Modifikationen der Langendorff-Methode zur gleichzeitigen Isolierung von atrialen und ventrikulären Myozyten aus erwachsenen Mäusen

Dieses Protokoll könnte dazu beitragen, die Vorhofausbeute eines durchbluteten Mausherzens zu verbessern. Der Hauptvorteil dieser Methode besteht darin, dass der atriale und der ventrikuläre Myozyt gleichzeitig unter den gleichen Verdauungsbedingungen isoliert werden können. Diese Methode könnte Einblicke in die Mechanismen von Herzerkrankungen auf zellulärer und subzellulärer Ebene geben.

Nachdem Sie eine acht bis 10 Wochen alte männliche C57-Maus eingeschläfert haben, verwenden Sie eine Gewebezange, um die Haut des Xiphoids anzuheben. Machen Sie dann mit einer Gewebeschere einen kleinen seitlichen Schnitt durch die Haut. Führen Sie eine stumpfe Dissektion zwischen Haut und Faszien durch.

Verlängern Sie den Hautschnitt in Richtung der Achselhöhlen in einer V-Form auf beiden Seiten und setzen Sie den Schnitt durch den Brustkorb fort. Klemmen Sie dann mit einer Gewebezange das Brustbein ein und lenken Sie den Brustkorb nach oben, um Herz und Lunge vollständig freizulegen. Ziehen Sie mit einer gekrümmten Pinzette das Perikard ab.

Wenn die Thymusdrüse die großen Gefäße bedeckt, verwenden Sie zwei gekrümmte Pinzetten, um die Thymusdrüse zu beiden Seiten zu reißen, und ziehen Sie dann vorsichtig die Basis des Herzens in Richtung Schwanz, bis die Aorta und ihre Astarterien als Y-förmiges Blutgefäß sichtbar sind. Transektieren Sie die Aorta an der linken gemeinsamen Halsschlagader und schneiden Sie dann die Arteria brachiocephalica. Schneiden Sie das Herz aus und tauchen Sie es sofort in eine Petrischale mit Tyrodes Lösung, um das Restblut zu waschen und abzupumpen.

Dann das Herz in eine andere Petrischale geben, die Lösung eins enthält. Schneiden Sie unter einem Stereomikroskop mit einer feinen Iris-Schere überschüssiges Gewebe ab. Drücken Sie Luftblasen aus der Spritze.

Führen Sie dann mit Hilfe von zwei geraden Bindezangen eine retrograde Aortenkanüle durch und achten Sie darauf, dass der gesamte Kanülierungsprozess unter der Flüssigkeitsoberfläche durchgeführt wird. Stellen Sie die Kanültiefe so ein, dass sich die Kanülenspitze in der aufsteigenden Aorta befindet, wobei darauf zu achten ist, dass die Aortenklappen nicht durchdrungen werden. Dann mit einer Vorknoten-3-O-Naht die Aorta zur Kanülenkerbe ligatieren.

Injizieren Sie vorsichtig die erste Lösung aus der Spritze, um das Restblut auszuspülen. Verbinden Sie dann das kanülierte Herz mit dem Langendorff-Gerät und achten Sie darauf, keine Luftblasen in das Herz einzuführen. Nachdem Sie das kanülierte Herz mit dem Langendorff-Gerät verbunden haben, ziehen Sie das Herz etwa zwei Minuten lang mit Lösung eins.

Ziehen Sie mit einer sterilen Einweg-Polyethylenpipette etwa 2,5 Milliliter Lösung drei auf und wärmen Sie sie im Wasserbad für den späteren Gebrauch vor. Dann, um die Gewebe zu verdauen, perfundieren Sie das Herz mit der restlichen Lösung drei für ungefähr 11 bis 12 Minuten. Nach den ersten zwei Minuten der Perfusion mit Lösung drei wird die durchblutete Lösung von der Peristaltikpumpe zur Wiederverwendung in die Perfusatreservoirs zurückgeführt, bis die Verdauung abgeschlossen ist.

Wenn das Herz geschwollen ist und leicht blass und schlaff wird, mit einer Gezähntzange vorsichtig das Myokard einklemmen. Wenn ein Abdruck sichtbar ist, beenden Sie die Verdauung und lösen Sie das Herz vom Apparat. Um die arteriellen und ventrikulären Myozyten zu isolieren, verwenden Sie eine Pinzette, um Ventrikel und Vorhöfe zu entfernen und sie in verschiedene Petrischalen zu legen.

Dann fügen Sie die vorgewärmte Lösung drei zu beiden Gerichten hinzu. Mit stumpfer Pinzette die Gewebe zu einer trüben Textur verdrängen und dann das Gewebe für eine gleichmäßige Verdauung vorsichtig pipettieren, ohne Luftblasen einzuführen. Um die verbleibende Enzymaktivität zu stoppen, übertragen Sie mit einer Pipette das trübe verdaute Gewebe in Lösung vier und zentrifugieren Sie dann für 20 Sekunden bei 192 mal G. Nach dem Entfernen des Überstands das Zellsediment in Lösung fünf resuspendieren.

Um Kalziumparadoxon und Kalziumüberlastung zu vermeiden, führen Sie das Kalzium schrittweise wieder ein, indem Sie der Zellsuspension schrittweise insgesamt 50 Mikroliter von 100 Millimol pro Liter Calciumchlorid hinzufügen. Sobald das gesamte Calciumchlorid hinzugefügt wurde, lagern Sie die Zellen in Tyrodes Lösung für die Patch-Clamp-Studie. Die Kanültiefe ist mit der Durchblutung der Vorhöfe und ihrer Anhängsel verbunden.

Wenn sich die Kanülenspitze an der aufsteigenden Aorta befindet, sind beide Vorhofanhänge aufgeblasen, was auf eine ausreichende Vorhofdurchblutung hinweist. Wenn sich die Kanülenspitze jedoch an der Aortenwurzel befindet, sind beide Vorhofanhänge verwischt, was auf eine unzureichende Perfusion hinweist. Vorhofmyozyten, die durch Kanülierung an der aufsteigenden Aorta isoliert wurden, hatten höhere Überlebensraten als diejenigen, die durch Kanülierung an der Aortenwurzel sowohl vor als auch nach der Wiedereinführung von Kalzium isoliert wurden.

Im Gegensatz dazu gab es keinen Unterschied in den Überlebensraten von ventrikulären Myozyten, die durch Kanülierung an der aufsteigenden Aorta oder der Aortenwurzel sowohl vor als auch nach der Calciumwiederansiedlung isoliert wurden. Die ganzzellige Patch-Clamp-Aufzeichnung des Natriumstroms in den isolierten vorhof- und ventrikulären Myozyten sowie der Stromdichten bestätigt, dass die Qualität der isolierten Zellen den Anforderungen für elektrophysiologische Experimente entspricht. Achten Sie beim Transektieren der Aorta darauf, eine ausreichende Drüse für die Ligatur beizubehalten.

Andernfalls kann die Kanüle nach der Ligatur in die Aortenklappe eindringen.