Name: Färbung des Cytoplasma Ca2+ mit Fluo-4/AM in Apfelzellstoff (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-11-06T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 5 s
Description: Erfahren Sie die Isolierung lebensfähiger Protoplasten aus Apfelzellstoff und die Färbung von zytosolischem Ca²⁺ mit Fluo-4/AM für die Calcium-Imaging in Pflanzenzellen. Diese Methode ermöglicht nicht-invasive, schnelle und spezifische Detektion von Calciumdynamiken für die Forschung zur Fruchtentwicklung und Qualitätskontrolle.

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Diese Arbeit wurde vom Agricultural Variety Improvement Project der Provinz Shandong (2019LZGC007) und dem Fruit Tree Innovation Team des modernen Landwirtschaftsindustrietechnologiesystems Shandong (SDAIT-06-05) unterstützt.

1. Protoplastenextraktion
<ol><li>Bereiten Sie die Basislösung vor: 20 mM CaCl2,5 mM 2-(N-Morpholino)ethansulfonsäure und 0,4 M D-Sorbit. HINWEIS: Der pH-Wert der Basislösung wurde mit 0,1 M Tris-Puffer auf 5,8 eingestellt, durch 0,22 μm wasserlösliche Filter filtriert und bei 4 °C gelagert.</li>
	<li>Bereiten Sie die enzymatische Lösung vor: Mischen Sie 0,3% (w / v) Macerozym R-10 und 0,5% (w / v) Cellulase R-10 mit der Basislösung.</li>
	<li>0,5 ml enzymatische Lösung werden in ein 1,5 ml Zentrifugenröhrchen gegeben. Pflücken Sie einen gesunden und reifen Apfel. Dann schneiden Sie das Fruchtfleisch in 10 x 5 x 1 mm3 Größe (Abbildung 1A-1C).</li>
	<li>Die Fruchtfleischstücke in ein 1,5 ml Zentrifugenröhrchen mit enzymatischer Lösung geben und dann das Röhrchen schließen (Abbildung 1D).</li>
	<li>Inkubieren Sie das Röhrchen bei 28 °C für 1 h und schütteln Sie es mit 70 U / min in einem Shaker im Dunkeln.</li>
	<li>Waschen Sie die Zellstoffstücke. Saugen Sie die gesamte enzymatische Lösung ab und fügen Sie dann 0,5 ml der Basislösung hinzu.</li>
	<li>Zentrifuge bei 300 x g für 2 min bei Raumtemperatur.</li>
	<li>Um eine Protoplastensuspension zu erhalten, saugen Sie die Lösung vom Boden des Zentrifugenröhrchens ab (Abbildung 1E).</li>
</ol>2. Niedermolekulare Calciumionenfluoreszenzfärbung
<ol><li>Bereiten Sie die Fluo-4/AM-Ladelösung mit 2 mM Fluo-4/AM, 20% F-127 und 10x phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS:80 mMNa2HPO4,1,36 M NaCI, 20 mM KH2PO4und 26 mM KCI) im Verhältnis 1:1:2 vor.</li>
	<li>1 μL Fluo-4/AM-Ladelösung wird zu 99 μL der Protoplastensuspension in den 1,5-ml-Zentrifugenröhrchen hinzugefügt. Stellen Sie sicher, dass die Endkonzentration des Fluoreszenzfarbstoffs 5 μM beträgt. Mischen Sie die Lösung und schließen Sie dann die Tube.</li>
	<li>La3+ Behandlung: Bereiten Sie 100 μM La3+ Lösung mit 98 μL der Protoplastensuspension, 1 μL von 10 mM La3+und 1 μL Fluo-4/AM-Ladelösung vor. Mischen Sie die Lösung und schließen Sie die Tube.</li>
	<li>30 min bei 37 °C im Dunkeln inkubieren.</li>
	<li>Waschen Sie die Protoplasten durch Zentrifugation bei 300 x g für 2 min bei Raumtemperatur. Saugen Sie 70 μL der Lösung an und fügen Sie 70 μL der Basislösung hinzu.</li>
	<li>Inkubieren Sie die Protoplastensuspension bei 37 °C für 30 min, um sie vollständig zu entestern.</li>
	<li>15 μL der Protoplastensuspension absaugen und auf einen Objektträger tropfen.</li>
	<li>Unter einem Fluoreszenzmikroskop beobachten (Ergänzende Abbildung S1). HINWEIS: Verwenden Sie eine Farbkamera mit hoher Empfindlichkeit, d. h. 3,2 MP (2048 x 1536) CMOS-Sensor mit 3,45 μm Pixelauflösung.</li>
	<li>Wählen Sie den GFP-Kanal für die Bildgebung (20x). Stellen Sie die Helligkeit auf 0,5 ein. HINWEIS: Beleuchtung ist einstellbare Intensität LED-Lichtwürfel mit einem integrierten hart beschichteten Filterset. Die Anregungswellenlänge von Fluo-4/AM beträgt 490 nm.</li>
</ol>3. Protoplast-Lebensfähigkeitstest
<ol><li>Bereiten Sie die Fluoresceindiacetat (FDA) Stammlösung vor: FDA in Aceton auflösen, bis die Endkonzentration 1 mg / ml beträgt.</li>
	<li>Bereiten Sie die FDA-Arbeitslösung mit 1 μL der Stammlösung und 99 μL Aceton vor.</li>
	<li>Fügen Sie 1 μL FDA-Arbeitslösung zu 99 μL Protoplastensuspension hinzu. Mischen Sie die Lösung durch Pipettieren nach oben und unten und schließen Sie dann das Rohr. HINWEIS: Die Endkonzentration der FDA beträgt 100 μg/L.</li>
	<li>Bei Raumtemperatur 5 min im Dunkeln einfärben.</li>
	<li>Bereiten Sie die Objektträger vor und beobachten Sie sie unter einem Fluoreszenzmikroskop.</li>
	<li>Wählen Sie den GFP-Kanal für die Bildgebung aus (Abbildung 1F).</li>
</ol>4. Bildanalyse
<ol><li>Analysieren Sie die aufgenommenen Bilder mit Bildanalyse- und Tabellenkalkulationssoftware (z. B. Image-Pro Plus und Excel 2010).</li>
	<li>Wählen Sie zwei vertikale Durchmesser aus den Protoplasten aus, um die Fluoreszenzintensität zu berechnen (Ergänzende Abbildung S2). Messung der Fluoreszenzintensität aller Protoplasten unter verschiedenen Behandlungen wurde gemessen. Für die endgültige Verarbeitung verwenden Sie eine Fotobearbeitungssoftware.</li>
</ol>5. Statistische Auswertung
<ol><li>Führen Sie statistische Analysen mit statistischer Software durch (Ergänzende Abbildung S3). Die Daten werden in Mittelwert ± SD dargestellt. Der t-Testdes Schülers wurde verwendet, um die Unterschiede zwischen den experimentellen Gruppen zu analysieren.</li>
</ol>

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</ol>

Die Autoren erklären, dass sie keine Interessenkonflikte mit dem Inhalt dieses Artikels haben.

In dieser Studie wurden lebensfähige Protoplasten durch enzymatische Hydrolyse gewonnen. Beachten Sie, dass diese Methode frische Äpfel erfordert. Das vorliegende Protokoll ermöglicht die schnelle Isolierung einer großen Anzahl von Protoplasten aus Fruchtfleisch für den Einsatz in Forschungsstudien. Die Anwendbarkeit dieser Methode ist nicht auf "Fuji" beschränkt; die Protoplasten des Apfelmarks von 'Dounan' und 'Honey Crisp' können ebenfalls über dasselbe Protokoll extrahiert werden (Ergänzende Abbildung S4</str...

Ca2+ spielt eine wichtige Rolle bei der signaltransduktion und im Stoffwechsel1,2. Darüber hinaus reguliert es die Fruchtqualitätsmerkmale3,4 , einschließlichHärte,Zuckergehalt und Anfälligkeit für physiologische Störungen während der Lagerung5,6. Cytoplasmatisches Ca2+ spielt eine wichtige Rolle bei der Signaltransduktion und reguliert das Wachstum und die Entwicklung von Pflanzen7. Störung der zellulären Calciumhomöostase kann bittere Gruben in Äpfeln8, Braunfleckenkrankheit in Birnen9und Nabelschnurfäule in Tomaten10induzieren , die die Fruchtqualität beeinträchtigen und schwere wirtschaftliche Verluste verursachen3,11. Die Calciumbildgebung hat eine ausreichende räumliche und zeitliche Auflösung und ist eine wichtige Methode zur Beobachtung der Ca2+ Dynamik in lebenden Zellen12,13.
Derzeit gibt es zwei Hauptmethoden für die intrazelluläre Kalziumbildgebung in lebenden Zellen: Eine verwendet chemische kleinmolekulare Fluoreszenzsonden14und die andere ist der Genkodierungssensor (GECI)15,16. Angesichts der Schwierigkeit, ein stabiles transgenes System in Obstbäumen und einer längeren Fruchtentwicklung aufzubauen, ist GECIS für die Fluoreszenzbildgebung von Früchten Ca2+ ungeeignet.
Niedermolekulare Fluoreszenzsonden wie Fluo-4/AM haben einen besonderen Vorteil: Ihre AM-Esterform (zelldurchlässiges Acetoxymethylesterderivat) kann ohne Transfektion leicht in lebende Zellen geladen werden, was sie flexibel, schnell und nicht zytotoxisch macht17. Fluo-4/AM konnte erfolgreich in die Pollenröhre von Pyrus pyrifolia18 und Petunia,19 sowie in die Schließzellen20 und Wurzelhaare von Arabidopsis21geladen werden.
Derzeit gibt es nur wenige Berichte über die Calciumfluoreszenzfärbung von Zellstoffzellen22. Als wichtiger Mineralstoff spielt Kalzium eine Schlüsselrolle beim Wachstum und der Qualitätskontrolle von Baumfrüchten wie Äpfeln. Apfelbäume sind weltweit als wichtige Wirtschaftsart anerkannt, und Äpfel gelten als gesundes Lebensmittel23. In dieser Studie erhielten wir lebensfähige Protoplasten aus Apfelfruchtfleisch durch enzymatische Hydrolyse und luden dann niedermolekulare fluoreszierende Reagenzien in das Zytoplasma, um Ca2+nachzuweisen.

<table><tbody><tr><td>10-fache phosphatgepufferte Kochsalzlösung</td><td>Solarbio</td><td>P1022</td><td>PBS (phosphatgepufferte Lösung) ist eine Phosphatpufferlösung, die eine relativ stabile ionenische Umgebung und pH-Pufferkapazität bieten kann. Es ist eine Puffersalzlösung, die in der Biologie häufig für die molekulare Klonierung und Zellkultur verwendet wird. Der pH-Wert liegt bei 7,4.</td></tr><tr><td>2-(N-Morpholino)ethansulfonsäure</td><td>Solarbio</td><td>M8010</td><td>Biologischer Puffer</td></tr><tr><td>CaCl2&middot; 2H2O</td><td>Solarbio</td><td>C8370</td><td>Calciumchlorid-Dihydrat ist eine weiße oder graue Chemikalie, meist in körniger Form.</td></tr><tr><td>Cellulase R-10</td><td>Yakult Honsha</td><td>MX7352</td><td>Baut pflanzliche Zellwände ab.</td></tr><tr><td>D-Sorbit</td><td>Solarbio</td><td>S8090</td><td>Es hat gute feuchtigkeitsspendende Eigenschaften, verhindert das Austrocknen und verhindert, dass Zucker, Salz usw. kristallisieren.</td></tr><tr><td>F-127</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>P6867</td><td>Pluronic F-127 ist ein nichtionisches Tensidpolyol (Molekulargewicht von ca. 12500 Dalton), das sich als vorteilhaft erwiesen hat, um die Auflösung von wasserunlöslichen Farbstoffen und anderen Materialien in physiologischen Medien zu fördern.</td></tr><tr><td>FDA</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>F1303</td><td>FDA ist ein zellpermeiertes Esterase-Substrat, das als Viabilitätssonde dienen kann, die sowohl die enzymatische Aktivität misst, die zur Aktivierung ihrer Fluoreszenz erforderlich ist, als auch die Integrität der Zellmembran, die für die intrazelluläre Retention ihres fluoreszierenden Produkts erforderlich ist.</td></tr><tr><td>Fluo-4/AM</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>F14201</td><td>Der grün fluoreszierende Calciumindikator Fluo-4/AM ist eine verbesserte Version des Calciumindikators Fluo-3/AM. Das Fluo-4/AM lädt schneller und ist bei gleicher Konzentration heller. Er lässt sich gut mit einem 488 nm Argon-Ionenlaser anregen.</td></tr><tr><td>Fluoreszenzmikroskop</td><td>Thermo Fisher</td><td>EVOS Auto 2</td><td>Beobachten Sie das Fluoreszenzbild.</td></tr><tr><td>Macerozyme R-10</td><td>Yakult Honsha</td><td>MX7351</td><td>Baut pflanzliches Gewebe ab, um einzelne Zellen zu trennen.</td></tr><tr><td>Tris</td><td>Solarbio</td><td>T8060</td><td>Es wird häufig bei der Herstellung von Puffern in biochemischen und molekularbiologischen Experimenten verwendet.</td></tr></tbody></table>

färbung des cytoplasma ca2+ mit fluo-4/am in apfelzellstoff

Staining the Cytoplasmic Ca2+ with Fluo-4/AM in Apple Pulp

Zytosolisches Ca2+ spielt eine Schlüsselrolle bei der Pflanzenentwicklung. Die Calcium-Bildgebung ist die vielseitigste Methode, um dynamische Veränderungen von Ca2+ im Zytoplasma zu erkennen. In dieser Studie erhielten wir lebensfähige Protoplasten von Pulpazellen durch enzymatische Hydrolyse. Isolierte Protoplasten wurden mit dem niedermolekularen fluoreszierenden Reagenz (Fluo-4/AM) für 30 min bei 37 °C inkubiert. Die fluoreszierenden Sonden färbten erfolgreich zytosolisches Ca2+, sammelten sich aber nicht in Vakuolen an. La3+, ein Ca2+ Kanalblocker, verringerte die zytoplasmatische Fluoreszenzintensität. Diese Ergebnisse deuten darauf hin, dass Fluo-4 / AM verwendet werden kann, um Veränderungen des zytosolischen Ca2+ im Fruchtfleisch zu erkennen. Zusammenfassend stellen wir eine Methode vor, um Protoplasten effektiv aus Fleischzellen der Frucht zu isolieren und Ca2+ nachzuweisen, indem ein niedermolekulares Calciumfluoreszenzreagenz in das Zytoplasma von Pulpazellen geladen wird.

Nach dem oben beschriebenen Protokoll haben wir die enzymatische Methode verwendet, um lebensfähige Protoplasten aus der Pulpa zu erhalten (Abbildung 1). Einige Protoplasten hatten Vakuolen, andere nicht. Während die Protoplasten keine Fluoreszenz zeigten, wenn der Ca2+ Fluoreszenzindikator nicht in sie geladen wurde. Wenn Fluo-4/AM in die Protoplasten geladen wurde, wurde das Zytoplasma, aber nicht die Vakuole, fluoreszierend (Abbildung 2). Dieses Er...

Isolierte Protoplasten von Apfelpulpazellen wurden mit einem kalziumfluoreszierenden Reagenz beladen, um eine zytoplasmatischeCa2+-Konzentration nachzuweisen.

Färbung des Cytoplasma Ca2+ mit Fluo-4/AM in Apfelzellstoff

Cytosolic Ca2+ plays a key role in plant development. Calcium imaging is the most versatile method to detect dynamic changes in Ca2+ in the cytoplasm. In ...

Als wichtiges Mineralelement spielt Kalzium eine Schlüsselrolle beim Wachstum und der Qualitätskontrolle von Baumfrüchten wie Apfel, es kann die Härte, den Zuckergehalt, die Lagerdauer und die physiologische Störung während der Lagerung regulieren. Die Calcium-Bildgebung ist die westlichste Methode, um dynamische Veränderungen der Kalziumionen im Zytoplasma nachzuweisen. Niedermolekulare Fluoreszenzindikatoren wie Fluo-4 / AM haben eine Kalziumionen-spezifische Selektivität und können durch Veresterungsinkubation, die flexibel, schnell und nicht zytotoxisch ist, nichtinvasiv belastet werden.Dieses Protokoll wird eine Methode zum Laden von niedermolekularem chemischem fluoreszierendem Reagenz Fluo-4 / AM in pflanzliche Protoplasten einführen. Protoplastenextraktion 0,5 Milliliter Enzymlösung in ein 1,5 Milliliter Zentrifugenröhrchen geben. Wählen Sie einen gesunden und reifen Apfel und schneiden Sie das Fruchtfleisch in 10 mal 5 mal 1 Kubikliter Größe.Legen Sie die Zellstoffstücke in enzymatische Lösung und schließen Sie dann das Röhrchen. Inkubieren Sie die Tube bei 28 Grad für eine Stunde. Bei 70 U/min im Dunkeln gehackt.Danach waschen Sie die Zellstoffstücke, saugen die gesamte e

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Research

Forschung

JoVE Journal

Biology

Biologie

Ein robustes Konzept für die Lieferung von Organellen in den sauren Lumen der Hefe Vakuole für den Abbau und Recycling-Monitor beschrieben. Die Methode beruht auf der spezifischen Markierung von Zielorganellen mit einem genetisch kodierten Dual-Emissions-Fluoreszenz-pH-Biosensor und Visualisierung von einzelnen Zellen mittels Fluoreszenz-Mikroskopie.

Eine Fluoreszenz-Mikroskopie Assay zur Überwachung Mitophagy in der Hefe Saccharomyces cerevisiae

Spontane Aktivitäten zu entwickeln neuronalen Netzen kann mit Hilfe AM-Ester Formen von Calcium-sensitiven Indikator Farbstoffe werden. Änderungen der intrazellulären Calcium, was darauf hinweist neuronale Aktivierung, werden als vorübergehende Veränderungen in Indikator Fluoreszenz mit ein-oder Zwei-Photonen-Imaging nachgewiesen werden. Dieses Protokoll kann für eine Reihe von entwicklungs-abhängige neuronale Netze angepasst...

Functional Calcium Imaging in Entwicklungsländern Kortikale Netzwerke

In diesem Video beschreiben wir ein Färbeverfahren zur Visualisierung der Zelluloseablagerung in den Zellwänden von Arabidopsis thaliana, einer Dikotyledonenpflanze, unter Verwendung von Calcofluorweiß, das spezifisch an β-verknüpfte Glucane bindet und unter UV-Licht Fluoreszenz zeigt.

Calcofluor-Weißfärbung: Eine einfache Methode zur UV-induzierten Fluoreszenzvisualisierung von Zelluloseablagerungen in Zellwänden von Dikotyledonen-Pflanzenstängelschnitten

Wir beschreiben die Verwendung von Styryl FM Farbstoffe Bild synaptischen Vesikel-Recycling in der funktionellen Nervenenden. Dieses Protokoll kann nicht nur beschworen, sondern auch spontan und Miniatur synaptischen Tätigkeiten angewendet werden. Das Protokoll erweitert die Vielzahl von synaptischen Ereignisse, die effektiv ausgewertet werden können.

Die Untersuchung der synaptischen Vesikel Recycling Verwenden des UKW-Farbstoffe Während evozierte, spontan, und Miniatur Synaptic Aktivitäten

Die Zusammensetzung der pflanzlichen Zellwand variiert je nach Gewebetyp und kann Lignin, Zellulose, Hemicellulosen und Pektin umfassen. Es wurden verschiedene Färbetechniken entwickelt, um Unterschiede auf Zelltypebene sichtbar zu machen. Dieser Artikel ist eine Zusammenstellung häufig verwendeter Techniken zur Zellwandfärbung.

Histochemische Färbung von<em&gt; Arabidopsis thaliana</em&gt; Sekundärzellwand-Elemente

Die hier beschriebene Fluoreszenz-basierten Calciummobilisierungsassay ist ein Medium-Durchsatz Rückwärts pharmakologischen Screening-System für die Identifizierung von funktionell aktivierenden Liganden (n) der Orphan-G-Protein-gekoppelten Rezeptoren (GPCRs).

Charakterisierung von G-Protein gekoppelten Rezeptoren durch eine Fluoreszenz-basierte Calciummobilisierungsassay

Derzeit werden die meisten verfügbaren Kalziumindikatoren verwendet, um zytoplasmatische Kalziumtransienten als indirekte Maße für das aus dem sarkoplasmatischen Retikulum freigesetzte Kalzium in kultivierten glatten Muskelzellen zu quantifizieren. Dieses Protokoll beschreibt die Verwendung eines spezifischen FRET-basierten Indikators, der die direkte Messung von Calciumsignalen innerhalb des sarkoplasmatischen Retikulumlumens ermöglicht.

Die Messung von Calcium Schwankungen innerhalb des Retikulum von kultivierten glatten Muskelzellen Mit FRET-basierten konfokale Imaging

Mitochondria kann das elektrochemische Potential über ihre innere Membran (Δ &amp; psi; m) verwenden , Calcium (Ca 2+) zu maskieren, so dass sie cytosolischen Ca 2+ zu formen innerhalb der Zelle signalisiert. Wir beschreiben ein Verfahren zum gleichzeitigen Messen Mitochondrien Ca 2+ -Aufnahme und ΔΨ m in lebenden Zellen Fluoreszenzfarbstoffe und konfokale Mikroskopie.

Simultane Messung von Mitochondriale Calcium und mitochondrialen Membranpotentials in lebenden Zellen durch Fluoreszenzmikroskopie

In diesem Protokoll wir beschreiben Techniken für die richtige Zerlegung von Arabidopsis Blumen und Siliques, einige grundlegende Clearing-Techniken und Färbung Verfahren für ganz-Mount Beobachtungen der reproduktiven Strukturen ausgewählt.

Vollständig-hängen Clearing und Färbung des Arabidopsis Blume Organe und Siliques

Vitale Fluoreszenzfarbstoffe sind wesentliche Werkzeuge für livezellbildende Analysen in der modernen Pilzzellbiologie. Dieses Papier beschreibt die Anwendung etablierter und weniger bekannter Fluoreszenzfarbstoffe zur Verfolgung der Plasmamembrandynamik, Endo-/Exozytose und Zellwandmorphogenese in fadenförmigen Pilzen.

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Hier wird ein Verfahren beschrieben, um pflanzliches Gewebe transparent zu machen und gleichzeitig die Stabilität fluoreszierender Proteine zu erhalten. Diese Technik ermöglicht eine tiefe Bildgebung von gereinigtem Pflanzengewebe ohne physikalische Schnitte.

Optische Reinigung von Pflanzengeweben für die Fluoreszenzbildgebung

Erfahren Sie die Isolierung lebensfähiger Protoplasten aus Apfelzellstoff und die Färbung von zytosolischem Ca²⁺ mit Fluo-4/AM für die Calcium-Imaging in Pflanzenzellen. Diese Methode ermöglicht nicht-invasive, schnelle und spezifische Detektion von Calciumdynamiken für die Forschung zur Fruchtentwicklung und Qualitätskontrolle.

Färbung des Cytoplasma Ca²⁺ mit Fluo-4/AM in Apfelzellstoff

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