Analyse der SAMHD1-Restriktion durch Durchflusszytometrie in humanen myeloischen U937-Zellen

Mit zunehmendem Interesse an der Rolle zellulärer Faktoren bei der HIV-Infektion von Makrophagen haben wir ein flexibles Analysesystem entwickelt, insbesondere für SAM HG One, das nicht in U937-Zellen exprimiert wird. Der Hauptvorteil des Systems ist seine Flexibilität. Sobald es eingerichtet ist, kann es verwendet werden, um eine Vielzahl von Proteinen, Zellen oder Zielviren zu analysieren.

Es ist wichtig, die Gesundheit der Zellen zu erhalten und sich auch mit der mehrfarbigen Durchflusszytometrie wohl zu fühlen. Schalten Sie das Zytometer und den Computer 10 Minuten vor Beginn der Analyse ein. Stellen Sie sicher, dass der Abfall leer und der Manteltank voll ist.

Loggen Sie sich dann ein und öffnen Sie die Analysesoftware. Nachdem Sie den Arm bewegt haben, nehmen Sie den Wasserschlauch ab. Stellen Sie die Durchflussrate auf hoch ein, und drücken Sie die Festbrennweite.

Warten Sie, bis das Licht erlischt, und wiederholen Sie diesen Vorgang noch drei weitere Male. Legen Sie den Wasserschlauch zurück und laufen Sie drei Minuten lang mit hoher Durchflussrate. Stellen Sie dann die Durchflussrate auf niedrig ein und drücken Sie bis zur Erfassung auf Standby.

Wählen Sie Experiment, Neues Experiment und drücken Sie OK, um ein leeres Experiment auszuwählen, klicken Sie mit der rechten Maustaste auf das Experiment und fügen Sie eine neue Probe hinzu. Drücken Sie OK, um den Bereich zu leeren. Klicken Sie mit der rechten Maustaste, um mit einem geeigneten Namen umzubenennen, und öffnen Sie die Probe, indem Sie auf das Pluszeichen klicken, um eine neue Röhre anzuzeigen.

Doppelklicken Sie auf die Röhre, um die Zytometereinstellungen im Inspektor anzuzeigen. Löschen Sie im Parametermenü die nicht benötigten Fluorochrome mit Ausnahme des blauen Lasers 53030 und des gelben Lasers 61020. Erstellen Sie auf dem Arbeitsblatt ein Punktdiagramm für Vorwärtsstreubereich versus Seitenstreubereich, ein YFP-Histogramm, ein RFP-Histogramm und ein RFP-Punktediagramm im Vergleich zu einem YFP-Punktdiagramm, indem Sie auf das entsprechende Symbol klicken und die Achsen durch Klicken auf die Achsenbeschriftung ändern.

Laden Sie die nicht infizierte, nicht übertragene Steuerung und drücken Sie Run auf dem Computer. Drücken Sie dann im Erfassungs-Dashboard auf Erfassen. Passen Sie die Vorwärts- und Seitenstreuspannungen im Dashboard an, um die Zellen im unteren linken Quadranten zu positionieren.

Gate um diese Population herum und beschriften Sie sie als P eins. Klicken Sie mit der rechten Maustaste auf die anderen Diagramme und wählen Sie P eins anzeigen, um die Ablagerungen aus der nachfolgenden Analyse zu entfernen. Passen Sie die RFP- und YFP-Spannungen so an, dass die Spitze links vom Histogramm liegt.

Laden Sie die Einzelfarbsteuerung für YFP und drücken Sie Erfassen. Stellen Sie die YFP-Spannung im Armaturenbrett so ein, dass sich die meisten fluoreszierenden Zellen im Detektorbereich befinden. Wiederholen Sie dann dasselbe für das RFP-Steuerelement.

Wählen Sie das Experiment aus. Wechseln Sie zur Kompensationseinrichtung, wählen Sie Kompensationssteuerelemente erstellen und OK aus, um zu einem normalen Arbeitsblatt zu wechseln, und wählen Sie dann ein ungefärbtes normales Arbeitsblatt aus. Drücken Sie auf die Flucht und erwerben Sie für die ungefärbte Kontrolle.

Zeichnen Sie ein Tor P eins um die intakten Zellen und zeichnen Sie auf. Entfernen Sie den Schlauch und versetzen Sie das Gerät in den Standby-Modus. Klicken Sie mit der rechten Maustaste auf P eins.

Klicken Sie auf Alle Kompensationskontrollen anwenden und wechseln Sie zum normalen RFP-Arbeitsblatt. Drücken Sie den Lauf und zeichnen Sie die einfarbige RFP-Steuerung auf, und die Software wird die positiven Zellen automatisch gattern. Versetzen Sie das Gerät in den Standby-Modus und wiederholen Sie dasselbe für die YFP-Steuerung.

Wählen Sie Experiment, gehen Sie zu Kompensationseinrichtung, wählen Sie Kompensation berechnen und klicken Sie dann auf Link und speichern Sie. Wechseln Sie zum globalen Arbeitsblatt, und kehren Sie zum Probenrohr zurück. Erwerben Sie die Zellen, die mit Wildtyp-SAM HD übertragen wurden, die mit HIV-RFP infiziert sind, und überprüfen Sie, ob vier verschiedene Populationen in den Ecken der Quadranten zu sehen sind, die vertikal und horizontal für YFP und RFP ausgerichtet sind.

Entfernen Sie den Schlauch und drücken Sie auf Standby. Legen Sie die nicht transduzierte, nicht infizierte Probe erneut ein, und drücken Sie die Presse. Stellen Sie im Erfassungs-Dashboard das Stopptor auf P eins und Ereignisse auf 30.000 Ereignisse ein.

Drücken Sie auf Aufnahme. Wiederholen Sie dasselbe für andere Proben und Kontrollen, indem Sie das nächste Röhrchen zwischen jedes Röhrchen drücken. Benennen Sie die Beispiele während der Ausführung oder Post-Hawk um und exportieren Sie die Daten als Punkt-FCS-Dateien.

Öffnen Sie die Software und ziehen Sie alle FCS-Dateien in das Dashboard. Wählen Sie die Kompensationssteuerelemente aus und ziehen Sie sie in den Unterordner Kompensation. Doppelklicken Sie auf die nicht transduzierte, nicht infizierte Röhre, um die Datei zu öffnen und ein Diagramm zu streuen und zu streuen.

Wählen Sie das Polygonwerkzeug und das Gate für die intakte Zellpopulation ohne Schmutz in der unteren linken Ecke aus, und benennen Sie es nach Zellen. Verschieben Sie die Beschriftung so, dass sie die Zellen nicht verdeckt. Ziehen Sie dieses Tor auf die gesamte Population von Röhrchen in der Leiste "Alle Proben".

Scrollen Sie mit den horizontalen Pfeiltasten durch die gesamte Grundgesamtheit, um sicherzustellen, dass die richtige Ansteuerung für jede Röhre vorhanden ist. Doppelklicken Sie auf die Zellen und passen Sie die Achsen auf Höhe und Fläche an. Wählen Sie die einzelne große Population mit einem rechteckigen Tor aus, um Dubletten auszuschließen und der Software zu erlauben, sie automatisch als einzelne Zellen zu benennen.

Ziehen Sie dann dieses Tor auf alle Zellpopulationen und überprüfen Sie, ob das Gating für alle Proben geeignet ist. Wählen Sie die Einzelzellenpopulation für die nicht infizierte, nicht transduzierte Probe aus. Ändern Sie die Y-Achse in kompensierten blauen Laser für YFP und X-Achse in kompensierten gelben Laser für RFP.

Wählen Sie das Quadranten-Gating-Tool aus und klicken Sie auf das obere rechte Ende der negativen Zellpopulation. Wenden Sie dieses vorläufige Gating auf alle Einzelzellpopulationen an, indem Sie es auf das übergeordnete Gate in der Leiste "Alle Proben" ziehen. Wenn die Quadrantengatter die Grundgesamtheit nicht zufriedenstellend trennen, fügen Sie die einzelnen Quadranten mit dem Polygonwerkzeug hinzu.

Scrollen Sie zum Wildtyp SAM HD one only sample, um die korrekte Gating zwischen den nicht transduzierten YFP-negativen und YFP-positiven Zellen zu überprüfen. Verwenden Sie die Konturansicht, um die negativen Zellen von dunklen YFP-Zellen zu unterscheiden. Verwenden Sie die beste Unterteilung zwischen YFP-Negativ und -Positiv, die für alle Proben gültig ist, und scrollen Sie durch die Proben, um die Gating in Bezug auf die YFP-Positivität zu überprüfen.

Scrollen Sie zu der nicht transduzierten HIV-RFP-infizierten Probe und überprüfen Sie, ob die Gating zwischen der nicht infizierten RFP-negativen und der infizierten RFP-positiven Probe korrekt ist. Verwenden Sie bei Bedarf die Konturansicht, und scrollen Sie durch die verbleibenden Proben, um zu überprüfen, ob der Gating für alle Proben gültig ist. Jede Stichprobe benötigt vier Quadranten.

Q1 YFP positiv, Q2 doppelt positiv, Q3 RFP positiv und Q4 doppelt negativ. Öffnen Sie den Tabelleneditor und ziehen Sie die vier Quadrantentore in das Dashboard. Wählen Sie in der Dropdown-Liste die Option Datei und Excel aus.

Wählen Sie Ihr Dateiziel und klicken Sie auf Tabelle erstellen. Speichern Sie die generierte Tabelle gemäß den Namenskonventionen für lokale Dateien. Klicken Sie auf das Symbol des Layouteditors, um die Darstellungen von Plots und Gating-Strategien zu exportieren.

Wählen Sie jede Population aus und ziehen Sie sie mit den erforderlichen Achsen, Beschriftungen und Abständen in den Editor. Um ein Layout mit den gleichen Diagrammen zu erstellen, die für alle Proben im Abschnitt Charge angezeigt werden, geben Sie eines in die Spalte ein und klicken Sie auf Create batch report. Wählen Sie im Menü Datei die Skalierung auf Breite aus und vermeiden Sie Seitenumbrüche.

Speichern Sie dann im gewünschten Dateiformat. Generieren Sie in der exportierten Tabelle die Spalten wie im Textmanuskript beschrieben. Verwenden Sie eine geeignete Datenanalysesoftware, um die Replikationsdaten für jedes SAM HD One-Konstrukt zu mitteln, und berechnen Sie die Restriktionsverhältniswerte.

Für optimale und suboptimale Daten wurden repräsentative YFP- versus RFP-Plots generiert. Das suboptimale Datendiagramm zeigt, dass die HIV-Infektion zu niedrig war und Schwierigkeiten mit Kompensation und Gating verursachte. Die Restriktionsquote betrug 0,5 und lag damit über dem erwarteten Verhältnis von 0,3.

Die Diagramme des Restriktionsverhältnisses für Varianten von SAM HD one in Bezug auf den Wildtyp und die Negativkontrolle wurden für die optimalen und suboptimalen Daten generiert. In den optimalen Daten zeigte der Wildtyp die erwartete Einschränkung von etwa 0,2 und die Negativkontrolle HD 206 auf sieben AA hatte das Restriktionsverhältnis von 1,0. Die Variante R372D unterschied sich signifikant vom Wildtyp, aber nicht signifikant von der Negativkontrolle und verlor die Fähigkeit zur Einschränkung.

In den suboptimalen Daten verhielt sich die Negativkontrolle wie erwartet, aber der Wildtyp zeigte aufgrund der niedrigen Infektionsrate ein Restriktionsverhältnis von 0,5. Der R143D zeigte einen intermediären Phänotyp, der sich statistisch vom Wildtyp und der Negativkontrolle unterschied. Die Variante G209S unterschied sich signifikant vom Wildtyp, aber nicht signifikant von der Negativkontrolle und hat somit die Fähigkeit zur Einschränkung verloren.

Es ist wichtig, viele Ihrer Kontrollzellen zu haben, besonders wenn Sie neu in der Durchflusszytometrie sind. Im Anschluss daran oder parallel können biochemische Analysen derselben Mutanten durchgeführt werden, um ein ganzheitliches Bild zu erhalten.