Künstliche Intelligenz Ansätze zur Beurteilung primärer Zilien
1. Mai 2021
Der Einsatz von künstlicher Intelligenz (Ai) zur Analyse von Bildern entwickelt sich im Vergleich zu häufig verwendeten Methoden zu einem leistungsfähigen, weniger voreingenommenen und schnellen Ansatz. Hier trainierten wir Ai, eine zelluläre Organelle, primäre Zilien zu erkennen und Eigenschaften wie Länge und Färbeintensität rigoros und reproduzierbar zu analysieren.
Aktuelle Methoden der Zilienanalyse sind arbeitsintensiv und anfällig für Fehler und Verzerrungen. Unser Ansatz zielt darauf ab, Zeit und Aufwand zu rationalisieren und gleichzeitig potenzielle Fehler zu minimieren. Der Hauptvorteil, den diese Technik bietet, ist eine erhöhte Strenge und Reproduzierbarkeit und quantitative Bildanalyse.
Diese Art von Ansatz ist nicht nur für die Zilienanalyse relevant, sondern kann auch auf viele zellbiologische Fragen angewendet werden, einschließlich derjenigen, die sich mit anderen Organellen und Zytoskelettproteinen befassen. Öffnen Sie zunächst das Trainings-Dataset, wählen Sie Datei aus dem Menü aus, klicken Sie auf Export importieren und wählen Sie ND-Datei aus Dateisequenz erstellen. Wählen Sie den Ordner aus, der den Trainingsdatensatz enthält, und die Liste der Dateien wird in der Mitte des Dialogfensters geöffnet.
Definieren Sie die Organisation von Dateien manuell mit mindestens einer Option im Dropdown-Menü. Geben Sie die entsprechenden numerischen Werte unter jeder ausgewählten Option ein und wählen Sie keine aus, wenn optionen nicht ausgewählt sind. Klicken Sie auf Konvertieren, um das ND-Dokument zu öffnen.
Um das Bild zu kalibrieren, klicken Sie mit der rechten Maustaste auf die option unkalibriert in der unteren linken Ecke des Bildes. Klicken Sie auf Dokument kalibrieren, klicken Sie dann auf Pixelgröße, geben Sie den Wert ein und klicken Sie auf OK. Wählen Sie die Steuerelemente für die Ansichtsanalyse aus, öffnen Sie die binäre Symbolleiste und wählen Sie automatische Erkennung oder Objekt zeichnen, um Zilien von Hand zu identifizieren, indem Sie einzelne Ziliarstrukturen auf allen geöffneten Rahmen präzise nachzeichnen.
Um die KI zu trainieren, wählen Sie nis. ai, klicken Sie auf Zugsegment. ai, um das Zugsegment zu öffnen.
ai box und wählen Sie dann den Quellkanal aus, der für das Training verwendet werden soll. Wählen Sie die entsprechenden GroundTruth-Binärdateien aus, um die KI zu trainieren. Wählen Sie die erforderliche Anzahl von Iterationen aus, um die KI in Abhängigkeit von der binären Größe und Verteilung zu trainieren, wählen Sie dann den Zielordner aus, um die trainierte KI-Datei zu speichern, und klicken Sie auf Trainieren, um die Software zu trainieren. Dieser Vorgang dauert mehrere Stunden.
Öffnen Sie die experimentellen konfokalen Bilder von Zilien wie zuvor beschrieben, indem Sie die Probe konvertieren. TIF-Dateien in ND2-Dateien. Wählen Sie im Popup-Fenster Multipoint aus dem ersten Dropdown-Menü aus und geben Sie einen Wert ein, der der Gesamtzahl der Bilder entspricht.
Wählen Sie im zweiten Dropdown-Feld Wellenlänge aus und ändern Sie den Wert in die Gesamtzahl der Kanäle im Ordner. Die Software entsperrt automatisch ein Wellenlängenauswahlfenster, das sich unten am rechten Ende des Popup-Fensters befindet. Verwenden Sie im Wellenlängenauswahlfenster das Dropdown-Menü Farbe, um die Farbe jedes Kanals auszuwählen.
Geben Sie jedem Kanal unter der Spalte Name einen anderen Namen an. Sobald alle Informationen aktualisiert wurden, klicken Sie auf Konvertieren. Kalibrieren Sie die Bilder wie zuvor beschrieben.
Stellen Sie sicher, dass die Pixelgröße des experimentellen Datasets mit der des Trainingsdatasets übereinstimmt. Identifizieren Sie Zilien auf dem ersten Kanal, indem Sie die trainierte KI aus dem vorherigen Schritt verwenden. Öffne nis.
ai aus dem Menü, wählen Sie Segment. ai, und wählen Sie dann AC3 in den Quellkanälen aus. Identifizieren Sie dann die Zilien auf dem zweiten Kanal, indem Sie MCHR1 in den Quellkanälen auswählen.
Die Software zeichnet Binärdateien auf den beschrifteten Zilien. Überprüfen Sie als Nächstes die Bilder auf falsch identifizierte Binärdateien. Wählen Sie objekt löschen in der binären Symbolleiste aus, um die falsch identifizierten Binärdateien manuell zu löschen.
Sobald die Zilien identifiziert und segmentiert wurden, analysieren Sie verschiedene Zilienparameter wie Längen und Intensitäten mit dem allgemeinen Analyse-Drei-Tool. Wählen Sie das Bild aus dem Menü aus und klicken Sie auf Neues GA3-Rezept. Ein neues Fenster mit einem Leerzeichen in der Mitte wird geöffnet.
GA3 erkennt automatisch die Binärdateien, die entsprechend der KI entsprechend gekennzeichnet sind, und schließt den entsprechenden Knoten ein. GA3 erkennt auch automatisch die Kanäle in den Bildern und zeigt ihre Registerkarten unter den Kanälen an. Die KI segmentiert alle Zilien wie Objekte im Rahmen und erkennt unvollständige Zilien entlang der Ränder des Rahmens.
Alle Messungen werden in einer einzigen Ausgabetabelle angezeigt. Die repräsentativen Bilder zeigen, dass die trainierte KI Zilien in vitro in den Bildern von IMCD-Zellen, primären Hypothalamuskulturen und Hippocampuskulturen richtig identifiziert hat, aber keine anderen nicht-ziliarischen Strukturen wie zytokinetische Brücken. Die Länge der Zilien reichte von 0,5 bis 4,5 Mikrometern in IMCD-Zellen und zwei bis 12 Mikrometern in der Hypothalamus- und Hippocampuskultur.
Die KI maß die Längen von AC3-markierten Zilien in vivo in den Bildern unseres bogenförmigen Kerns, paraventrikulären Kerns und Cornu Ammonis einer Region. Laut der Analyse reichten hypothalamische Zilien in vivo von einem bis 15 Mikrometern, wie in weißen und braunen Balken zu sehen. Während Zilien und die Cornu Ammonis-Region zwischen einem und 10 Mikrometern lagen, wie in grauen Balken zu sehen ist.
Interessanterweise war die Intensität des Ziliar-MCHR1 im paraventrikulären Kern stärker als die im Bogenkern. Die Intensitäten von MCHR1 gegenüber AC3 wurden aufgetragen, um ihre Überlappung zu messen. Die Mehrheit der Zilien war für beide Marker positiv, während einige Zilien entweder für AC3 oder MCHR1 positiv waren.
Um die Kolokalisation von MTHR1 innerhalb von AC3 zu quantifizieren, wurde manders Überlappungskoeffizient gemessen und es gab eine signifikante Zunahme der Überlappung im paraventrikulären Kern als im bogenförmigen Kern. Um die Intensität entlang der Länge der Zilien zu messen, wurde die Polarität der Zilien mit Centrin2-GFP als Basalmarker definiert. Dies ermöglichte es, die Basis der Zilien von den Spitzen der ARL13B-M Kirschpositivilien zu unterscheiden.
Änderungen der ARL13B-Intensität entlang der Länge der Zilien wurden beobachtet, wobei die ARL13B-Intensität an der Basis höher war als an der Spitze des Ciliums im Bogenkern, links zu sehen, sowie PVN, wie rechts zu sehen. Bei der Analyse von Daten mit diesem Ansatz ist es wichtig sicherzustellen, dass die Qualität und Auflösung des experimentellen Datensatzes mit derjenigen übereinstimmt, die zum Trainieren der KI verwendet wird. Der Hauptnutzen dieses Ansatzes besteht darin, dass der Benutzer nach der Erkennung von Zilien durch KI kreativ sein kann, welche Eigenschaften analysiert werden, indem er den in die Software integrierten Analyse-Workflow anpasst.
Übersicht
Dieser Artikel stellt einen auf künstlicher Intelligenz (KI) basierenden Workflow für die automatisierte Identifizierung und quantitative Analyse von Zilien in sowohl in-vivo- als auch in-vitro-Proben vor. Der Ansatz vereinfacht die Vermessung von Zilien, reduziert manuelle Arbeitsschritte und Bias und ermöglicht eine hochdurchsatzfähige, reproduzierbare Analyse der Zilienlänge, der Fluoreszenzintensität sowie der Ko-Lokalisation über verschiedene Zelltypen und Gewebe hinweg.
Wesentliche Studienkomponenten
Bereich der Wissenschaft
- Zellbiologie
- Bildanalyse
- Neurowissenschaften
Hintergrund
- Zilien sind auf Mikrotubuli basierende Organellen, die in Säugerzellen als Signalzentren fungieren.
- Die Länge von Zilien ist streng reguliert und variiert je nach Zelltyp und Gewebe, was die Signalübertragungskapazität beeinflusst.
- Herkömmliche Methoden zur Messung von Zilien sind zeitaufwändig, fehleranfällig und anfällig für Bias.
- Künstliche Intelligenz bietet das Potenzial für eine objektive und skalierbare Bildanalyse in der Zellbiologie.
Zweck der Studie
- Entwicklung und Demonstration einer auf künstlicher Intelligenz basierenden Methode zur automatisierten Identifizierung und Vermessung von Zilien.
- Ermöglichung einer schnellen, reproduzierbaren und unvoreingenommenen Analyse von Zilienmerkmalen in großen Datensätzen.
- Erleichterung des Vergleichs von Zilienmerkmalen zwischen verschiedenen Proben, Hirnregionen und experimentellen Bedingungen.
Verwendete Methoden
- Erstellung von Trainingsdatensätzen mit manuell annotierten Zilienbildern.
- Kalibrierung der Bilder und Training eines KI-Moduls zur Erkennung von Zilienstrukturen.
- Anwendung der trainierten KI zur Segmentierung von Zilien in experimentellen konfokalen Bildern.
- Automatisierte Messung der Zilienlänge, der Fluoreszenzintensität und der Marker-Kokokalisation mithilfe integrierter Analysetools.
Hauptergebnisse
- Die KI identifizierte Zilien präzise in vitro (IMCD-Zellen, hypothalamische und hippokampale Kulturen) und in vivo (Nucleus arcuatus, paraventrikulärer Nucleus, Cornu ammonis-Regionen).
- Die Längenverteilungen der Zilien wurden über verschiedene Zelltypen und Hirnregionen hinweg quantifiziert (z. B. 0,5–4,5 μm in IMCD-Zellen, 2–12 μm in hypothalamischen/hippocampalen Kulturen, 1–15 μm in hypothalamischen Zilien in vivo).
- Die Analyse der Fluoreszenzintensität zeigte regionale Unterschiede in der Expression ziliärer Marker (z. B. höhere MCHR1-Intensität im paraventrikulären Kern).
- Die Kolokalisierungsanalyse mittels Manders-Koeffizient zeigte eine signifikante Überlappung der Zilienmarker mit regionalen Unterschieden.
- Die Intensitätsprofilierung entlang der Zilienlänge zeigte eine Polarität mit höherer ARL13B-Intensität an der Basis im Vergleich zur Spitze.
Schlussfolgerungen
- Der auf KI basierende Workflow ermöglicht eine schnelle, unvoreingenommene und reproduzierbare Analyse von Zilien über mehrere Proben und Bedingungen hinweg.
- Dieser Ansatz erhöht die Genauigkeit und Zuverlässigkeit der quantitativen Bildanalyse.
- Die Methode lässt sich anpassen, um andere Organellen und zelluläre Strukturen in unterschiedlichen biologischen Kontexten zu analysieren.
Häufig gestellte Fragen
Ausschlaggebende Bedeutung für die Industrie
Die automatisierte, KI-gestützte Analyse von Zilien behebt einen kritischen Engpass in der quantitativen Zellbiologie, indem sie eine hochdurchsatzfähige, unvoreingenommene Messung von Zilienmerkmalen in verschiedenen Proben ermöglicht. Diese Fähigkeit erhöht die Vorhersagesicherheit in der frühen Entdeckung und Zielvalidierung, indem sie bildbasierte phänotypische Messgrößen standardisiert. Der Ansatz unterstützt die Erzeugung strenger, reproduzierbarer Daten, die für die Portfolio-Priorisierung und die Kontinuität translationsorientierter Forschung unerlässlich sind.
Strategische Anwendungen in der Biopharma-Forschung und -Entwicklung
Frühe Entdeckung und Zielvalidierung
- Ermöglicht eine robuste phänotypische Untersuchung durch Quantifizierung der Cilienlänge und Markerdichte über verschiedene Zelltypen hinweg.
- Unterstützt die mechanistische Risikominderung durch unvoreingenommene, reproduzierbare Ergebnisse der Bildanalyse.
- Erleichtert die funktionelle Zielvalidierung durch den Vergleich der Ciliendynamik unter verschiedenen experimentellen Bedingungen.
- Verbessert die Vorhersagesicherheit bei der Untersuchung von Signalwegen und der Überprüfung von Hypothesen.
Screening und Assay-Entwicklung
- Bereitet validierte Workflows für die Bildanalyse für nachgeschaltete Hochdurchsatz-Screenings vor.
- Standardisiert quantitative Ausgaben wie Länge, Intensität und Kollokalisierung, um die Reproduzierbarkeit von Assays zu gewährleisten.
- Ermöglicht skalierbare, automatisierte Analysen großer Datensätze und mehrerer Behandlungsgruppen.
- Unterstützt eine zuverlässige Substanzbewertung, indem Bediener-bedingte Verzerrungen und Fehler minimiert werden.
Translationale und präklinische Forschung
- Verknüpft phänotypische Messungen mit krankheitsrelevanten Systemen, indem vergleichende Analysen zwischen Proben und Regionen ermöglicht werden.
- Gewährleistet Kontinuität von der Entdeckung bis zur präklinischen Validierung durch standardisierte, bildbasierte Endpunkte.
- Liefert risikoadjustierte Kriterien für die Weiterentwicklung auf Grundlage quantitativer, reproduzierbarer Daten.
- Verbessert die translationale Biomarker-Entwicklung durch stringente Bildanalyse.
Pipeline- und Workflow-Integration
Diese auf KI basierende Bildanalysemethode reicht von der frühen Entdeckung über die Identifizierung von Wirkstoffkandidaten bis hin zur präklinischen Forschung und unterstützt die Hypothesenprüfung sowie die quantitative Phänotypisierung.
- Entdeckungsbasierte Biologie: Liefert unvoreingenommene, quantitative Messwerte für hypothesengetriebene Signalweganalysen.
- Screening: Bietet assaysfertige, reproduzierbare Workflows für die Bildanalyse in Hochdurchsatzanwendungen.
- Analytik: Erstellt standardisierte Messungen der Zilienlänge, -intensität und -Ko-Lokalisation zur zuverlässigen Datenvergleichbarkeit.
- Translationale Forschung: Ermöglicht die phänotypische Ausrichtung über Proben und Regionen hinweg für Biomarker-Studien.
- Unternehmensweite Wiederverwendung: Schafft eine skalierbare und anpassbare Plattform für die bildbasierte Analyse über Organellen und Zelltypen hinweg.
Operative und unternehmerische Auswirkungen
- Wissenschaftlicher Wert: Erhöht die Vorhersagesicherheit und verringert mechanistische Mehrdeutigkeiten in phänotypischen Assays.
- Operationaler Wert: Ermöglicht standardisierte, reproduzierbare und skalierbare Workflows für die Bildanalyse.
- Strategischer Wert: Verbessert die Qualität von Go/No-Go-Entscheidungen und die Kapitalnutzungseffizienz, indem biologische Risiken in späteren Phasen reduziert werden.
- Portfolio-Wirkung: Unterstützt die risikoadjustierte Priorisierung und Weiterentwicklung anhand quantitativer, unvoreingenommener Daten.
Durchführungsüberlegungen
- Erfordert Fachkenntnisse in der KI-Training, Bildkalibrierung und konfokalen Mikroskopie.
- Hängt von dem Zugang zu hochwertigen bildgebenden Geräten und einer analytischen Software-Infrastruktur ab.
- Erfordert eine standardisierte Vorgehensweise zwischen Teams bei der Bildaufnahme und Analyseparameterfestlegung.
- Anpassbar an verschiedene Zelltypen und Gewebe mit geeigneten Trainingsdatensätzen.
- Konsistenz in Bildauflösung und -qualität zwischen Trainings- und experimentellen Datensätzen ist unerlässlich.
