Name: Modellierung der Auswirkungen von hämodynamischem Stress auf zirkulierende Tumorzellen mit Spritze und Nadel (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-04-27T14:30:00.000+00:00
Duration: 5 min 49 s
Description: Lernen Sie eine Methode zur Modellierung hämodynamischen Stresses auf zirkulierende Tumorzellen mittels Spritze und Nadel. Dieses Verfahren ermöglicht die Untersuchung von Krebszellviabilität unter mechanischer Belastung.

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Die Entwicklung des hier gezeigten Modells wurde durch den DOD-Zuschuss W81XWH-12-1-0163, den NIH-Zuschüssen R21 CA179981 und R21 CA196202 sowie den Sato Metastasis Research Fund unterstützt.

1. Zellvorbereitung
<ol><li>Setzen Sie Zellen aus der Gewebekulturschale frei, wenn 70-90% konfluent sind, indem Sie die empfohlenen Richtlinien für die verwendete Zelllinie befolgen.<ol>
<li>Zum Beispiel das Wachstumsmedium für PC-3-Zellen absaugen und die 10 cm große Zellschale mit 5 ml kalzium- und magnesiumfreier phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS) waschen.</li>
		<li>Saugen Sie das PBS ab, bevor Sie 1 ml 0,25% Trypsin unter Verwendung des Herstellerprotokolls hinzufügen.</li>
		<li>Nachdem Sie die Ablösung der Zellen unter einem invertierten Mikroskop beobachtet haben, fügen Sie 5 ml DMEM: F12-Medium hinzu, das 10% fetales Rinderserum enthält, um das Trypsin zu hemmen.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Legen Sie die Zellsuspension in ein konisches Rohr.</li>
	<li>Bestimmen Sie die Zellkonzentration und die Gesamtzellzahl.</li>
	<li>Pelletzellen durch Zentrifugation (300 × g für 3 min), saugen den Überstand an und resuspendieren Zellen in serumfreiem Gewebekulturmedium auf 5 × 105 Zellen/ml. HINWEIS: Es ist wichtig, dass das Assay-Medium mindestens 1,17 mM Ca++ enthält, da extrazelluläres Ca++ für die zelluläre Resistenz gegen FSS15nachgewiesen wurde.</li>
</ol>2. Belastungsbelastung durch Flüssigkeitsscherung
<ol><li>Bevor Sie die Zellen FSS aussetzen, schneiden Sie ein rundes 14-ml-Polystyrolrohr an der 7-ml-Linie. Mischen Sie die Zellsuspension, legen Sie 5 ml der Suspension in das geschnittene Rohr und sammeln Sie statische Kontrollproben. HINWEIS: Das für die statische Probe erforderliche Volumen hängt vom verwendeten Lebensfähigkeitstest ab (siehe Schritt 3).</li>
	<li>Ziehen Sie die Zellsuspension in eine 5-ml-Spritze und befestigen Sie eine 30 G 1/2"-Nadel. Entkappen Sie die Nadel, legen Sie die Spritze auf eine Spritzenpumpe, befestigen Sie die Spritze und stellen Sie die Durchflussrate ein, um das gewünschte FSS-Niveau zu erreichen. HINWEIS: Tabelle 1 zeigt die maximale Wandscherspannung für verschiedene Nadeln und Durchflussraten sowie den minimalen FSS-Gehalt in Abhängigkeit von der Zellgröße (10, 15 und 20 μm). Untersuchen Sie die Nadel vor dem Gebrauch, um sicherzustellen, dass sie nicht verbogen ist. Wenn Sie unsicher sind, ersetzen Sie die Nadel durch eine neue. Die Integrität der Nadel kann erhebliche Auswirkungen auf das Niveau des angewendeten FSS haben.</li>
	<li>Führen Sie die Spritzenpumpe aus und sammeln Sie die scherte Probe im geschnittenen Röhrchen in einem Winkel von etwa 45 °, um das Schäumen zu reduzieren. Sammeln Sie eine Probe, abhängig von der Art des Lebensfähigkeitstests oder den nachgelagerten Assay-Anforderungen.<ol>
<li>Entfernen Sie vorsichtig die Spritze und die Nadel aus der Spritzenpumpe und entfernen Sie die Nadel mit einer Zange aus der Spritze, wobei Sie darauf achten, die Nadel nicht zu berühren. HINWEIS: Nicht abgeschränkte Nadeln können als zusätzliche Sicherheitsmaßnahme austauschbar mit abgeschränkten Nadeln verwendet werden.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Ziehen Sie die scherte Suspension zurück in die Spritze, befestigen Sie die Nadel vorsichtig mit einer Zange und legen Sie sie wieder in die Spritzenpumpe.</li>
	<li>Wiederholen Sie die Schritte 2.3 und 2.4, bis die Zellsuspension der gewünschten Anzahl von FSS-Impulsen ausgesetzt wurde. HINWEIS: Um die Fähigkeit der Zellen zu beurteilen, der mechanischen Zerstörung durch FSS-Exposition zu widerstehen, wird die Zellsuspension typischerweise 10 FSS-Impulsen ausgesetzt. Es wurde jedoch gezeigt, dass Zellen nach 2 Impulsen24als Reaktion auf FSS biologische Anpassungen durchlaufen.</li>
</ol>3. Messung der Lebensfähigkeit
HINWEIS: Die Lebensfähigkeit kann mit enzymatischen Assays (Luciferase, Resazurin und WST-1), der Zählung intakter Zellen, der Durchflusszytometrie oder durch klonogene Assays beurteilt werden.
<ol><li>Für alle Messungen der Lebensfähigkeit, sammeln Sie eine Probe, bevor Sie Zellen FSS aussetzen.<ol>
<li>Für enzymatische Assays nehmen Sie doppelte 100 μL Aliquoten und legen Sie sie in eine 96-Well-Platte.</li>
		<li>Für die Durchflusszytometrie nehmen Sie ein 500 μL Aliquot und legen Es in ein 1,5 ml Röhrchen.</li>
		<li>Für den clonogenen Assay sammeln Sie ein Aliquot von 100 μL.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Enzymatischer Assay<ol>
<li>Sammeln Sie 100 μL-Proben nach 1, 2, 4, 6, 8 und 10 Impulsen FSS-Exposition und legen Sie sie in eine 96-Well-Platte.</li>
		<li>Fügen Sie das gewünschte Substrat hinzu und befolgen Sie das Protokoll für den verwendeten Assay:<ol>
<li>Für Resazurin werden 20 μL einer 0,15 mg/ml Lösung zu jeder Vertiefung hinzugefügt. 20 μL 0,15 mg/ml Resazurinlösung werden in Vertiefungen mit 100 μL Medium allein hinzugefügt. 2 h in einem 37 °C Gewebekultur-Inkubator inkubieren. Messen Sie die Absorption mit einem Plattenleser, der Fluoreszenz ablesen kann (579 Anregung / 584 Emission).</li>
			<li>Für Luciferase-exprimierende Zellen 100 μL 15 mg/ml D-Luciferin zu 5 ml Medium hinzufügen. Fügen Sie 100 μL dieser Lösung zu jeder Vertiefung hinzu, die Zellen enthält. Warten Sie 5 Minuten und lesen Sie dann die Platte mit einem Lesegerät, das mit Lumineszenz kompatibel ist.</li>
			<li>Für WST-1 fügen Sie 10 μL WST-1 zu jeder Vertiefung hinzu, einschließlich Vertiefungen, die nur Medium enthalten. 4 h inkubieren und dann die Absorption zwischen 420 und 480 nm mit einem Plattenleser ablesen.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Vergleichen Sie das gemittelte Signal von jeder der FSS-exponierten Proben mit der gemittelten statischen Kontrollprobe, um den Prozentsatz der lebensfähigen Zellen zu erhalten.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Durchflusszytometrie24<ol>
<li>Sammeln Sie 500 μL-Proben und legen Sie sie nach 1, 2, 5 und 10 FSS-Impulsen in 1,5-ml-Zentrifugenröhrchen.</li>
		<li>Zentrifugenproben (500 × g für 3 min) und entsorgen Sie die Überstände.</li>
		<li>Die Pellets mit 1 ml calcium- und magnesiumfreiem PBS resuspendieren und die Proben zentrifugieren (300 × g für 3 min).</li>
		<li>Suspendieren Sie die Pellets mit 500 μL fluoreszenzaktiviertem Zellsortierpuffer (FACS) (PBS mit 0,5% Rinderserumalbumin und 0,1% Natriumazid) mit Zählperlen und membrandurchlässigen oder Lebensfähigkeitsfarbstoffen wie Propidiiumiodid (1,75 μg/ml).</li>
		<li>Bestimmen Sie die Lebensfähigkeit, indem Sie das Verhältnis von lebensfähigen Zellen, normalisiert auf Zählperlen, in gescherten Proben mit dem der statischen Probe vergleichen.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Clonogener Assay<ol>
<li>Nehmen Sie 100 μL der statischen Probe und fügen Sie 900 μL Wachstumsmedium hinzu, um eine 1:10-Verdünnung herzustellen.</li>
		<li>Nehmen Sie 100 μL der 1:10 verdünnten Probe und fügen Sie 900 μL Wachstumsmedium hinzu, um eine endgültige 1:100-Verdünnung zu erzielen.</li>
		<li>100 μL der 1:100-Verdünnungsprobe werden in jede der 3 Vertiefungen einer 6-Well-Schale mit 2 ml Wachstumsmedium geben.</li>
		<li>Wiederholen Sie die Schritte 3.4.1-3.4.3 mit Proben, die 10 FSS-Impulsen ausgesetzt wurden.</li>
		<li>Lassen Sie die Zellen 7-10 Tage lang wachsen, ohne das Medium zu wechseln, und überprüfen Sie die Koloniebildung. Sobald sich Kolonien von ≥50 Zellen gebildet haben, saugen Sie das Wachstumsmedium an, spülen Sie jedes Gut mit 1 ml PBS, saugen Sie das PBS an und fixieren Sie es für 5 minuten mit 1 ml eiskaltem 70% Ethanol (EtOH). Wichtig ist, dass Sie sowohl gescherte als auch statische Proben gleichzeitig reparieren</li>
		<li>Nach dem Fixieren der Proben das EtOH absaugen und 1 bis 2 mL kristallviolette Lösung (0,1% kristallviolett in 90%H2O, 10% EtOH) für 5 min hinzufügen.</li>
		<li>Mit einem Überschuss an Wasser abspülen und den Teller trocknen lassen</li>
		<li>Zählen Sie die Kolonien (Cluster von ≥50 Zellen) sowohl für die statischen als auch für die gescherten Proben. Vergleichen Sie das Verhältnis der durchschnittlichen Anzahl der Kolonien aus der gescherten Probe mit der durchschnittlichen Anzahl der Kolonien aus der statischen Probe, um die Lebensfähigkeit zu bestimmen.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

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<li>Li, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Shear+stress+promotes+anoikis+resistance+of+cancer+cells+via+caveolin-1-dependent+extrinsic+and+intrinsic+apoptotic+pathways%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cellular+Physiology%22%5BJournal%5D)">Shear stress promotes anoikis resistance of cancer cells via caveolin-1-dependent extrinsic and intrinsic apoptotic pathways.</a> Journal of Cellular Physiology. 234 (4), 3730-3743 (2019).</li>
<li>Xin, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanics+and+actomyosin-dependent+survival%2Fchemoresistance+of+suspended+tumor+cells+in+shear+flow%5BTitle%5D)+AND+%22Biophysical+Journal%22%5BJournal%5D)">Mechanics and actomyosin-dependent survival/chemoresistance of suspended tumor cells in shear flow.</a> Biophysical Journal. 116 (10), 1803-1814 (2019).</li>
</ol>

MDH ist Mitbegründer, Präsident und Aktionär von SynderBio, Inc. DLM ist Berater für SynderBio, Inc.

Dieses Papier demonstriert die Anwendung von FSS auf Krebszellen in Suspension mit einer Spritze und einer Nadel. Mit diesem Modell wurde gezeigt, dass Krebszellen resistenter gegen kurze Pulse von High-Level-FSS im Vergleich zu nicht transformierten Epithelzellensind 15,22,24. Darüber hinaus führt die Exposition gegenüber FSS unter Verwendung dieses Modells zu einem schnellen Anstieg der Zellsteifigkeit, Aktivierung von RhoA un...

Metastasierung oder die Ausbreitung von Krebs über die ursprüngliche Tumorstelle hinaus ist ein Hauptfaktor, der der Krebsmortalitätzugrunde 1. Während der Metastasierung nutzen Krebszellen das Kreislaufsystem als Autobahn, um sich an entfernte Stellen im ganzen Körper zu verbreiten2,3. Auf dem Weg zu diesen Stellen existieren zirkulierende Tumorzellen (CTCs) in einer dynamischen flüssigen Mikroumgebung, die sich von der ihres ursprünglichen Primärtumors3,4,5 entiert. Es wurde vorgeschlagen, dass diese flüssige Mikroumgebung eine von vielen Barrieren für Metastasierungen ist4. Es besteht weitgehende Übereinstimmung im Konzept der metastatischen Ineffizienz, d.h. dass die meisten CTCs, die in den Kreislauf gelangen, entweder zugrunde gehen oder keine produktiven metastatischen Kolonien bilden6,7,8. Warum Metastasen aus Sicht eines einzelnen CTC ineffizient sind, ist jedoch weniger sicher und bleibt ein aktives Untersuchungsgebiet. CTCs werden von der extrazellulären Matrix losgelöst, von löslichen Wachstums- und Überlebensfaktoren beraubt, die im Primärtumor vorhanden sein können, und dem Immunsystem und den hämodynamischen Kräften auf eine ganz andere Weise ausgesetzt als im Primärtumor4. Jeder dieser Faktoren kann zum schlechten Überleben von CTCs beitragen, aber ihre relativen Beiträge sind unklar. Dieser Beitrag befasst sich mit der Frage, wie hämodynamische Kräfte CTCs beeinflussen.
Die Untersuchung der Auswirkungen hämodynamischer Kräfte auf CTCs ist eine ziemliche Herausforderung. Derzeit gibt es keine entwickelten In-vitro-Systeme, die die gesamte raumzeitliche Dynamik (Herz zu Kapillaren) und rheologischen Eigenschaften des menschlichen Gefäßsystems replizieren können. Darüber hinaus ist nicht ganz klar, wie CTCs das Kreislaufsystem erleben. Experimentelle Beweise deuten darauf hin, dass die meisten Krebszellen nicht kontinuierlich wie Blutzellen zirkulieren. Vielmehr werden die meisten CTCs aufgrund ihrer relativ großen Größe (10-20 μm Durchmesser) für variable Zeiträume (s bis Tage) in Kapillarbetten (6-8 μm Durchmesser) gefangen, wo sie sterben, extravasieren oder in das nächste Kapillarbett 8,9,10,11verschoben werden können . Es gibt jedoch Hinweise darauf, dass die CTC-Größe in vivo heterogener sein kann und dass kleinere CTCs nachweisbar sind12. Daher können CTCs basierend auf Entfernung und Blutflussgeschwindigkeit nur für eine Frage von Sekunden zwischen diesen Einklemmungsperioden frei zirkulieren, obwohl eine quantitative Beschreibung dieses Verhaltens fehlt13.
Darüber hinaus können CTCs je nachdem, wo SIE in den Kreislauf gelangen, mehrere Kapillarbetten in der Lunge und anderen peripheren Stellen sowie durch das rechte und linke Herz passieren, bevor sie ihr endgültiges Ziel erreichen. Auf dem Weg sind CTCs verschiedenen hämodynamischen Belastungen ausgesetzt, einschließlich Flüssigkeitsscherspannung (FSS), Druckkräften während ihres Einklemmens in der Mikrozirkulation und möglicherweise Zugkräften unter Umständen, unter denen sie leukozytenartiges Rollen entlang der Blutgefäßwände aufweisen könnten14. Somit ist sowohl die Fähigkeit, die Zirkulation zu modellieren, als auch das Verständnis des zu modellierenden CTC-Verhaltens begrenzt. Aufgrund dieser Unsicherheit sollten alle Erkenntnisse aus In-vitro-Modellsystemen in einem experimentellen Wirbeltierorganismus und letztendlich bei Krebspatienten validiert werden.
Mit den oben genannten Vorbehalten zeigt dieses Papier ein relativ einfaches Modell, um FSS auf Zellen in Suspension anzuwenden, um die Auswirkungen von FSS auf CTCs zu untersuchen, die erstmals 2012 beschriebenwurden 15. FSS resultiert aus der Reibung des Blutflusses gegen die Gefäßwand, die unter Bedingungen der laminaren Strömung in größeren Gefäßen einen parabolischen Geschwindigkeitsgradienten erzeugt. Zellen erfahren höhere FSS-Spiegel in der Nähe von Gefäßwänden und niedrigere Werte in der Nähe der Mitte des Blutgefäßes. Flüssigkeitsviskosität, Durchflussrate und Abmessungen der Leitung, durch die die Strömung erfolgt, beeinflussen FSS, wie in der Hagen-Poiseuille-Gleichung beschrieben. Dies gilt für Blutströme, die sich wie Newtonsche Flüssigkeiten verhalten, gilt jedoch nicht für die Mikrozirkulation. Physiologische FSS erstreckt sich über mehrere Größenordnungen mit den niedrigsten Werten in der Lymphe (<1 dyn/cm2) und den höchsten in Regionen um Herzklappen und atherosklerotische Plaques (>500 dyn/cm2)5. Die mittlere Wandscherspannung in den Arterien beträgt 10-70 dyn/cm2 und 1-6 dyn/cm2 in den Venen16,17.
Im Herzen können Zellen turbulenten Strömungen um Klappenblättchen ausgesetzt sein, wo sehr hohe, aber sehr kurze Dauer FSS auftreten kann18,19. Obwohl das Bioprozessfeld seit langem die Auswirkungen von FSS auf Säugetierzellen in Suspension untersucht, können diese Informationen für das Verständnis der Auswirkungen von FSS auf CTCs von begrenztem Wert sein, da sie sich im Allgemeinen auf viel niedrigere FSS-Spiegel konzentrieren, die über eine lange Dauer angewendet werden20. Wie unten beschrieben, kann man mit einer Spritze und einer Nadel relativ hohe (zehn bis tausend dyn/cm2)FSS für eine relativ kurze (Millisekunden) Dauer auf eine Zellsuspension auftragen. Seit der ersten Beschreibung dieses Modells15haben andere es verwendet, um die Auswirkungen von FSS auf Krebszellen21,22,23zu untersuchen. Mehrere "Impulse" von FSS können in kurzer Zeit auf Zellsuspensionen angewendet werden, um nachgelagerte experimentelle Analysen zu erleichtern. Zum Beispiel kann dieses Modell verwendet werden, um die Fähigkeit von Zellen zu messen, mechanischer Zerstörung durch FSS zu widerstehen, indem die Zelllebensfähigkeit in Abhängigkeit von der Anzahl der angewendeten Impulse gemessen wird. Alternativ können die Auswirkungen der FSS-Exposition auf die Biologie von Krebszellen untersucht werden, indem Zellen für eine Vielzahl von nachgelagerten Analysen gesammelt werden. Wichtig ist, dass ein Teil der Zellsuspension als statische Kontrolle reserviert ist, um die Auswirkungen von FSS mit denen zu vergleichen, die mit Zellablösung und Zeit in Suspension verbunden sein könnten.

<table><tbody><tr><td>0,25 % Trypsin</td><td>Gibco</td><td>25200-056</td><td></td></tr><tr><td>14 mL Röhrchen mit rundem Boden</td><td>Falcon - Corning</td><td>352059</td><td></td></tr><tr><td>30 G 1/2" Nadel</td><td>BD</td><td>305106</td><td></td></tr><tr><td>5 mL Spritze</td><td>BD</td><td>309646</td><td></td></tr><tr><td>96-Well-Platte mit schwarzem Boden</td><td>Costar - Corning</td><td>3915</td><td></td></tr><tr><td>Biolumineszenzdetektor</td><td>AMI</td><td>AMI HTX</td><td></td></tr><tr><td>BSA, Fraktion V</td><td>Sigma</td><td>10735086001</td><td></td></tr><tr><td>Zelltiter Blau</td><td>Promega</td><td>G8081</td><td></td></tr><tr><td>Kristallviolett</td><td>Sigma</td><td>C0775</td><td></td></tr><tr><td>D-Luciferin</td><td>GoldBio</td><td>D-LUCK</td><td></td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Gibco</td><td>11965-092</td><td></td></tr><tr><td>FBS</td><td>Atlanta Biologicals</td><td>S11150</td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>Gibco</td><td>10010023</td><td></td></tr><tr><td>Plattenleser</td><td>BioTek</td><td>Synergy HT</td><td></td></tr><tr><td>Natriumazid (NaN3)</td><td>Sigma</td><td>S2002</td><td></td></tr><tr><td>Spritzenpumpe</td><td>Harvard Gerät</td><td>70-3005</td><td></td></tr></tbody></table>

modellierung der auswirkungen von hämodynamischem stress auf zirkulierende tumorzellen mit spritze und nadel

Modeling the Effects of Hemodynamic Stress on Circulating Tumor Cells using a Syringe and Needle

Während der Metastasierung erhalten Krebszellen aus festem Gewebe, einschließlich Epithelien, Zugang zum lymphatischen und hämatogenen Kreislauf, wo sie aufgrund des hämodynamischen Flusses mechanischem Stress ausgesetzt sind. Eine dieser Belastungen, die zirkulierende Tumorzellen (CTCs) erfahren, ist der Flüssigkeitsscherstress (FSS). Während Krebszellen aufgrund des interstitiellen Flusses niedrige FSS-Spiegel im Tumor erfahren können, sind CTCs ohne extrazelluläre Matrixbindung viel höheren FSS-Spiegeln ausgesetzt. Physiologisch liegt FSS über 3-4 Größenordnungen, wobei niedrige Konzentrationen in Lymphgefäßen vorhanden sind (<1 Dyne / cm2) und die höchsten Werte kurz vorhanden sind, wenn Zellen durch das Herz und um Herzklappen gehen (>500 Dynen / cm2). Es gibt einige In-vitro-Modelle, die entwickelt wurden, um verschiedene Bereiche physiologischer Scherspannung über verschiedene Zeiträume zu modellieren. Dieser Artikel beschreibt ein Modell zur Untersuchung der Folgen von kurzen (Millisekunden-) Pulsen von High-Level-FSS auf die Krebszellbiologie mit einem einfachen Spritzen- und Nadelsystem.

Eine erhöhte Resistenz gegen FSS-induzierte mechanische Zerstörung hat sich zuvor als konservierter Phänotyp über mehrere Krebszelllinien und Krebszellen, die frisch aus Tumoren isoliert wurden, im Vergleich zu nicht transformierten Epithelzellkomparatorenerwiesen 15,24. Hier wurden zusätzliche Krebszelllinien aus einer Vielzahl von Gewebeursprüngen (Tabelle 2) getestet, um zu zeigen, dass die Mehrheit dieser Zellen nach 10 FSS-Pulsen bei 250 μL/...

Hier demonstrieren wir eine Methode, um flüssigen Scherstress auf Krebszellen in Suspension anzuwenden, um die Auswirkungen von hämodynamischem Stress auf zirkulierende Tumorzellen zu modellieren.

Modellierung der Auswirkungen von hämodynamischem Stress auf zirkulierende Tumorzellen mit Spritze und Nadel

During metastasis, cancer cells from solid tissues, including epithelia, gain access to the lymphatic and hematogenous circulation where they are exposed ...

Dieses Protokoll setzt Krebszellen in einer Suspension kurzen Impulsen von Flüssigkeitsscherstress aus, um bestimmte Aspekte davon nachzuahmen, wie metastasierende Krebszellen hämodynamischen Kräften ausgesetzt sind, während sie sich im Kreislaufsystem befinden. Es ist eine relativ einfache Technik, kurze Impulse mit hoher Flüssigkeitsscherspannung anzuwenden. Wenn Sie dieses Protokoll versuchen, seien Sie vorsichtig mit unverschlossenen Nadeln und biegen Sie sie nicht, da dies die angewendete Kraftscherspannung ändert.Dieses Verfahren kann Aerosole erzeugen, also verwenden Sie geeignete Sicherheitsmaßnahmen. Geben Sie zunächst 70 bis 90% konfluente PC3-Zellen aus der Gewebekulturschale frei, indem Sie das Wachstumsmedium absaugen und die 10-Zentimeter-Schüssel mit fünf Millilitern Kalzium und magnesiumfreiem PBS waschen. Dann saugen Sie das PBS an und fügen Sie einen Milliliter 0,25% Trypsin hinzu.Beobachten Sie nach der Trypsinisierung die Ablösung der Zellen unter einem umgekehrten Mikroskop. Um das Trypsin zu hemmen, fügen Sie fünf Milliliter DMEM / F12-Medium hinzu, das 10% FBS enthält. Als nächstes legen Sie die Zellsuspension in ein konisches Röhrchen und bestimmen die Zellkonzentration und die Gesamtzellzahl.Zentrifugieren Sie die Zellsuspension bei 300 x g für drei Minuten, saugen Sie dann den Überstand an und resuspendieren Sie das Pellet in einem serumfreien Gewebekulturmedium. Schneiden Sie den Boden des 14-Milliliter-Polystyrolrohrs an der Sieben-Milliliter-Linie um und legen Sie die Mischzellsuspension in das geschnittene Rohr. Sammeln Sie separat statische Kontrollproben von Zellen vor der Belastung durch Flüssigkeitsscherstress, um sie für die Durchführung von Assays zu verwenden.Um die verbleibende Zellsuspensionsprobe einer Flüssigkeitsscherspannung auszusetzen, ziehen Sie die Zellsuspension in eine Fünf-Milliliter-Spritze und befestigen Sie eine 30-Gauge-Halbzollnadel. Legen und befestigen Sie die Spritze mit einer unverschlossenen Nadel auf einer Spritzenpumpe und stellen Sie die Durchflussrate ein, um die gewünschte Flüssigkeitsscherspannung zu erreichen. Führen Sie die Spritzenpumpe aus und sammeln Sie die scherte Probe im geschnittenen Röhrchen in einem Winkel von etwa 45 Grad, um das Schäumen zu reduzieren.Entfernen Sie die Spritze vorsichtig von der Spritzenpumpe und entfernen Sie die Nadel mit einer Zange, wobei Sie darauf achten, sie nicht zu berühren. Wiederholen Sie den Vorgang, bis die Zellsuspension der gewünschten Anzahl von Impulsen der Flüssigkeitsscherspannung ausgesetzt wurde. Führen Sie Lebensfähigkeitstests mit den statischen Proben durch, bevor Die Zellen einer Flüssigkeitsscherspannung ausgesetzt werden.Für enzymatische Assays werden 100 Mikroliter Aliquoten aus den statischen Proben dupliziert in eine 96-Well-Platte übertragen. Sammeln Sie dann 100 Mikroliter Proben nach Der Belastung durch Flüssigkeitsscherung und legen Sie sie in eine 96-Well-Platte. Fügen Sie 20 Mikroliter einer Resazurinlösung von 0,15 Milligramm pro Milliliter zu jeder Probenbohrung und zu Vertiefungen mit 100 Mikrolitern Medium allein hinzu.Inkubieren Sie die Wellplatten zwei Stunden lang im 37 Grad Celsius gewebekulturellen Inkubator, messen Sie dann die Fluoreszenz und Absorption mit einem Plattenleser und erhalten Sie den Prozentsatz der lebensfähigen Zellen, indem Sie das durchschnittliche Signal von jeder der Flüssigkeitsscherstress-exponierten Proben mit der durchschnittlichen bis statischen Kontrollprobe vergleichen. Sammeln Sie in ähnlicher Weise Aliquoten aus statischen Proben, um Durchflusszytometrie und klonogene Assays durchzuführen, wie im Textmanuskript beschrieben. In der repräsentativen Analyse wurde die Lebensfähigkeit von syngenen Biopsie-Brustepithelkrebszellen mit Hilfe der Resazurin-Umwandlung beurteilt, nachdem Zellen einer Reihe von Flüssigkeitsscherstressimpulsen ausgesetzt wurden.Obwohl jede Zelllinie unterschiedliche Widerstandsprofile aufwies, gab es nach 10 Impulsen der Flüssigkeitsscherstressbelastung keinen signifikanten Unterschied in der Lebensfähigkeit. Zusätzliche Krebszelllinien aus einer Vielzahl von Gewebeursprüngen zeigten die Lebensfähigkeit von mehr als 20% nach 10 Impulsen von Flüssigkeitsscherstress, mit Ausnahme von MIA PaCa-2-Zellen, die aufgrund der Empfindlichkeit gegenüber mechanischer Zerstörung durch Flüssigkeitsscherstress eine Lebensfähigkeit von weniger als 10% zeigten. Wenn Sie die statische Probe vor dem Auftragen der Scherspannung der Flüssigkeiten sammeln, stellen Sie sicher, dass die Zellsuspension homogen gemischt ist.Entfernen Sie die Nadel vorsichtig mit einer Zange und biegen oder berühren Sie die Nadel nicht. Neben der Messung der Zelllebensfähigkeit kann man Veränderungen in der Genexpression, Zellsignalisierung, Proliferation und Migration bewerten. Anhand dieses Modells für die Exposition gegenüber Flüssigkeitsscherstress kann man sowohl untersuchen, wie Krebszellen der Zerstörung durch Flüssigkeitsscherstress widerstehen, als auch die Auswirkungen von Flüssigkeitsscherstress auf die Biologie von Krebszellen bewerten.Diese Technik wurde von unserem Labor und anderen verwendet, um die Auswirkungen von Flüssigkeitsscherstress auf zirkulierende Tumorzellen zu untersuchen. Diese Studien haben gezeigt, dass Flüssigkeitsscherstress die mechanischen Eigenschaften von Krebszellen schnell verändert und dass dies zur Fähigkeit von Krebszellen beiträgt, der Zerstörung durch Flüssigkeitsscherstress zu widerstehen.

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Research

Forschung

JoVE Journal

Cancer Research

Krebsforschung

Wir präsentieren, das Verfahren für die Herstellung und den Betrieb einer mikrofluidischen Vorrichtung, die heterogene Tumor Mikroumgebungen...

Mikrofluidik-Vorrichtung für die Neuerstellung eines Tumor-Mikroumgebung<em&gt; In Vitro</em

Quelle: Lim, M., et al. Modellierung der Hirnmetastasierung durch Injektion von Krebszellen in die innere Halsschlagader. J. Vis. Exp. (2022)In diesem Video wird eine anästhesierte Maus einem chirurgischen Eingriff unterzogen, bei dem Krebszellen in die Arteria carotis communis (CCA) injiziert werden, um eine gezielte Abgabe an das Gehirn zu ermöglichen. Das Verfahren beinhaltet ein präzises Nähen und Manipulieren der Halsschlagadern, um die injizierten Zellen in Richtung der Arteria carotis...

Modellierung der Metastasierung von Hirntumoren durch Injektion von Krebszellen in die innere Halsschlagader

Wir beschreiben einen Matrigel-Plug-Assay, um das angiogene Potenzial eines Pools von Faktoren zu veranschaulichen, die von Krebszellen sezerniert werden, unter Verwendung von zwei komplementären Bildgebungsmodalitäten, Ultraschall und Endomikroskopie. Das Matrigel, ein extrazelluläres Matrix (ECM)-Imigel, wird verwendet, um den Wirt (die Maus) mit angiogenen Faktoren vertraut zu machen, die an das konditionierte Medium (C.M.) sezerniert werden.

Überwachungsfunktionen und Morphologie der Gefäßversorgung von Faktoren durch schnell wachsende Tumor erzeugende Zellen sezerniert rekrutiert

Dieses Manuskript beschreibt die Entwicklung eines Tiermodells, das es ermöglicht, die Auswirkungen von Tumorhypoxie auf die Metastasierung direkt zu testen und die Mechanismen ihrer Wirkung zu entschlüsseln. Obwohl sich die hier beschriebenen Experimente auf das Ewing-Sarkom konzentrieren, kann ein ähnlicher Ansatz auf andere Tumorarten angewendet werden.

In - vivo - Modell für die Prüfung von Wirkung von Hypoxie auf die Tumormetastasierung

Es wurde ein chirurgisches Verfahren entwickelt, um Brusttumorzellen über eine Pfortaderinjektion in die Mausleber zu bringen. Dieses Modell ermöglicht die Untersuchung der späten Stadien der Lebermetastasierung in einem vollständig immunkompetenten Wirt, einschließlich der Extravasation von Tumorzellen, der Aussaat, des Überlebens und des Metastasierungsauswuchses in der Leber.

Ein Portal Veneninjektion Modell zur Untersuchung der Leber Metastasierung von Brustkrebs

Die modellierung der intrakraniellen Hirnmetastasen wird durch die Unfähigkeit erschwert, die Tumorgröße und die Reaktion auf die Behandlung mit präzisen und zeitnahen Methoden zu überwachen. Die vorgestellte Methodik koppelt die intrakranielle Tumorinjektion mit einer Magnetresonanztomographie-Analyse, die in Kombination präzise und konsistente Injektionen, eine verbesserte Tierüberwachung und genaue Tumorvolumenmessungen kultiviert.

Modellierung von Hirnmetastasen durch intrakranielle Injektion und Magnetresonanztomographie

Hirnmetastasen sind eine Ursache für schwere Morbidität und Mortalität bei Krebspatienten. Die meisten Hirnmetastasen-Mausmodelle werden durch systemische Metastasen kompliziert, die die Analyse der Mortalität und der therapeutischen Interventionsergebnisse verwirren. Hier wird ein Protokoll für die interne Karotisinjektion von Krebszellen vorgestellt, das konsistente intrakranielle Tumoren mit minimalen systemischen Tumoren erzeugt.

Modellierung der Hirnmetastasierung durch Injektion von Krebszellen in die innere Halsschlagader

Dieses Protokoll stellt ein physiologisch relevantes Tumor-on-a-Chip-Modell vor, um Hochdurchsatz-Grundlagen- und translationale Krebsforschung am Menschen durchzuführen und das Arzneimittel-Screening, die Krankheitsmodellierung und Ansätze der personalisierten Medizin mit einer Beschreibung von Lade-, Wartungs- und Bewertungsverfahren voranzutreiben.

Etablierung eines physiologischen humanen vaskularisierten Mikrotumormodells für die Krebsforschung

Der Artikel beschreibt ein Protokoll zur Simulation der transienten Temperaturprofile und der gekoppelten raumzeitlichen Variation des interstitiellen Fluiddrucks nach der Erwärmung durch ein dipolares Radiofrequenz-Hyperthermiesystem. Das Protokoll kann verwendet werden, um die Reaktion biophysikalischer Parameter, die die Tumormikroumgebung charakterisieren, auf interventionelle Hyperthermietechniken zu bewerten.

Ein computergestützter Modellierungsansatz zur Untersuchung des Einflusses der Hyperthermie auf die Mikroumgebung des Tumors

Die stereotaktische intrakranielle Injektionstechnik ermöglicht eine präzise und lokalisierte Einpflanzung von Tumorzellen in den Mauskortex und ist damit ein wirkungsvolles Modell zur Untersuchung der metastatischen Besiedlung des Gehirns.

Modellierung von Gehirnmetastasen: Standardisierte Analyse metastatischer Kolonisierung und histologischer Wachstumsmuster durch stereotaktische intrakortikale Injektion

Lernen Sie eine Methode zur Modellierung hämodynamischen Stresses auf zirkulierende Tumorzellen mittels Spritze und Nadel. Dieses Verfahren ermöglicht die Untersuchung von Krebszellviabilität unter mechanischer Belastung.

Modellierung der Auswirkungen von hämodynamischem Stress auf zirkulierende Tumorzellen mit Spritze und Nadel

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