an Stellen oxidativer DNA-Schäden rekrutiert wird.Bei einer Verweilzeit von 3.000 Mikrosekunden werden sowohl EGFP-FBXL10 als auch NTHL1-mCherry rekrutiert, was eine Laserleistung demonstriert, die sowohl oxidative Läsionen als auch doppelsträngige Brüche erzeugt. EXO1b erreicht etwa eine Minute lang ein Maximum an Akkumulations- und Mikrobestrahlungsstellen und beginnt sich dann langsam von den DNA-Läsionen zu entknügen. In Gegenwart von Olaparib ist die Akkumulation von EXO1b am Laserstreifen in einer Minute im Vergleich zur Fahrzeugsteuerung deutlich geringer.Es ist entscheidend, dass dem Mikroskop ausreichend Zeit zum Aufheizen gegeben wird und dass Kultur und Bedingungen für jedes Experiment optimal sind, um konsistente Ergebnisse zu gewährleisten. Darüber hinaus ist es wichtig, Ihre Lasereinstellungen mit verschiedenen DNA-Schadensreportern zu optimieren, um auf bestimmte DNA-Läsionen zu testen. Erwägen Sie nach der Mikrobestrahlung, die Ergebnisse mit klassischen biochemischen Methoden wie Fraktionierung, Immunpräzipitation oder ChIP zu validieren.Diese Ansätze beproben eine größere Zellpopulation und liefern so statistische Stärke.

laser-micro-irradiation-to-study-dna-recruitment-during-s-phase

Research

Forschung

JoVE Journal

Biology

Biologie

Laser werden häufig in Untersuchungen der zellulären Antwort auf DNA-Schädigung verwendet. Jedoch erzeugen sie Läsionen, deren Abstand, Frequenz und Kollisionen mit Replikationsgabeln werden selten charakterisiert. Hier beschreiben wir einen Ansatz, der die Bestimmung dieser Parameter mit Laser lokalisiert Interstrang- Vernetzungen ermöglicht.

Einzelmolekülanalyse von Laser Lokalisierte Psoralen Addukten

Laser Microirradiation ist ein nützliches Werkzeug für Studien zur DNA-Reparatur in lebenden Zellen. Ein methodischer Ansatz für die Nutzung der UVA Laser induzieren verschiedene DNA-Läsionen wird angezeigt. Wir haben eine Methode zur lokalen Microirradiation optimiert, die den normalen Zellzyklus unterhält; so fahren Sie bestrahlte Zellen durch Mitose.

Fortgeschrittene Mikroskopiertechniken der konfokalen zur Untersuchung von Protein-Protein-Wechselwirkungen und die Kinetik bei DNA-Läsionen

Das Ziel dieses Protokolls ist zu beschreiben, wie Laser Microirradiation verwenden, um verschiedene Arten von DNA-Schäden, einschließlich der relativ einfachen Strangbrüche und komplexen Schäden an DNA-Schäden Signal- und Reparatur Faktor Montage an Schaden Standorten in-vivo Studie zu induzieren .

Laser Microirradiation In Vivo zellulären Reaktionen auf einfache und komplexe DNA-Schäden zu studieren

Konfokale Fluoreszenz-Mikroskopie und Laser Mikro-Bestrahlung Angebot Werkzeuge für die Induktion von DNA-Schäden und die Reaktion der DNA-Reparatur-Proteine in ausgewählten Bereichen der Sub-atomaren Überwachung. Diese Technik hat deutlich erweiterte unsere Kenntnisse der Schaden-Erkennung, Signalisierung und Rekrutierung. Diese Handschrift zeigt diese Technologien, um Einzel- und Doppelzimmer Strang Pause Reparatur zu prüfen.

Anwendung von Mikro-Laserbestrahlung zur Prüfung von einzelnen und doppelt Strand Break Repair in Säugerzellen

DNA-Schäden reparieren Kinetik Studium erfordert ein System zur Läsionen an definierte Sub-atomaren Regionen zu induzieren. Wir beschreiben eine Methode zum Erstellen von lokalisierter Doppelstrang-Pausen mit einem konfokale Laserscanning-Mikroskop ausgestattet mit einem 405 nm-Laser und bieten automatisierte Verfahren zur Quantifizierung der Dynamik der Reparatur Faktoren bei dieser Läsionen.

Untersuchung von Protein-Rekrutierung, DNA-Läsionen mit 405 Nm Micro-Laserbestrahlung

Testen visuelle Empfindlichkeit in Echsen mit einem operante Konditionierung, die Video-Wiedergabe von random-dot kinematograms und computer-generierte Wirbellosen beschäftigt.

Testen visueller Sensibilität für die Geschwindigkeit und Richtung der Bewegung in Lizards

GFP-Fusionsproteine ​​sind weit verbreitet, um Organellen durch konfokale Mikroskopie sichtbar zu machen. Allerdings Screening auf Mutationen, die die Morphologie der Organellen beeinflussen erfordert in der Regel individuelle Mutagenese und zeitaufwändig ist. Hier zeigen wir eine Methode, um gleichzeitig aufzunehmen Organellen-GFP-Marker in fast 5.000 Nicht-essentielle Gene in Hefe.

Ein High-Throughput-Verfahren zur global Studie der Organellen-Morphologie in S. cerevisiae

Ein detailliertes Protokoll ist für die Darstellung der Echtzeit Bildung von DNA-Reparatur-Komplexe...

Imaging Mismatch Reparatur und zellulären Reaktionen auf DNA-Schäden in Bacillus subtilis</em

Akute Nierenschädigung (AKI) in den Menschen ist ein bekanntes klinisches Problem durch eine Schädigung der Epithelzellen, die Nieren Nephrone umfassen verursacht und AKI ist mit hohen Sterblichkeitsraten von 50-70% 1 verbunden. Nach epithelialen Zell-Zerstörung, haben Nephronen eine begrenzte Fähigkeit zur Regeneration, obwohl die Mechanismen und Einschränkungen, die dieses Phänomen Führung schlecht bleiben verstanden. In diesem Video-Beitrag beschreiben wir unsere Technik für die gezielte...

Laser Ablation des Zebrafisch Vorniere auf Study Renal Epithelregeneration

Hier beschreiben wir die Instrumentierung und Verfahren zum Nachweis einzelner fluoreszenzmarkierten Proteinmoleküle in Wechselwirkung mit einem einzelnen DNA-Molekül zwischen den zwei optisch eingeschlossene Mikrokügelchen suspendiert.

Die Kombination von Einzelmolekül-Imaging und Manipulation für das Studium der Protein-DNA-Wechselwirkungen

Lernen Sie die Laser-Mikrobestrahlung zur Analyse der DNA-Reparaturprotein-Rekrutierung während der S-Phase in lebenden Zellen. Diese Methode ermöglicht hochauflösende, phasenspezifische Untersuchungen.

Laser-Mikrobestrahlung zur Untersuchung der DNA-Rekrutierung während der S-Phase

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