Name: Analyse der SAMHD1-Restriktion durch Durchflusszytometrie in humanen myeloischen U937-Zellen (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-06-13T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 43 s
Description: Erfahren Sie, wie Sie die SAMHD1-vermittelte HIV-1-Restriktion in humanen myeloischen U937-Zellen mittels zweifarbiger Durchflusszytometrie quantitativ analysieren. Diese flexible Methode ermöglicht die Charakterisierung verschiedener SAMHD1-Varianten.

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Diese Arbeit wurde vom Francis Crick Institute unterstützt, das seine Kernfinanzierung von Cancer Research UK (FC001042 und FC001162), dem UK Medical Research Council (FC001042 und FC001162) und dem Wellcome Trust (FC001042 und FC001162) erhält, und durch einen Wellcome Trust Investigator Award an JPS (108012 / Z / 15 / Z). Die Arbeit an der University of Cambridge wurde vom NIHR Cambridge Biomedical Research Centre, The Evelyn Trust (16/21), The Rosetrees Trust (M590) und dem UK Medical Research Council (MR/S009752/1) kofinanziert. Der letztgenannte vom Vereinigten Königreich finanzierte Preis ist Teil des von der Europäischen Union unterstützten EDCTP 2-Programms.

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</ol>

Zum Zwecke des Open Access haben die Autoren eine CC BY Public Copyright Lizenz auf jede Author Accepted Manuscript Version angewendet, die sich aus dieser Einreichung ergibt. Die geäußerten Ansichten sind die des Autors oder der Autoren und nicht unbedingt die des NIHR oder des Ministeriums für Gesundheit und Soziales.

Wie in den obigen Anmerkungen erläutert, konzentrieren sich die kritischen Aspekte des Protokolls auf die Beibehaltung des korrekten Zellphänotyps für die VLP-Produktion und auf die Schaffung einer geeigneten Umgebung für die Beobachtung der SAMHD1-Restriktion. Erstens beruht die genaue Analyse der Restriktion durch Zweifarben-Durchflusszytometrie darauf, angemessene Anteile von transduzierten und infizierten Zellen zu erreichen, so dass in jedem Bereich des Diagramms genügend Zellen für die Analyse vorhanden sind. Daher sollte der Forscher ein MOI von weniger als 1 anstreben (siehe Protokoll). Zu hohe oder zu niedrige Transduktions- und Infektionsraten führen zu Analyseproblemen aufgrund fehlender oder doppelt infizierter Zellen. Ebenso ist eine ähnliche Transduktionsrate für zu vergleichende SAMHD1-Vektoren der Schlüssel, damit die gleiche Kompensationsmatrix und Gating auf das gesamte Experiment angewendet werden kann, was das Vertrauen in die nachfolgende Analyse erhöht.
Zweitens ist das Alter der verwendeten U937-Zellen ein Schlüsselfaktor für ihre erfolgreiche Differenzierung. Eine erfolgreiche Differenzierung kann durch Beobachtung der Adhärenz, einer reduzierten Ansäuerung der Medien im Zeitverlauf nach Differenzierung und einer adäquaten Restriktion durch die Wildtyp-Positivkontrolle im Assay überwacht werden. Die Differenzierung von bis zu 5 Tagen war erfolgreich.
Einer der Hauptvorteile dieses Assays ist seine Flexibilität. Eine Vielzahl von modifizierten Versionen von SAMHD1 (Domänen, Aminosäuren, Speziessequenzen) kann durch einfache ortsgerichtete Mutagenese des Vektors oder Klonierung getestet werden. Ebenso können Varianten des Testervirus erforscht werden. Der Test wurde zuvor verwendet, um zu zeigen, dass HIV-1-Reverse-Transkriptase-Mutanten mit reduzierter Fähigkeit, dNTP zu binden, empfindlicher auf SAMHD1-Restriktion reagieren. Das gleiche Prinzip kann verwendet werden, um die Einschränkung anderer Viren durch SAMHD1 zu testen. Darüber hinaus können unterschiedliche Differenzierungsbedingungen oder künstliche Manipulation intrazellulärer dNTP-Konzentrationen verwendet werden, um die Interaktion zwischen intrazellulären Bedingungen und SAMHD1-Aktivität weiter zu untersuchen, ein Bereich aktiver Forschung im Bishop-Labor. Die Wechselwirkung von SAMHD1 mit verschiedenen nukleosidischen Reverse-Transkriptase-Inhibitoren wurde ebenfalls beschrieben, und die Wirkung von SAMHD1 wurde unter Verwendung dieses Assays für die Verwendung in Primärzellenmodifiziert 12,13,14,15.
Die Anpassung des Protokolls für die Verwendung in Primärzellen überwindet die Einschränkungen, die sich aus der Untersuchung metabolischer Phänotypen in transformierten Zellen ergeben. Das bestehende Format ermöglicht jedoch ein komfortables und technisch weniger anspruchsvolles Protokoll für Hochdurchsatzanalysen, insbesondere bei Verwendung eines Durchflusszytometers mit einem Hochdurchsatz-Sampler. Bei der Anpassung des Protokolls sollte die Anfälligkeit der intern nicht transduzierten Zellen für Bystander-Effekte (z. B. Immunsignalisierung) berücksichtigt werden.
Wie bei vielen Aspekten der Zellbiologie ist es wichtig, dass solche Assays als Teil eines ganzheitlichen Ansatzes zum Verständnis eines bestimmten Phänomens verwendet werden. Die parallele Verwendung biochemischer Assays für die SAMHD1-Aktivität16, die Quantifizierung intrazellulärer dNTP-Pools und die Beobachtung von SAMHD1-mutierten Phänotypen beim Menschen, ex vivo und in Tiermodellen (die von Labors auf der ganzen Welt durchgeführt werden, einige werden in dieser Ausgabe beschrieben) sind der Schlüssel zum sich entwickelnden Verständnis dieses komplexen Proteins.

Steriles α-Motiv/Histidin-Aspartat-Domänen-enthaltendes Protein 1 (SAMHD1) behindert die Replikation des Humanen Immundefizienz-Virus Typ 1 (HIV-1) in ruhenden Zellen der myeloischen Linie. SAMHD1 blockiert die Replikation durch seine enzymatische Aktivität als dNTP-Triphosphohydrolase, was zu verminderten intrazellulären dNTPs führt. Infolgedessen kann HIV-1 den Prozess der reversen Transkription nicht effizient durchführen. In den wenigen Jahren seit dieser ersten Beobachtung wurden große Fortschritte erzielt, insbesondere in Bezug auf den Beitrag bestimmter Domänen und Aminosäuren zur antiviralen Aktivität von SAMHD1. Diese Erkenntnisse wurden mit biochemischen Assays sowie Zellsystemen gewonnen, die die physiologisch relevante ruhende myeloische Umgebung nachahmen. U937-Zellen1 werden häufig als praktisches myeloisches Zellsystem zur Analyse der SAMHD1-Aktivität verwendet. Dies ist auf einen Mangel an endogener SAMHD1-Expression zurückzuführen, von dem angenommen wird, dass er auf niedrige RNA-Spiegel im Vergleich zu SAMHD1-exprimierenden Zellen zurückzuführen ist (ein Bereich der laufenden Forschung). Hier beschreibt das Protokoll die transiente Transduktion von U937-Zellen mit virusähnlichen Partikeln, die SAMHD1 co-exprimieren, und einem Yellow Fluorescent Protein (YFP)-Reporter, um den Mechanismus der SAMHD1-Restriktion von HIV-1 zu untersuchen. Solche transienten zweifarbigen Durchflusszytometrie-Assays zur Untersuchung retroviraler Restriktionen wurden zuerst im Stoye-Labor2 entwickelt und seitdem angepasst, um andere Restriktionsfaktoren zu untersuchen, einschließlich der Tripartite Motif (TRIM) Proteine3. Inspiriert von diesen Assays entwickelte das Bishop-Labor einen zweifarbigen Assay zur Analyse der SAMHD1-Restriktion in U937-Zellen.
Der Workflow für das Experiment ist in Abbildung 1 dargestellt. Murine Leukämie Virus (MLV)-ähnliche Partikel, die eine bi-cistronische Nachricht enthalten, die SAMHD1 neben YFP kodiert, das von einem IRES exprimiert wird, werden verwendet, um U937-Zellen zu transduzieren. Die Zellen werden dann mit Phorbolmyristatacetat (PMA) behandelt, um eine Differenzierung zu einem ruhenden Phänotyp zu induzieren. Als nächstes werden Zellen mit HIV-1-Virus-ähnlichen Partikeln infiziert, die rotes fluoreszierendes Protein (RFP) exprimieren. Nach 48 h werden die Zellen geerntet und mittels Zweifarben-Durchflusszytometrie analysiert. Dieser Assay wird auch mit YFP und grün fluoreszierendem Protein (GFP) verwendet, wodurch weniger Standardfilterkombinationen für die Durchflusszytometrie-Analyse erforderlich sind. Die Verwendung von HIV-RFP ermöglicht eine einfachere Kompensation und somit ist der Assay für weniger erfahrene Durchflusszytometrie-Benutzer leichter zugänglich und mit den meisten Zytometern erreichbar.
Während der Analyse wird der Anteil der HIV-infizierten Zellen zwischen SAMHD1-exprimierenden Zellen und solchen, denen SAMHD1 fehlt, innerhalb derselben Zellquelle verglichen. Dies ermöglicht eine interne Kontrolle im Bohrloch-/Durchflusszytometrieröhrchen, was ein Schlüsselmerkmal ist. Der Vergleich der Infektionsraten in transduzierten und nicht transduzierten Zellen zeigt ein Restriktionsverhältnis. Ein Verhältnis von 1,0 zeigt an, dass der transduzierte Faktor keinen Einfluss auf die Infektiosität hat. Die Wildtyp-SAMHD1-Expression führt in diesem Test zu einer fünffachen Reduktion der HIV-Infektion, was einem Restriktionsverhältnis von 0,2 entspricht. Obwohl dieser Effekt im Vergleich zu klassischeren Restriktionsfaktoren wie TRIM5 bescheiden ist, ist der Effekt dennoch reproduzierbar und ermöglicht die Klassifizierung modifizierter SAMHD1-Expressionoren in solche, die sich in äquivalenter Weise auf das Wildtyp-Protein beschränken, solche, die nicht einschränken, und solche mit einem intermediären Phänotyp.
Dieser Assay wurde erfolgreich verwendet, um die Restriktionsphänotypen der SAMHD1-Domäne und der Aminosäuremutanten zu charakterisieren, indem er mit Viren transduzierte, die mutierte SAMHD1-Sequenzen kodieren. Zum Beispiel können die katalytischen Site-Substitutionen HD206-7AA in diesem Assay nicht eingeschränkt werden. Ebenso kann die Anfälligkeit verschiedener Testerviren bestimmt werden. Zum Beispiel sind HIV-1-Reverse-Transkriptase-Mutanten anfälliger für SAMHD1-vermittelte Restriktion (z. B. 151V4). Dieses Protokoll beschreibt die Details der Produktion von virusähnlichen Partikeln (VLP), die Transduktion von U937 mit SAMHD1-Expressionsvektoren, die Infektion mit HIV mit einem fluoreszierenden Reporter und die anschließende Analyse mittels Durchflusszytometrie. In diesem Artikel wird erläutert, welche Daten zu erwarten sind und wie suboptimale Ergebnisse vermieden werden können. Schließlich werden alternative Anwendungen für den Assay skizziert, zusätzlich zur Untersuchung verschiedener SAMHD1-Varianten, um das Zusammenspiel zwischen SAMHD1, dNTP-Spiegeln und Virusinfektion gründlicher zu verstehen. Angesichts der Rolle von SAMHD1 im Zentrum des Zellstoffwechsels mit zusätzlichen Verbindungen zu Krebs ist dies weiterhin ein Bereich von intensivem Interesse.

<table><tbody><tr><td>293T Zellen</td><td>ATCC</td><td>CRL-3216</td><td></td></tr><tr><td>0,45 & Mikro; m Spritzenfilter</td><td>Sartorius</td><td>FCT122</td><td></td></tr><tr><td>10-cm-Schalen</td><td>Corning</td><td>430167</td><td>Viruspräparate können durch Transfektion in Platten/Kolben mit höherer Kapazität skaliert werden - siehe Anleitung zur Transfektion Reagenzien</td></tr><tr><td>12-Well-Platten</td><td>Greiner</td><td>665180</td><td></td></tr><tr><td>24-Well-Platten</td><td>Greiner</td><td>662160</td><td></td></tr><tr><td>BD LSRFortessa Zellanalysator</td><td>BD Bioscience</td><td>649225</td><td>Alternative Analysatoren können verwendet werden, solange sie RFP- und YFP-Fluoreszenz lesen können</td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Sigma</td><td>D6429</td><td>ATCC empfiehlt, dass Dulbeccos modifiziertes Eagle's Medium (DMEM) so modifiziert ist, dass es 4 mM L-Glutamin, 4500 mg/L Glukose, 1 mM Natriumpyruvat und 1500 mg/L Natriumbicarbonat enthält.</td></tr><tr><td>DMSO</td><td>Fisher</td><td>BP-231-100</td><td></td></tr><tr><td>fötales Rinderserum</td><td>Gibco</td><td>10500064</td><td></td></tr><tr><td>Flowjo</td><td>BD Bioscience-alternative</td><td></td> <td>Analysesoftware kann verwendet werden</td></tr><tr><td>Lichtmikroskop</td><td></td> <td>-</td> <td>Jedes Hellfeld-Lichtmikroskop</td></tr><tr><td>p8.91</td><td></td> <td>-</td> <td>HIV GagPol Expressor (PMID: 8602510)</td></tr> <tr><td>Paraformaldehyd (4 % in PBS)</td><td>Alfa Aesar</td><td>J61889</td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>Sigma</td><td>D8537</td><td></td></tr><tr><td>Penicillin-Streptomycin (10.000 U/ml)</td><td>ThermoFisher</td><td>15140122</td><td></td></tr><tr><td>Phorbol-12-Myristat-13-acetat (PMA)</td><td>Sigma</td><td>P8139</td><td></td></tr><tr><td>Polybren</td><td>Sigma</td><td>TR-1003</td><td></td></tr><tr><td>pKB4</td><td>-</td><td>-</td><td>Maus-Leukämievirus GagPol-Expressor (PMID: 23035841)</td></tr><tr><td>pLGatewaySAMHD1eYFP</td>-<td>-</td><td></td><td>MLV-Paketierungsplasmid, das für eine humane Wildtyp-Sequenz kodiert. Details und Klonierungsverfahren Arnold et al. 2015 (Ref 1).</td></tr><tr><td>pLGatewaySAMHD1HD206-7AAeY FP</td><td>-</td><td>-</td><td>Wie oben, kodiert Aminosäuresubstitutionen an wichtigen Resten aktiver Zentren</td></tr><tr><td>Prism</td><td>Graphpad-https://www.graphpad.com/scientific-software/prism/</td><td></td> <td>Andere Datendarstellungssoftware sind ebenfalls geeignet</td></tr><tr><td>pVSV-G</td><td></td> <td>-</td> <td>VSV-G Expressor (https://www.addgene.org/138479/), alternativ: pMD2.G (https://www.addgene.org/12259/)</td></tr><tr><td>RPMI</td><td>ThermoFisher</td><td>21875034</td><td></td></tr><tr><td>Röhrchen mit Schraubverschluss</td><td>StarLab</td><td>E1415-2231</td><td></td></tr><tr><td>SCRPSY</td> <td>-</td><td></td> <td>HIV-Verpackung Plasmidkodierung RFP, Sam Wilson, https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC5026698/</td></tr> <tr><td>Streifen 10 mL</td><td>Corning</td><td>10084450</td><td></td></tr><tr><td>Stripetten 5 mL</td><td>Corning</td><td>10420201</td><td></td></tr><tr><td>TrypLE express</td><td>Gibco</td><td>12604021</td><td>Trypsin sind ebenfalls geeignet</td></tr><tr><td>Turbofect</td><td>ThermoFisher</td><td>R0531</td><td>alternative Transfektionsreagenzien funktionieren auch gut</td></tr><tr><td>U937-Zellen</td><td>ATCC</td><td>CRL-1593.2</td><td></td></tr></tbody></table>

analyse der samhd1-restriktion durch durchflusszytometrie in humanen myeloischen u937-zellen

Analysis of SAMHD1 Restriction by Flow Cytometry in Human Myeloid U937 Cells

Steriles α-Motiv/Histidin-Aspartat-Domänen-enthaltendes Protein 1 (SAMHD1) hemmt die Replikation von HIV-1 in ruhenden myeloischen Zellen. U937-Zellen werden aufgrund einer geringen SAMHD1-RNA-Expression häufig als praktisches Zellsystem zur Analyse der SAMHD1-Aktivität verwendet, was zu einer nicht nachweisbaren endogenen Proteinexpression führt. Basierend auf ähnlichen Assays, die im Stoye-Labor zur Charakterisierung anderer retroviraler Restriktionsfaktoren entwickelt wurden, entwickelte das Bishop-Labor einen zweifarbigen Restriktionsassay zur Analyse von SAMHD1 in U937-Zellen. Murine Leukämie Virus-ähnliche Partikel, die SAMHD1 exprimieren, werden zusammen mit YFP, das von einem IRES exprimiert wird, verwendet, um U937-Zellen zu transduzieren. Die Zellen werden dann mit Phorbolmyristatacetat behandelt, um eine Differenzierung zu einem ruhenden Phänotyp zu induzieren. Nach der Differenzierung werden Zellen mit HIV-1-Virus-ähnlichen Partikeln infiziert, die einen fluoreszierenden Reporter exprimieren. Nach 48 h werden die Zellen geerntet und mittels Durchflusszytometrie analysiert. Der Anteil der HIV-infizierten Zellen in der SAMHD1-exprimierenden Population wird mit dem in internen Kontrollzellen verglichen, denen SAMHD1 fehlt. Dieser Vergleich zeigt ein Restriktionsverhältnis. Die SAMHD1-Expression führt zu einer fünffachen Reduktion der HIV-Infektion, was einem Restriktionsverhältnis von 0,2 entspricht. Unsere jüngste Substitution von RFP durch das ursprüngliche GFP als Reportergen für HIV-Infektionen hat die Durchflusszytometrie-Analyse erleichtert.
Dieser Assay wurde erfolgreich verwendet, um die Wirkung von Aminosäuresubstitutionen auf die SAMHD1-Restriktion zu charakterisieren, indem mit Viren transformiert wurde, die für veränderte SAMHD1-Proteine kodieren, die aus der ortsgerichteten Mutagenese des Expressionsvektors abgeleitet wurden. Zum Beispiel zeigen die katalytischen Stellensubstitutionen HD206-7AA einen Restriktionsphänotyp von 1, was auf einen Verlust der Restriktionsaktivität hinweist. Ebenso kann die Anfälligkeit verschiedener Testerviren bestimmt werden. Der Assay kann weiter angepasst werden, um die Wirkung von Differenzierungsstatus, metabolischem Status und SAMHD1-Modifikatoren zu berücksichtigen, um die Beziehung zwischen SAMHD1, Zellstoffwechselzustand und viraler Restriktion besser zu verstehen.

Die Ergebnisse der obigen Analyse sollten ein Restriktionsverhältnis von 0,25 oder niedriger für die Wildtyp-SAMHD1-Positivkontrolle und 1,0 für die Negativkontrolle ergeben. Wenn diese beiden Qualitätskontrollen gültig sind, berücksichtigen Sie die statistische Signifikanz der Ergebnisse. SAMHD1-Varianten, die keinen signifikanten Unterschied zum Wildtyp aufweisen, weisen daher Substitutionen auf, die die SAMHD1-Restriktion in diesem Zusammenhang nicht beeinflussen. Diejenigen, die sich signifikant vom Wildtyp unterscheiden, zeigen eine beeinträchtigte Einschränkung. Wenn sich diese nicht signifikant von der Negativkontrolle unterscheiden, fehlt ihnen in diesem Zusammenhang die Möglichkeit, sie einzuschränken (Abbildung 4 linkes Bild).
Wenn der Wildtyp-SAMHD1-Einschränkungswert größer als 0,3 ist, können die Ergebnisse für Testerviren indikativ sein, aber Sie können sich nicht auf sie verlassen. Eine unwirksame Einschränkung durch Wildtyp-Protein kann sich aus der Verwendung von U937-Zellen ergeben, die zu früh nach der Genesung von der Rekonstitution (innerhalb von 2 Wochen) oder wenn sie zu alt sind (&gt;2-3 Monate). Diese Parameter müssen möglicherweise für einen gegebenen Zellbestand empirisch bestimmt werden. Je niedriger die Passage, desto zuverlässiger differenzieren sich die Zellen und bieten daher die geeignete Umgebung für die SAMHD1-Restriktion. Ein unangemessenes Infektionsniveau mit SAMHD1-YFP oder HIV-RFP kann auch zu Schwierigkeiten bei der Kompensation und der nachgelagerten Bestimmung des Restriktionsverhältnisses führen. Ein Beispiel ist in den rechten Feldern von Abbildung 4 dargestellt.
Wenn die Negativkontrolle von 1,0 abweicht (außerhalb des Bereichs von 0,9-1,2), kann dies auf ein Problem mit der Analyse hinweisen, entweder der Anteil der infizierten Zellen, die Gating-Strategie oder die Gesundheit der Zellen beeinflussen den Assay. Siehe HINWEISE oben.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62502/62502fig01.jpg"> Abbildung 1: Schematische Darstellung des Protokolls. VLP, virusähnliche Partikel, PMA, Phorbolmyristatacetat. Nummerierte Stufen entsprechen Stufen im Protokoll. Abbildung hergestellt mit BioRender.com. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62502/62502fig01large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62502/62502fig02.jpg"> Abbildung 2: Schematische Darstellung retroviraler Plasmide . (A) Verpackungsvektoren (B) Transfervektoren (C) VSV-G Hüllkurvenexpressor. Wichtige Kodierungs- und Regulierungselemente werden gezeigt. Weitere Informationen finden Sie in der Materialtabelle. CMV IE: Cytomegalovirus immediate-early promoter, BGH: bovines Wachstumshormon, pA: polyA, RRE: Rev Response Element, CMV-LTR: zusammengesetzter CMV-HIV-1 LTR-Promotor, Psi: HIV-1 Verpackungssignal, cPPT / CTS: zentraler Polypurintrakt / zentrale Terminierungssequenz, SV40: Affen-Vakuolierungsvirus 40. Abbildung hergestellt mit BioRender.com. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62502/62502fig02large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62502/62502fig03.jpg"> Abbildung 3: Gating-Strategie für die Durchflusszytometrie-Analyse. (A) Kompensationskontrollen: Das linke Feld zeigt FSC-A/SSC-A-Gating auf intakten Zellen für die nicht transduzierte, nicht infizierte Kontrolle. Das mittlere und rechte Feld zeigt Screenshots von einfarbigen Kompensationssteuerelementen für YFP (Mitte) und RFP (rechts) mit nicht kompensierten Daten in Schwarz und kompensiert in Blau. (B) Entsprechende Kompensationsmatrix und Diagramme für Kompensationskontrollen oben. (C) Gating-Strategie. Trümmer werden durch Analyse aller Zellen durch FSC-A/SSC-A (linkes Bild) eliminiert. Dubletten werden ausgeschlossen, indem sie auf FSC-Höhe versus Fläche (zentrale Platte) geguckt werden. Das rechte Bild zeigt ein Beispiel für eine HIV-1-Restriktion durch Wildtyp-SAMHD1. Die Achsen zeigen kompensierte blaue und gelbe Laserfluoreszenz, die YFP (SAMHD1) bzw. RFP (HIV)-positiven Zellen entsprechen. Quadrantengatter werden durch Vergleich von negativen und einfarbigen Kontrollen für RFP und YFP gezeichnet. Die Zahlen geben den Prozentsatz der Elternpopulation an. Die Kompensationswerte für YFP mit GFP werden viel höher sein, aber es ist möglich, mit geeigneten Filtersätzen zu unterscheiden. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62502/62502fig03large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62502/62502fig04.jpg"> Abbildung 4: Erwartete Ergebnisse: ideale versus suboptimale Daten. (A) Repräsentative YFP/RFP-Diagramme für optimale (links) und suboptimale (rechts) Daten. Die Zahlen geben den Prozentsatz der Elternpopulation an. Im rechten Feld ist die HIV-Infektion zu niedrig, was zu Schwierigkeiten bei der Kompensation und dem Gating führt. Die Restriktionsquote ist mit 0,5 höher als erwartet. (B) Diagramme des Restriktionsverhältnisses für Varianten von SAMHD1 in Bezug auf Wildtyp (WT, rot) oder die Negativkontrolle (HD206-7AA, schwarz), die mit Hilfe von Statistiksoftware erzeugt wurden. Jeder Punkt stellt einen Replikationswert dar. Mittelwert und Standardabweichung werden angezeigt. Gepaarte t-Tests zwischen jeder Gruppe waren in allen Fällen, in denen gezeigt wurde, signifikant. Links: Ideale Daten - WT zeigt die erwartete Einschränkung von ca. 0,2, negativ zeigt 1,0. Die Variante R372D (grau) unterscheidet sich signifikant von WT, aber nicht signifikant von der Negativkontrolle und hat somit die Fähigkeit zur Einschränkung verloren. Rechts: Suboptimale Daten. Hier verhält sich das Negativ wie erwartet, aber in allen sechs Replikaten zeigt die WT aufgrund der niedrigen Infektionsrate nur ein Restriktionsverhältnis von 0,5. Die geringe Varianz innerhalb der Gruppen bedeutet, dass R143H einen intermediären Phänotyp aufweist, der sich statistisch von WT und dem negativen unterscheidet, während G209S nicht einschränkt; Dies sollte jedoch bei frischen Zellen wiederholt werden, da die Positivkontrolle nicht die erwartete Restriktionsquote ergeben hat. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62502/62502fig04large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.</a>

Hier wird eine etablierte Methode beschrieben, um das Ausmaß der HIV-1-Restriktion durch das zelluläre hemmende Protein SAMHD1 zu bestimmen. Humane myeloische U937-Zellen werden mit einem SAMHD1-Expressionsvektor transduziert, der YFP co-exprimiert, differenziert und dann mit HIV-RFP herausgefordert wird. Der Grad der Einschränkung wird durch Durchflusszytometrie-Analyse bestimmt.

Analyse der SAMHD1-Restriktion durch Durchflusszytometrie in humanen myeloischen U937-Zellen

Sterile &#945;-motif/histidine-aspartate domain-containing protein 1 (SAMHD1) inhibits replication of HIV-1 in quiescent myeloid cells. U937 cells are ...

Mit zunehmendem Interesse an der Rolle zellulärer Faktoren bei der HIV-Infektion von Makrophagen haben wir ein flexibles Analysesystem entwickelt, insbesondere für SAM HG One, das nicht in U937-Zellen exprimiert wird. Der Hauptvorteil des Systems ist seine Flexibilität. Sobald es eingerichtet ist, kann es verwendet werden, um eine Vielzahl von Proteinen, Zellen oder Zielviren zu analysieren.Es ist wichtig, die Gesundheit der Zellen zu erhalten und sich auch mit der mehrfarbigen Durchflusszytometrie wohl zu fühlen. Schalten Sie das Zytometer und den Computer 10 Minuten vor Beginn der Analyse ein. Stellen Sie sicher, dass der Abfall leer und der Manteltank voll ist.Loggen Sie sich dann ein und öffnen Sie die Analysesoftware. Nachdem Sie den Arm bewegt haben, nehmen Sie den Wasserschlauch ab. Stellen Sie die Durchflussrate auf hoch ein, und drücken Sie die Festbrennweite.Warten Sie, bis das Licht erlischt, und wiederholen Sie diesen Vorgang noch drei weitere Male. Legen Sie den Wasserschlauch zurück und laufen Sie drei Minuten lang mit hoher Durchflussrate. Stellen Sie dann die Durchflussrate auf niedrig ein und drücken Sie bis zur Erfassung auf Standby.Wählen Sie Experiment, Neues Experiment und drücken Sie OK, um ein leeres Experiment auszuwählen, klicken Sie mit der rechten Maustaste auf das Experiment und fügen Sie eine neue Probe hinzu. Drücken Sie OK, um den Bereich zu leeren. Klicken Sie mit der rechten Maustaste, um mit einem geeigneten Namen umzubenennen, und öffnen Sie die Probe, indem Sie auf das Pluszeichen klicken, um eine neue Röhre anzuzeigen.Doppelklicken Sie auf die Röhre, um die Zytometereinstellungen im Inspektor anzuzeigen. Löschen Sie im Parametermenü die nicht benötigten Fluorochrome mit Ausnahme des blauen Lasers 53030 und des gelben Lasers 61020. Erstellen Sie auf dem Arbeitsblatt ein Punktdiagramm für Vorwärtsstreubereich versus Seitenstreubereich, ein YFP-Histogramm, ein RFP-Histogramm und ein RFP-Punktediagramm im Vergleich zu einem YFP-Punktdiagramm, indem Sie auf das entsprechende Symbol klicken und die Achsen durch Klicken auf die Achsenbeschriftung ändern.Laden Sie die nicht infizierte, nicht übertragene Steuerung und drücken Sie Run auf dem Computer. Drücken Sie dann im Erfassungs-Dashboard auf Erfassen. Passen Sie die Vorwärts- und Seitenstreuspannungen im Dashboard an, um die Zellen im unteren linken Quadranten zu positionieren.Gate um diese Population herum und beschriften Sie sie als P eins. Klicken Sie mit der rechten Maustaste auf die anderen Diagramme und wählen Sie P eins anzeigen, um die Ablagerungen aus der nachfolgenden Analyse zu entfernen. Passen Sie die RFP- und YFP-Spannungen so an, dass die Spitze links vom Histogramm liegt.Laden Sie die Einzelfarbsteuerung für YFP und drücken Sie Erfassen. Stellen Sie die YFP-Spannung im Armaturenbrett so ein, dass sich die meisten fluoreszierenden Zellen im Detektorbereich befinden. Wiederholen Sie dann dasselbe für das RFP-Steuerelement.Wählen Sie das Experiment aus. Wechseln Sie zur Kompensationseinrichtung, wählen Sie Kompensationssteuerelemente erstellen und OK aus, um zu einem normalen Arbeitsblatt zu wechseln, und wählen Sie dann ein ungefärbtes normales Arbeitsblatt aus. Drücken Sie auf die Flucht und erwerben Sie für die ungefärbte Kontrolle.Zeichnen Sie ein Tor P eins um die intakten Zellen und zeichnen Sie auf. Entfernen Sie den Schlauch und versetzen Sie das Gerät in den Standby-Modus. Klicken Sie mit der rechten Maustaste auf P eins.Klicken Sie auf Alle Kompensationskontrollen anwenden und wechseln Sie zum normalen RFP-Arbeitsblatt. Drücken Sie den Lauf und zeichnen Sie die einfarbige RFP-Steuerung auf, und die Software wird die positiven Zellen automatisch gattern. Versetzen Sie das Gerät in den Standby-Modus und wiederholen Sie dasselbe für die YFP-Steuerung.Wählen Sie Experiment, gehen Sie zu Kompensationseinrichtung, wählen Sie Kompensation berechnen und klicken Sie dann auf Link und speichern Sie. Wechseln Sie zum globalen Arbeitsblatt, und kehren Sie zum Probenrohr zurück. Erwerben Sie die Zellen, die mit Wildtyp-SAM HD übertragen wurden, die mit HIV-RFP infiziert sind, und überprüfen Sie, ob vier verschiedene Populationen in den Ecken der Quadranten zu sehen sind, die vertikal und horizontal für YFP und RFP ausgerichtet sind.Entfernen Sie den Schlauch und drücken Sie auf Standby. Legen Sie die nicht transduzierte, nicht infizierte Probe erneut ein, und drücken Sie die Presse. Stellen Sie im Erfassungs-Dashboard das Stopptor auf P eins und Ereignisse auf 30.000 Ereignisse ein.Drücken Sie auf Aufnahme. Wiederholen Sie dasselbe für andere Proben und Kontrollen, indem Sie das nächste Röhrchen zwischen jedes Röhrchen drücken. Benennen Sie die Beispiele während der Ausführung oder Post-Hawk um und exportieren Sie die Daten als Punkt-FCS-Dateien.Öffnen Sie die Software und ziehen Sie alle FCS-Dateien in das Dashboard. Wählen Sie die Kompensationssteuerelemente aus und ziehen Sie sie in den Unterordner Kompensation. Doppelklicken Sie auf die nicht transduzierte, nicht infizierte Röhre, um die Datei zu öffnen und ein Diagramm zu streuen und zu streuen.Wählen Sie das Polygonwerkzeug und das Gate für die intakte Zellpopulation ohne Schmutz in der unteren linken Ecke aus, und benennen Sie es nach Zellen. Verschieben Sie die Beschriftung so, dass sie die Zellen nicht verdeckt. Ziehen Sie dieses Tor auf die gesamte Population von Röhrchen in der Leiste "Alle Proben".Scrollen Sie mit den horizontalen Pfeiltasten durch die gesamte Grundgesamtheit, um sicherzustellen, dass die richtige Ansteuerung für jede Röhre vorhanden ist. Doppelklicken Sie auf die Zellen und passen Sie die Achsen auf Höhe und Fläche an. Wählen Sie die einzelne große Population mit einem rechteckigen Tor aus, um Dubletten auszuschließen und der Software zu erlauben, sie automatisch als einzelne Zellen zu benennen.Ziehen Sie dann dieses Tor auf alle Zellpopulationen und überprüfen Sie, ob das Gating für alle Proben geeignet ist. Wählen Sie die Einzelzellenpopulation für die nicht infizierte, nicht transduzierte Probe aus. Ändern Sie die Y-Achse in kompensierten blauen Laser für YFP und X-Achse in kompensierten gelben Laser für RFP.Wählen Sie das Quadranten-Gating-Tool aus und klicken Sie auf das obere rechte Ende der negativen Zellpopulation. Wenden Sie dieses vorläufige Gating auf alle Einzelzellpopulationen an, indem Sie es auf das übergeordnete Gate in der Leiste "Alle Proben" ziehen. Wenn die Quadrantengatter die Grundgesamtheit nicht zufriedenstellend trennen, fügen Sie die einzelnen Quadranten mit dem Polygonwerkzeug hinzu.Scrollen Sie zum Wildtyp SAM HD one only sample, um die korrekte Gating zwischen den nicht transduzierten YFP-negativen und YFP-positiven Zellen zu überprüfen. Verwenden Sie die Konturansicht, um die negativen Zellen von dunklen YFP-Zellen zu unterscheiden. Verwenden Sie die beste Unterteilung zwischen YFP-Negativ und -Positiv, die für alle Proben gültig ist, und scrollen Sie durch die Proben, um die Gating in Bezug auf die YFP-Positivität zu überprüfen.Scrollen Sie zu der nicht transduzierten HIV-RFP-infizierten Probe und überprüfen Sie, ob die Gating zwischen der nicht infizierten RFP-negativen und der infizierten RFP-positiven Probe korrekt ist. Verwenden Sie bei Bedarf die Konturansicht, und scrollen Sie durch die verbleibenden Proben, um zu überprüfen, ob der Gating für alle Proben gültig ist. Jede Stichprobe benötigt vier Quadranten.Q1 YFP positiv, Q2 doppelt positiv, Q3 RFP positiv und Q4 doppelt negativ. Öffnen Sie den Tabelleneditor und ziehen Sie die vier Quadrantentore in das Dashboard. Wählen Sie in der Dropdown-Liste die Option Datei und Excel aus.Wählen Sie Ihr Dateiziel und klicken Sie auf Tabelle erstellen. Speichern Sie die generierte Tabelle gemäß den Namenskonventionen für lokale Dateien. Klicken Sie auf das Symbol des Layouteditors, um die Darstellungen von Plots und Gating-Strategien zu exportieren.Wählen Sie jede Population aus und ziehen Sie sie mit den erforderlichen Achsen, Beschriftungen und Abständen in den Editor. Um ein Layout mit den gleichen Diagrammen zu erstellen, die für alle Proben im Abschnitt Charge angezeigt werden, geben Sie eines in die Spalte ein und klicken Sie auf Create batch report. Wählen Sie im Menü Datei die Skalierung auf Breite aus und vermeiden Sie Seitenumbrüche.Speichern Sie dann im gewünschten Dateiformat. Generieren Sie in der exportierten Tabelle die Spalten wie im Textmanuskript beschrieben. Verwenden Sie eine geeignete Datenanalysesoftware, um die Replikationsdaten für jedes SAM HD One-Konstrukt zu mitteln, und berechnen Sie die Restriktionsverhältniswerte.Für optimale und suboptimale Daten wurden repräsentative YFP- versus RFP-Plots generiert. Das suboptimale Datendiagramm zeigt, dass die HIV-Infektion zu niedrig war und Schwierigkeiten mit Kompensation und Gating verursachte. Die Restriktionsquote betrug 0,5 und lag damit über dem erwarteten Verhältnis von 0,3.Die Diagramme des Restriktionsverhältnisses für Varianten von SAM HD one in Bezug auf den Wildtyp und die Negativkontrolle wurden für die optimalen und suboptimalen Daten generiert. In den optimalen Daten zeigte der Wildtyp die erwartete Einschränkung von etwa 0,2 und die Negativkontrolle HD 206 auf sieben AA hatte das Restriktionsverhältnis von 1,0. Die Variante R372D unterschied sich signifikant vom Wildtyp, aber nicht signifikant von der Negativkontrolle und verlor die Fähigkeit zur Einschränkung.In den suboptimalen Daten verhielt sich die Negativkontrolle wie erwartet, aber der Wildtyp zeigte aufgrund der niedrigen Infektionsrate ein Restriktionsverhältnis von 0,5. Der R143D zeigte einen intermediären Phänotyp, der sich statistisch vom Wildtyp und der Negativkontrolle unterschied. Die Variante G209S unterschied sich signifikant vom Wildtyp, aber nicht signifikant von der Negativkontrolle und hat somit die Fähigkeit zur Einschränkung verloren.Es ist wichtig, viele Ihrer Kontrollzellen zu haben, besonders wenn Sie neu in der Durchflusszytometrie sind. Im Anschluss daran oder parallel können biochemische Analysen derselben Mutanten durchgeführt werden, um ein ganzheitliches Bild zu erhalten.

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Research

Forschung

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologie und Infektion

Die Kolonie-bildenden Zellen (CFC)-Assay ist ein in vitro Assay, bei dem hämatopoetischen Vorläuferzellen bilden Kolonien in einem halbfesten Medium. Eine Kombination aus Koloniemorphologie, Zellmorphologie und Durchflusszytometrie werden verwendet, um die Fähigkeit der Vorläuferzellen zur Proliferation und Differenzierung entlang der verschiedenen hämatopoetischen Linien zu beurteilen.

Colony Forming Cell (CFC)-Assay für humanen hämatopoetischen Zellen

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Charakterisierung von humanen Monozyten-abgeleiteten dendritischen Zellen durch Imaging Durchflusszytometrie: Ein Vergleich zwischen zwei Monozyt Isolation Protokolle

Dieses Protokoll liefert eine Analyse der Makrophagen-Subpopulationen in das erwachsene Maus-Zentralnervensystem durch Durchflusszytometrie und ist hilfreich für die Untersuchung von mehreren Markern, die von diesen Zellen exprimiert werden.

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Wir skizzieren ein Protokoll zur gleichzeitigen Ausdruck der Leukämie Stammzell-Marker auf primäre akute myeloische Leukämie-Zellen durch Durchflusszytometrie zu erkennen. Wir zeigen, wie Sie drei Vorläuferzellen Populationen und eine vermeintliche LSC Bevölkerung mit zunehmendem Grad der Reifung zu quantifizieren. Wir bestätigte das Vorhandensein dieser Populationen in entsprechenden Patienten-abgeleitet-Xenotransplantate.

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Die MDS-Diagnose ist schwierig bei fehlender morphologischer Kriterien oder nicht-informativen Zytogenetik. MFC könnte dazu beitragen, den MDS diagnostischen Prozess zu verfeinern. Nützlich für die klinische Praxis zu werden, die MFC-Analyse muss auf Parametern beruhen mit ausreichender Spezifität und Sensitivität und Daten sollten zwischen verschiedenen Betreibern reproduzierbar sein.

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Xenobiotische Efflux-Pumpen sind hochaktiv in hämatopoetischen Stamm- und Vorläuferzellen (HSPCs) und verursachen die Extrusion von TMRM, einem mitochondrialen Membranpotenzial fluoreszierender Farbstoff. Hier stellen wir ein Protokoll zur genauen Messung des mitochondrialen Membranpotenzials in HSPCs durch TMRM in Gegenwart von Verapamil, einem Efflux-Pumpeninhibitor, vor.

Verbesserung der Genauigkeit der zytometrischen Bewertung des mitochondrialen Membranpotenzials in hämatopoetischen Stamm- und Vorläuferzellen durch die Hemmung von Efflux-Pumpen

In dieser Arbeit beschreiben wir ein einfaches Protokoll für die Isolierung und Färbung von murinen Knochenmarkzellen zum Phänotyp hämopoetischer Stamm- und Vorläuferzellen zusammen mit den unterstützenden endothelialen und mesenchymalen Stammzellen der Nische. Eine Methode zur Anreicherung von Zellen, die sich im endostealen und zentralen Knochenmarkbereich befinden, ist ebenfalls enthalten.

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