Analyse des Lymphknotenvolumens mittels Ultrahochfrequenz-Ultraschallbildgebung im gentechnisch veränderten Mausmodell des Melanoms von Braf/Pten

Unsere Methode ermöglicht es, die Zunahme der metastatischen Beteiligung von Leistenlymphknoten zu überwachen, indem die Zunahme ihres Volumens gemessen wird. Diese uninvasive Methode ist sehr gut verträglich, daher können mehrere bildgebende Sitzungen am selben Versuchstier über einen Zeitraum von zwei Wochen geplant werden. Diese Methode ist ideal, um die Auswirkungen der pharmakologischen Behandlung auf metastasierende Erkrankungen zu beurteilen.

Wir haben diese Methode auf das Braf/Pten-Melanommodell angewendet, aber im Prinzip kann sie angepasst werden, um die Wirksamkeit verschiedener Medikamente in einer Vielzahl von präklinischen Mausmodellen für metastasierenden Krebs zu bewerten. Das Verfahren wird von Dr. Marianna Vitiello, einer Postdoktorandin aus meinem Labor, und Dr. Claudia Kusmic, Forscherin am IFC-CNR, demonstriert. Für die Melanominduktion drei Mikroliter fünf-millimolar 4-Hydroxytamoxifen drei Tage hintereinander auf etwa einen Quadratzentimeter rasierte Haut des oberen Rückens auftragen.

Verwenden Sie sechs Wochen nach der Hautmalerei Bremssättel, um das Volumen des Primärtumors und schließlich der subkutanen Metastasen zu messen. Verwenden Sie dann die Ultraschallbildgebung, um das Volumen der Leistenlymphknoten zu messen. Nachdem Sie den Primärtumor und die Lymphknoten durch visuelle Inspektion analysiert haben, schneiden Sie sie für histologische Studien aus.

Nachdem Sie die Anästhesie bestätigt haben, bringen Sie das Tier auf eine beheizte Platte der Ultrahochfrequenz-Ultraschallbildgebungsstation und halten Sie das Tier in Rückenlage. Stellen Sie die Platinentemperatur mit einer mit Vaseline geschmierten Rektalsonde ein, um die Körpertemperatur der Maus im physiologischen Bereich zu halten. Beschichten Sie die Vorder- und Hinterpfoten mit leitfähiger Paste und kleben Sie sie auf die in die Platine eingebetteten EKG-Plattenelektroden.

Überprüfen Sie, ob die physiologischen Parameter korrekt erfasst und angezeigt werden. Entfernen Sie Haare aus beiden Leistenbereichen, indem Sie ein Enthaarungsmittel auftragen und mit einem akustischen Kopplungsmedium beschichten. Klemmen Sie dann die ultrahochfrequente Ultraschall-Linearsonde in einen speziellen 3D-Motor, der in die Bildgebungsstation eingebettet ist, um eine automatisierte und schrittweise Bewegung der Sonde zu ermöglichen.

Richten Sie die Position der Ultraschallsonde richtig aus und stellen Sie sie ein, um Bilder des Leistenlymphknotens mit kurzem Zugang zu erhalten, und platzieren Sie die interessierende Region in der Fokuszone. Stellen Sie den Scanabstand zwischen zwei und fünf Millimetern, die Schrittgröße auf 44 Mikrometer mit einem Ergebnis von 46 bis 114 Scanschritten pro Lymphknotenschnitt und eine Aufnahmezeit von ein bis drei Minuten pro Tier ein. Scannen Sie das gesamte Volumen des Leistenlymphknotens als Sequenz von 2D-B-Modus-Bildern und erfassen Sie Bilder auf mehreren Ebenen durch lineare Bewegung des Wandlers mit Schrittweiten auf einer Mikrometerskala, um 3D-Daten in Bezug auf Atmung und kardiale Cine-Schleifen zu erzeugen.

Speichern Sie die aufgenommenen Bilder nach der Bildgebung digital im Rohformat für weitere Offline-Analysen. Für die Nachbearbeitung von Ultraschallbildern öffnen Sie den Datensatz der 3D-Leistenlymphknotenbilder, wählen Sie die Multi-Slice-Methode und drücken Sie die Schaltfläche Start, um sowohl die aktuellen Frames als auch die Miniaturansichten aller Frames zu visualisieren, die jedem während der 3D-Aufnahme aufgenommenen Bild entsprechen. Wählen Sie die Miniaturansicht des ersten Frames aus, in dem der Lymphknoten sichtbar ist, um ihn in die Konturansicht zu laden.

Klicken Sie in der Konturansicht mit der linken Maustaste auf die Maus, um Punkte entlang des Randes des Lymphknotens abzulegen. Sobald die gewünschte Anzahl von Punkten festgelegt wurde, lecken Sie rechts, um die Kontur zu vervollständigen. Nachdem die erste Kontur abgeschlossen ist, verwenden Sie die Miniaturansicht, um das nächste Bild für die Konturierung auszuwählen.

Überspringen Sie bei Bedarf mehrere Bilder zwischen den Konturen, um die Anzahl der manuellen Spuren zu reduzieren, die für jedes 3D-Volumen erforderlich sind. Wiederholen Sie diesen Vorgang, bis das gesamte Volume skizziert wurde, und klicken Sie dann auf Fertig stellen. Klicken Sie im Arbeitsbereich des 3D-Modusfensters auf das Symbol für die Volumenmessung unter dem Bildanzeigebereich, um den numerischen Wert des Lymphknotenvolumens zu visualisieren, und aktivieren Sie die Oberflächenansicht mit dem 3D-Rendering des Lymphknotenvolumens.

Die Behandlung von Mäusen mit 4-Hydroxytamoxifen induziert CreER-Enzymaktivität und verursacht einen Wechsel auf genomischer Ebene von Wildtyp-Braf zu mutiertem Braf V600E, während Pten verloren geht. Vier Wochen nach der 4-Hydroxytamoxifen-Behandlung erreichen Primärtumoren ein Volumen von 50 bis 100 Kubikmillimetern und ihr Wachstum kann mit Bremssätteln für weitere zwei Wochen gemessen werden, wodurch eine allmähliche Zunahme der Pigmentierung in den Leistenlymphknoten beobachtet wird. Die Melaninablagerungen sind ausnahmslos auf das Vorhandensein von metastasierten Melanomzellen zurückzuführen, wie durch immunhistochemische Färbung des Melanomantigens MelanA und Braf V600E bestätigt wird.

Am Ende der Segmentierungsphase zeigten alle Abschnitte die Überlagerung der äußeren Kontur des Lymphknotens. Hier werden die 3D-Renderings eines rechten Leistenlymphknotens gezeigt, die nach vier, fünf und sechs Wochen nach der 4-HT-Behandlung analysiert wurden. Die Zunahme des Volumens der linken und rechten Leistenlymphknoten desselben Tieres im Laufe der Zeit wurde ebenfalls quantifiziert.

Es wird empfohlen, die Ultraschallbildgebung mit einer geeigneten immunhistochemischen Färbung zu koppeln, damit das Vorhandensein von Krebszellen auf molekularer Ebene bestätigt wird. Neben den Lymphknoten kann auch das Volumen der subkutanen Metastasierung im Laufe der Zeit mittels Ultraschallbildgebung überwacht werden. Wenn der Zeitrahmen von zwei Wochen zu kurz ist, um die Auswirkungen des untersuchten Arzneimittels zu beurteilen, wählen Sie eine peripherere Induktionsstelle oder einen weniger tumoranfälligen Genotyp.