Name: Mikrochirurgische Obstruktion der Hodenfusion bei Spodoptera litura (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-07-16T13:00:00.000+00:00
Duration: 3 min 38 s
Description: Lernen Sie eine mikrochirurgische Methode zur Blockierung der Hodenfusion bei Spodoptera litura Larven. Diese Technik ermöglicht die Untersuchung von Organ-Kommunikation und Reproduktionsbiologie bei Insekten.

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Diese Arbeit wurde von der National Natural Science Foundation of China (Nr.: 31772519, 31720103916; ) und einem offenen Stipendium des State Key Laboratory of Silkworm Genome Biology, South West University (Nr.: sklsgb2013003) unterstützt.

1. Aufzucht und Pflege von Insekten
<ol><li>Kultivieren Sie die Spodoptera litura Larven in Umweltsimulationskammern mit einer künstlichen Diät, bis sie Tag 4 des 6. Instadiums (L6D4) erreichen. Wählen Sie männliche Larven aus, wenn die Würmer in den ersten Tag des 6. Instadiums (L6D0) eintreten, basierend auf der inversen dreieckigen Struktur am achten Bauch14. HINWEIS: Larvenaufzucht- und -pflegetechniken wurden bereits veröffentlicht4,14.</li>
</ol>2. Prächirurgische Vorbereitung
<ol><li>Schneiden Sie die Aluminiumfolie in rechteckige Stücke mit abgerundeten Ecken (1 mm x 2 mm, Abbildung 2).</li>
	<li>Sterilisieren Sie die Operationsplattform und verwandte Gegenstände (Tischoberfläche, Mikroskop, Eisfach, Insektenkasten, Wachsschale, Stifte und Faden), indem Sie 75% Alkohol auf ihre Oberfläche sprühen und abwischen.</li>
	<li>Sterilisieren Sie chirurgische Werkzeuge (einschließlich der Aluminiumfolie) mit einem Hochdruck-Dampfsterilisator für 30 min und stellen Sie sie in einen Heiz- und Trockenofen bei 120 ° C.</li>
	<li>Stellen Sie sicher, dass die Bediener saubere Laborkleidung, chirurgische Masken und sterile Handschuhe tragen.</li>
</ol>3. Mikrochirurgische Platzierung einer Barriere zwischen den Hoden
HINWEIS: Der allgemeine Arbeitsablauf ist wie folgt: Einfrieren → Fixieren → Desinfektion → Schneiden → Platzieren → Nähen von Barrieren→ Postoperative Fütterung und Inspektion
<ol><li>Legen Sie männliche Larven (L6D4) für 10-30 Minuten auf Eis, um sie während der Operation betäubt zu halten.</li>
	<li>Legen Sie eine Larve mit der dorsalen Seite nach oben auf die Wachsschale und fixieren Sie dann den Kopf und den Schwanz der Larve mit Stiften und Fäden, wobei der Operationsbereich, der die dorsale Oberfläche des 9. Körpersegments ist, gezeigt wird (Abbildung 3A).</li>
	<li>Desinfizieren Sie den Operationsbereich, indem Sie 3% Jodtinktur mit einem Wattestäbchen auf die Epidermis (9. Körpersegment) auftragen, gefolgt von 70% Alkohol, um das Jod zu entfernen (Abbildung 3B). HINWEIS: Konzentrieren Sie sich auf die Larve durch grobe und feine Einstellung des Operationsmikroskops (Abbildung 3C). Legen Sie die Wachsschale auf eine größere Kulturschale, die mit Eis gefüllt ist, um die Anästhesie aufrechtzuerhalten.</li>
	<li>Machen Sie einen 2 mm langen Schnitt an der dorsalen Epidermis des 9. Körpersegments. Als nächstes verwenden Sie ein steriles Wattestäbchen, um undichte Hämolymph- und Fettkörper zu entfernen und eine klare Sicht auf den Operationsbereich zu erhalten. HINWEIS: Es ist wichtig, das Herz während des Eingriffs zu vermeiden. Dies kann geschehen, indem der Schnitt leicht neben der Mittellinie im 9. Körpersegment oder am Gelenk zwischen dem 9. und 10. Körpersegment gemacht wird, um zu verhindern, dass die Hoden aufgrund des Larveninnendrucks herausspringen. Während Sie das Skalpell verwenden, machen Sie zuerst einen vertikalen Schlitz mit der Klinge (Abbildung 4A) und drehen Sie ihn dann um 45° in Richtung der Epidermis, bevor Sie gleichmäßig und kontinuierlich durch die Epidermis schneiden (Abbildung 4B).</li>
	<li>Verwenden Sie eine chirurgische Pinzette, um ein Stück Aluminiumfolie zwischen die Hoden einzuführen (Abbildung 5).</li>
	<li>Schließen Sie am Ende der Operation den Einschnitt, um eine Infektion zu vermeiden, und lassen Sie die Larven sich von der Operation erholen.<ol>
<li>Schließen Sie die Epidermis mit einer laufenden Naht (Abbildung 6).</li>
		<li>Verwenden Sie einen Nadelhalter und eine chirurgische Pinzette, um einen chirurgischen quadratischen Knoten zu binden, wobei zwei gegenüberliegende spiegelbildliche einfache Knoten erforderlich sind (Abbildung 6D, E).</li>
		<li>Verwenden Sie eine Schere, um die überschüssige Naht von den Schlaufenschwänzen zu schneiden und ein 2 mm langes Gewinde zurückzulassen.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Legen Sie die Larve nach dem Nähen vorsichtig in die Aufzuchtbox und pflegen Sie sie in einer sauberen Umweltsimulationskammer. Beobachten Sie die Larven weiter. HINWEIS: Die Wunde hört auf, Hämolymphe auszutreten, und die Larven erholen sich allmählich nach der Operation. Die Würmer schließen ihre Metamorphose weiter ab.</li>
</ol><img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62524/62524fig02.jpg"> Abbildung 2: Physische Barriere, die mit Aluminiumfolie (1 mm x 2 mm) hergestellt wurde. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62524/62524fig02large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62524/62524fig03.jpg"> Abbildung 3: Vor dem Schnitt. (A) Fixierung der Larve. (B) Desinfektion der Epidermis des Operationsbereichs. (C) Durchführung von Operationen unter dem Mikroskop. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62524/62524fig03large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62524/62524fig04.jpg"> Abbildung 4: Einschnitt . (A) Schneiden Sie die Larven vertikal mit der Klinge auf. (B) Drehen Sie die Klinge vor dem Durchschneiden um 45° in Richtung Epidermis. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62524/62524fig04large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62524/62524fig05.jpg"> Abbildung 5: Einsetzen der physischen Barriere (Aluminiumfolie) zwischen den Hoden. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62524/62524fig05large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62524/62524fig06.jpg"> Abbildung 6: Nähen . (A) Führen Sie die Nadel ein. (B) Ziehen Sie die Nadel zurück. (C) Ziehen Sie die Nadel zurück und klemmen Sie sie ein. (D) Binden Sie den ersten einfachen Knoten. (E) Binden Sie den gegenüberliegenden spiegelbildlichen einfachen Knoten. (F) Schneiden Sie überschüssiges Nahtgewinde ab. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62524/62524fig06large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.</a>

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</ol>

Die Autoren haben nichts offenzulegen.

Nach der mikrochirurgischen Behinderung der Hodenfusion in Spodoptera litura nahm die Anzahl der Spermienbündel ab, was die Hypothese stützte, dass diese Fusion für die Fortpflanzungsfähigkeit von Vorteil ist. Die chirurgische Manipulation wird seit dem frühen 20. Jahrhundert verwendet, um die physiologische Entwicklung von Insekten zu untersuchen. Um festzustellen, ob der Hirnnerv durch Insektenmetamorphose reguliert wird, führten einige Forscher Verfahren wie Ligatur und Enthauptung an verschiedenen...

Fusion ist ein häufiges Phänomen in der Gewebe- oder Organentwicklung. Beispiele hierfür sind der dorsale Verschluss und der Thoraxverschluss bei Drosophila1 und der Gaumenmorphogenese, die Neuralrohrmorphogenese und die Herzmorphogenese bei Mäusen und Hühnern2. CRISPR und RNAi wurden angewendet, um die Rolle von Genen im Fusionsprozess zu untersuchen2,3,4.
Spodoptera litura (S. litura, Lepidoptera: Noctuidae) ist ein schädlicher polyphager Schädling, der in tropischen und subtropischen Gebieten Asiens, einschließlich China, weit verbreitet ist4,5,6. Die weite Verbreitung von S. litura wird zum Teil auf seine starke Fortpflanzungsfähigkeit zurückgeführt, die für die Entwicklung von Gonaden relevant ist. Männliche Unfruchtbarkeit ist ein Ansatz, um diesen Schädling zu kontrollieren. Wie in der schematischen Abbildung der Hodenstruktur gezeigt, sind die Hoden von der Hodenscheide umgeben, einschließlich der äußeren Scheide (Peritonealscheide) und der inneren Basallamina. Die Basallamina erstreckt sich intern zur Bildung des Follikelepits und trennt den inneren Bereich des Hodens in vier Kammern, die Follikel genannt werden (Abbildung 1).
In den Follikeln entwickeln sich Spermatogonien nach Mitose und Meiose zu Spermatozoen, und dann richten sich die Spermatozoen in den Spermiensäcken in der gleichen Richtung aus, um Spermienbündel zu bilden7. Während der Spermatogenese differenzieren sich die primären Spermatozyten in Eupyrenspermien oder Apyrenspermien. Spermatozyten in der Larvenphase entwickeln sich zu Eupyrenspermien mit einem langen Schwanz, der mit einem Kopf eines länglichen Kerns verbunden ist; Diese können Eier befruchten. Umgekehrt entwickeln sich Spermatozyten in der mittleren Puppenphase zu Apyrenspermien mit einem verworfenen Kern; Diese Spermien unterstützen das Überleben, die Bewegung und die Befruchtung von Eupyrenspermien9,10. Der 6. Tag der Puppe ist der Zeitraum, in dem die Hoden reichlich Eupyren- und Apyren-Spermienbündel haben.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62524/62524fig01.jpg"> Abbildung 1: Schematische Darstellung der Hodenstruktur von Lepidoptera-Insekten11. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62524/62524fig01large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.</a>
Hodenfusion tritt bei den meisten Insekten der Lepidoptera-Ordnung auf11,12, insbesondere bei Arten, die landwirtschaftliche Schädlinge sind. Hodenfusion bezieht sich auf ein Hodenpaar, das in der Larvenphase bilateral wächst, sich einander nähert und anhaftet und sich schließlich in eine einzelne Gonade integriert11. Bei Spodoptera litura geschieht dies während der Metamorphose vom Larven- zum Puppenstadium. Von Tag 1 des 5. Instar (L5D1) bis Tag 4 des 6. Instar (L6D4) wächst das Hodenpaar allmählich an Größe, und die Farbe färbt sich hellgelb von elfenbeinweiß. Es wird schwach rot, wenn es die präpupale Phase erreicht (L6D5 bis L6D6). Zwei bilaterale symmetrische Hoden nähern sich während des präpupalen Stadiums aneinander, verschmelzen zu einem und drehen sich gegen den Uhrzeigersinn (dorale Ansicht), um in der Puppen- und Erwachsenenphase einen einzigen Hoden zu erzeugen11. Dieses Phänomen tritt bei Seidenraupen nicht auf, die eine beträchtliche wirtschaftliche Bedeutung haben und seit 5000 Jahren domestiziert sind13. Daher wird angenommen, dass die Fusion der Hoden die Fortpflanzungsfähigkeit verbessert.
Um die Bedeutung der Hodenfusion von Spodoptera litura zu bestimmen, ist es wichtig, die Auswirkungen der Blockierung des Prozesses zu untersuchen. In diesem Protokoll wurde Aluminiumfolie mikrochirurgisch zwischen die Hoden gelegt, um sie getrennt zu halten, und die daraus resultierenden Veränderungen in der Entwicklung der Insekten und ihrer Hoden wurden untersucht.

<table><tbody><tr><td>75% Reinigungsalkohol</td><td>Qingdao Hainuo Nuowei Disinfection Technology Co., Ltd</td><td>Q/370285HNW 001-2019</td><td></td></tr><tr><td>Farbige Stecknadeln</td><td>Deli Group Co., LTD</td><td>0042</td><td></td></tr><tr><td>Hornhautschere</td><td>Suzhou Xiehe Medical Device Co., Ltd</td><td>MR-S221A</td><td>Gebogene und stumpfe Spitze</td></tr><tr><td>Glad Aluminiumfolie</td><td>Clorox China (Guangzhou) Limited</td><td>831457</td><td>10 cm * 2,5 cm * 0,6</td></tr><tr><td>Medizinische Wattestäbchen (steril)</td><td>Winner Medical Co., Ltd.</td><td>601-022921-01</td><td></td></tr><tr><td>Medizinisches Jod-Wattestäbchen</td><td>Gewinner Medical Co., Ltd.</td><td>608-000247</td><td></td></tr><tr><td>Nadelhalter</td><td>Shanghai Medical Instruments (Group) Ltd., Corp.</td><td>J32030</td><td>14 cm feine</td></tr><tr><td>Nadel sterile chirurgische Klinge</td><td>Shanghai Pudong Jinhuan Medical Supplies Co., LTD</td> <td># 11</td><td></td></tr><tr><td>Suigical Klingenhalter</td><td>Shanghai Pudong Jinhuan Medical Supplies Co., LTD</td><td>K6-10</td><td>Gerade 3 #</td></tr> <tr><td>Nahtfaden mit Nadel</td><td>Ningbo Medical Stitch Needle Co., Ltd</td><td></td><td>Nadel: 3/8 Kreis, 2,5 * 8 ; Faden: Nylon, 6/0, 25 cm</td></tr><tr><td>Bindezange</td><td>Suzhou Xiehe Medical Device Co., Ltd</td><td>MR-F201T-3</td><td>Gerade Spitze; langer Griff; 0,12 mm-breiter Kopf</td></tr></tbody></table>

mikrochirurgische obstruktion der hodenfusion bei spodoptera litura

Microsurgical Obstruction of Testes Fusion in Spodoptera litura

Anstatt genetische Methoden wie RNA-Interferenz (RNAi) und regelmäßig interspaced kurze palindromische Wiederholungen (CRISPR) / CRISPR-assoziierte Endonuklease Cas9 zu verwenden, wurde eine physikalische Barriere mikrochirurgisch zwischen den Hoden von Spodoptera litura eingeführt, um die Auswirkungen dieser Mikrochirurgie auf ihr Wachstum und ihre Fortpflanzung zu untersuchen. Nach dem Einlegen von Aluminiumfolie zwischen den Hoden verlief die Häutung von Insekten während der Metamorphose normal. Das Wachstum und die Entwicklung von Insekten wurden nicht nennenswert verändert; Die Anzahl der Spermienbündel änderte sich jedoch, wenn die Hodenfusion durch die Mikrochirurgie gestoppt wurde. Diese Ergebnisse deuten darauf hin, dass die Blockierung der Hodenfusion die männliche Fortpflanzungsfähigkeit beeinflussen kann. Die Methode kann weiter angewendet werden, um die Kommunikation zwischen Organen zu unterbrechen, um die Funktion spezifischer Signalwege zu untersuchen. Im Vergleich zur konventionellen Chirurgie erfordert die Mikrochirurgie nur eine Gefrieranästhesie, die der Kohlendioxidanästhesie vorzuziehen ist. Die Mikrochirurgie minimiert auch den Bereich der Operationsstelle und erleichtert die Wundheilung. Die Auswahl von Materialien mit spezifischen Funktionen bedarf jedoch weiterer Untersuchungen. Die Vermeidung von Gewebeverletzungen ist bei Einschnitten während der Operation von entscheidender Bedeutung.

Die Auswirkungen der Mikrochirurgie auf das Wachstum und die Entwicklung von Spodoptera litura Die Mikrochirurgie hinterließ eine 2 mm lange Wunde an der dorsalen Larvenepidermis, die schließlich aufhörte, Hämolymphe auszulaufen und heilte. Die Larven durchliefen präpupale und pupale Stadien und schlossen sich ein, was darauf hindeutet, dass die Mikrochirurgie keinen großen Einfluss auf Wachstum und Entwicklung hatte. Als sich die Larven zu Puppen häuteten, ...

Aluminiumfolie wurde mikrochirurgisch zwischen die Hoden von Spodoptera litura eingeführt, um die Verschmelzung der Hoden zu behindern. Das Verfahren umfasst Einfrieren, Befestigen, Desinfizieren, Einschneiden, Platzieren der Barriere, Nähen, postoperative Fütterung und Inspektion. Dieser Ansatz bietet eine Methode, um die Gewebebildung zu stören.

Mikrochirurgische Obstruktion der Hodenfusion bei Spodoptera litura

Instead of using genetic methods like RNA interference (RNAi) and clustered regularly interspaced short palindromic repeats (CRISPR)/CRISPR-associated ...

Dieses Protokoll legt nahe, dass eine physikalische Methode angewendet werden kann, um bei der Lösung biologischer Probleme zu helfen. Diese Technik bietet eine Methode, um Material in Insekten mit minimalem Schnitt zu platzieren und den Einfluss der Mikrochirurgie auf die Entwicklung von Individuen zu untersuchen. Diese Methode kann auf andere Lepidoptera-Larven und andere Teile der Insekten, einschließlich des Kopfes und des Thorax, angewendet werden.Es ist sehr wichtig, Einschnitte in bestimmtes Material zu üben und geschickt zu nähen. Beginnen Sie damit, Spodoptera litura männliche Larven am Tag 4 des 6. Stadiums oder L6D4 für 10 bis 30 Minuten auf Eis zu legen, um sie während der Operation betäubt zu halten. Legen Sie die betäubte Larve mit der dorsalen Seite nach oben auf die Wachsschale.Befestigen Sie den Kopf und den Schwanz der Larve mit Stiften und Fäden und desinfizieren Sie den Operationsbereich, indem Sie 3% Jodtinktur mit einem Wattestäbchen auf die Epidermis auftragen, gefolgt von 70% Alkohol. Machen Sie einen 2 Millimeter langen Schnitt an der dorsalen Epidermis am 9. Körpersegment und verwenden Sie ein steriles Wattestäbchen, um undichte Hämolymphe und Fettkörper z

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JoVE Journal

Biology

Biologie

Drosophila melanogaster Hoden können schnell und effizient von erwachsenen Männern mit Sezieren Nadeln isoliert. Mit etwas Übung kann man leicht in ein oder zwei Tage zu isolieren einen Betrag von Hoden reicht für die Analyse von DNA oder RNA, die im Hochdurchsatz-Sequenzierung oder eher traditionellen Methoden der Molekularbiologie oder der Protein-Antikörper-oder Enzym-Assays.

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Verfahren zur Isolierung und Herstellung von Drosophila Hoden Proben (leben und fest) für die Bildgebung durch Phasenkontrast-und Fluoreszenzmikroskopie sind hierin beschrieben.

Die zytologische Analyse der Spermatogenese: Live-und Fest Zubereitungen aus<em&gt; Drosophila</em&gt; Hoden

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Lernen Sie eine mikrochirurgische Methode zur Blockierung der Hodenfusion bei Spodoptera litura Larven. Diese Technik ermöglicht die Untersuchung von Organ-Kommunikation und Reproduktionsbiologie bei Insekten.

Mikrochirurgische Obstruktion der Hodenfusion bei Spodoptera litura

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