Name: Drei Differentielle Expressionsanalysemethoden für die RNA-Sequenzierung: limma, EdgeR, DESeq2 (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-09-18T14:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 10 s
Description: Lernen Sie die differentielle Expressionsanalyse mit limma, EdgeR und DESeq2 für RNA-Sequenzierungsdaten. Diese Methoden ermöglichen die Identifizierung differentiell exprimierter Gene in Cholangiokarzinom-Proben.

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Diese Arbeit wurde von der National Natural Science Foundation of China (Grant No. 81860276) und Key Special Fund Projects des National Key R&D Program (Grant No. 2018YFC1003200) unterstützt.

HINWEIS: Öffnen Sie das R-studio-Programm und laden Sie die R-Datei "DEGs.R", die Datei kann aus Ergänzenden Dateien/Skripten erworben werden.
1. Herunterladen und Vorverarbeitung von Daten
<ol><li>Laden Sie die Hochdurchsatz-Sequenzierungsdaten (HTSeq) des Cholangiokarzinoms (CHOL) aus dem Cancer Genome Atlas (TCGA) herunter. Dieser Schritt kann leicht durch den folgenden R-Code erreicht werden.<ol>
<li>Klicken Sie auf Ausführen, um R-Pakete zu installieren.</li>
		<li>Klicken Sie auf Ausführen, um R-Pakete zu laden. if(!requireNamespace("BiocManager", quietly=TRUE)) + install.packages("BiocManager") BiocManager::install(c("TCGAbiolinks", "SummarizedExperiment"))</li>
		<li>Legen Sie das Arbeitsverzeichnis fest. Bibliothek (TCGAbiolinks) Bibliothek(Zusammengefasstes Experiment) setwd("C:/Benutzer/LIUSHIYI/Desktop")</li>
		<li>Wählen Sie die Krebsart. Krebs < - "TCGA-CHOL"</li>
		<li>Führen Sie den R-Code aus der Datei "GDCquery.R" aus, um die Daten herunterzuladen. Die Datei "GDCquery.R" kann aus Ergänzenden Dateien/Skripten entnommen werden: source("Ergänzende Dateien/Skripte/GDCquery.R") Kopf(cnt) Nr. #TCGA-3X-AAVA-01A-11R-A41I-07 Nr. #ENSG00000000003 4262 Nr. #ENSG00000000005 1 Nr. #ENSG00000000419 1254 Nr. #ENSG00000000457 699 Nr. #ENSG00000000460 239 Nr. #ENSG00000000938 334 HINWEIS: Nach der Ausführung werden die CHOLHTSeq-Zähldaten heruntergeladen und "cnt" genannt, wobei Zeilen Ensemble-Gen-IDs und Spalten Beispiel-IDs darstellen. Bitte beachten Sie die Nummern an den Positionen 14-15 in den Muster-IDs; Zahlen von 01 bis 09 weisen auf Tumore hin und von 10 bis 19 auf normale Gewebe.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Konvertieren Sie Ensemble-Gen-IDs in Gensymbole.<ol>
<li>Importieren Sie die Anmerkungsdatei entsprechend ihrem Speicherpfad in R. Die Anmerkungsdatei (gencode.v22.annotation.gtf) kann aus Ergänzungsdateien abgebildet werden. gtf_v22 <- rtracklayer::import('Supplementary files/gencode.v22.annotation.gtf')</li>
		<li>Führen Sie den R-Code aus dem "gtf_v22. R"-Datei, die aus Ergänzenden Dateien/Skripten erworben werden kann: source("Ergänzende Dateien/Skripte/gtf_v22. R")</li>
		<li>Wenden Sie die Funktion "ann" an, um die Ensemble-Gen-IDs in Gensymbole umzuwandeln. cnt=ann(cnt;gtf_v22)</li>
	</ol>
</li>
	<li>Filtern von niedrig exprimierten Genen<ol>
<li>Klicken Sie auf Ausführen, um das R-Paket "edgeR" zu installieren. BiocManager::install("edgeR")</li>
		<li>Klicken Sie auf Ausführen, um das R-Paket "edgeR" zu laden. Bibliothek(edgeR)</li>
		<li>Führen Sie den folgenden R-Code aus, um Gene mit CPM-Werten (Counts per Million) größer als eins in mindestens zwei Stichproben zu halten. keep <- rowSums(cpm(cnt)>1)>=2 cnt <- as.matrix(cnt[keep,]) HINWEIS: Der CPM-Wert (Counts per Million) wird anstelle der Leseanzahl verwendet, um die durch unterschiedliche Sequenzierungstiefen verursachte Abweichung zu eliminieren.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. Differentielle Expressionsanalyse durch "Limma"
<ol><li>Klicken Sie auf Ausführen, um das R-Paket "limma" zu installieren. BiocManager::install("limma")</li>
	<li>Klicken Sie auf Ausführen, um die R-Pakete "limma", "edgeR" zu laden. Bibliothek(limma) Bibliothek(edgeR)</li>
	<li>Führen Sie den folgenden R-Code aus, um die Entwurfsmatrix zu erstellen. Gruppe <- substring(colnames(cnt),14,15) # Extract group information Gruppe [Gruppe %in% "01"] <- "Cancer" # set '01' as tumor tissue Gruppe [Gruppe %in% "11"] <- "Normal" # set '11' as normal tissue Gruppe <- factor (group, levels = c("Normal","Cancer"))
	<ol><li>Erstellen Sie die Entwurfsmatrix. Design <- model.matrix (~group) Rownames(Design) <- colnames(cnt)</li>
		<li>Erstellen Sie das DGEList-Objekt. dge <- DGEList(counts = cnt, group = group)</li>
		<li>Normalisieren Sie die Daten. dge <- calcNormFactors(dge, method = "TMM")</li>
		<li>Führen Sie den folgenden R-Code aus, um die auf der Limma-Trend-Methode basierende Differentielle Ausdrucksanalyse durchzuführen. dge ##An Objekt der Klasse "DGEList" ##$counts Nr. #TCGA-3X-AAVA-01A-11R-A41I-07 Nr. #TSPAN6 4262 Nr. #DPM1 1254 Nr. #SCYL3 699 Nr. #C1orf112 239 Nr. #FGR 334</li>
		<li>Berechnen Sie den CPM-Wert. logdge <- cpm(dge, log=TRUE, prior.count=3)</li>
		<li>Klicken Sie auf Ausführen, um ein lineares Modell anzupassen, um die Daten vorherzusagen oder die Beziehung zwischen Variablen abzuleiten. fit <- lmFit (logdge, Design)</li>
		<li>Berechnen Sie den T-Wert, den F-Wert und die Log-Quoten basierend auf Bayesian. fit <- eBayes(fit, trend=TRUE)</li>
		<li>Extrahieren Sie die Ergebnistabelle. res_limma<- as.data.frame(topTable(fit,n=Inf)) Kopf(res_limma) ## logFC AveExpr t P.Value adj. P.Val B ##RP11-252E2.2 -4.899493 -2.488589 -20.88052 2.386656e-25 4.931786e-21 47.28823 ##BX842568.1 -4.347930 -2.595205 -20.14532 1.082759e-24 1.118706e-20 45.83656 ##CTC-537E7.3 -5.154894 -2.143292 -19.59571 3.452354e-24 2.216114e-20 44.72001 ##RP11-468N14.3 -6.532259 -2.029714 -19.49409 4.289807e-24 2.216114e-20 44.51056 ##AP006216.5 -4.507051 -2.670915 -19.25649 7.153356e-24 2.956339e-20 44.01704 ##RP11-669E14.4 -4.107204 -2.828311 -18.93246 1.448209e-23 4.987633e-20 43.33543 #The Ergebnis der differentiellen Expressionsanalyse wird in "res_limma" gespeichert, das die Gen-ID, den log2-Fachänderungswert (logFC), das durchschnittliche log2-Expressionsniveau des Gens im Experiment (AveExpr), die modifizierte t-Statistik (t), den relaventen p-Wert (P.-Wert), den falschen Entdeckungsrates-korrigierten p-Wert (FDR) (adj. P.Val) und die Log-Quoten differentiell exprimierter Gene (B) HINWEIS: Die Funktion "calcNormFactors()" des "edgeR" wurde verwendet, um die Daten zu normalisieren, um den Einfluss zu eliminieren, der durch Probenvorbereitung oder Bibliotheksaufbau und -sequenzierung verursacht wird. Bei der Konstruktion der Designmatrix ist es notwendig, das experimentelle Design (z. B. Gewebetyp: Normales oder Tumorgewebe) mit den Proben-IDs der Matrix abzugleichen. limma-trend eignet sich für Daten, deren Sequenzierungstiefe gleich ist, während limma-voom geeignet ist: (i) wenn die Größe der Stichprobenbibliothek unterschiedlich ist; ii) Daten, die nicht durch TMM normalisiert wurden; (iii) es gibt viel "Rauschen" in den Daten. Ein positiver logFC bedeutet, dass das Gen im Experiment hochreguliert wird, während die negative Zahl bedeutet, dass das Gen herunterreguliert wird.</li>
		<li>Identifizieren Sie die DEGs. res_limma$sig <- as.factor( ifelse(res_limma$adj. P.Val < 0.05 & abs(res_limma$logFC) > 2, ifelse(res_limma$logFC > 2 ,'up','down'),'not')) # Der adj.p-Wert < 0,05 und der |log2FC| >= 2 sind Schwellenwerte zur Identifizierung der DEGs Zusammenfassung(res_limma$sig) ##down nicht oben ##1880 ​17341 1443</li>
		<li>Geben Sie die Ergebnistabelle in eine Datei aus. write.csv(res_limma, file = 'result_limma.csv')</li>
		<li>Klicken Sie auf Ausführen, um das R-Paket "ggplot2" zu installieren. install.packages("ggplot2")</li>
		<li>Klicken Sie auf Ausführen, um das R-Paket "ggplot2" zu laden. Bibliothek(ggplot2)</li>
		<li>Führen Sie den R-Code vom Vulkan aus. R", um die Vulkanhandlung zu erstellen. Die Datei "volcano. R" kann aus Ergänzungsdateien erworben werden. Quelle("Ergänzende Dateien/Skripte/Vulkan. R") vulkan(res_limma,"logFC","adj. P.Val",2,0.05) HINWEIS: Gene können entsprechend ihren log2FC- und adj-p-Werten auf verschiedene Positionen abgebildet werden, die nach oben regulierten DEGs sind rot gefärbt und die herunterregulierten DEGs sind grün gefärbt.</li>
		<li>Klicken Sie auf Exportieren, um das Vulkandiagramm zu speichern. HINWEIS: Die Vulkanplots können in verschiedenen Formaten (z.B. pdf, TIFF, PNG, JPEG Format) generiert und heruntergeladen werden. Gene können entsprechend ihren log2FC- und adj p-Werten auf verschiedene Positionen abgebildet werden, die hochregulierten DEGs (log2FC > 2, adj p < 0,05) sind rot eingefärbt und die herunterregulierten DEGs (log2FC < -2, adj p < 0,05) sind grün eingefärbt, Nicht-DEGs sind grau gefärbt.</li>
	</ol></li>
</ol>3. Differentialausdrucksanalyse durch "edgeR"
<ol><li>Klicken Sie auf Ausführen, um das R-Paket "edgeR" zu laden. Bibliothek(edgeR)</li>
	<li>Führen Sie den folgenden R-Code aus, um eine Entwurfsmatrix zu erstellen. Gruppe <-Teilzeichenfolge(colnames(cnt),14,15) Gruppe [Gruppe %in% "01"] <- "Krebs" Gruppe [Gruppe %in% "11"] <- "Normal" group=factor(group, levels = c("Normal","Krebs")) Design <-model.matrix(~group) Rownames(Design) = Colnames(cnt)</li>
	<li>Klicken Sie auf Ausführen, um das DGEList-Objekt zu erstellen. dge <- DGEList(counts=cnt)</li>
	<li>Normalisieren Sie die Daten. dge <- calcNormFactors(dge, method = "TMM")</li>
	<li>Klicken Sie auf Ausführen, um die Streuung der Genexpressionswerte abzuschätzen. dge <- estimateDisp(dge, design, robust = T)</li>
	<li>Klicken Sie auf Ausführen, um das Modell zum Zählen von Daten anzupassen. fit <- glmQLFit(dge, design)</li>
	<li>Führen Sie einen statistischen Test durch. fit <- glmQLFTest(fit)</li>
	<li>Extrahieren Sie die Ergebnistabelle. Das Ergebnis wird in "res_edgeR" gespeichert, das den Log-Fold-Änderungswert, den Log-CPM,F-, p-Wert und den FDR-korrigierten p-Wert enthält. res_edgeR=as.data.frame(topTags(fit, n=Inf)) Kopf(res_edgeR) ## logFC logCPM F PValue FDR ##GCDH -3.299633 5.802700 458.5991 1.441773e-25 2.979280e-21 ##MSMO1 -3.761400 7.521111 407.0416 1.730539e-24 1.787993e-20R ##CL1 -3.829504 5.319641 376.5043 8.652474e-24 5.516791e-20 ##ADI1 -3.533664 8.211281 372.6671 1.067904e-23 5.516791e-20 ##KCNN2 -5.583794 3.504017 358.6525 2.342106e-23 9.679455e-20 ##GLUD1 -3.287447 8.738080 350.0344 3.848408e-23 1.194406e-19 #The Ergebnis wird in "res_edgeR" gespeichert, das den Log Fold Change Value (logFC), log CPM, F, p-Wert und FDR-korrigierten p-Wert enthält</li>
	<li>Identifizieren Sie die DEGs. res_edgeR$sig = as.factor( ifelse(res_edgeR$FDR < 0.05 & abs(res_edgeR$logFC) > 2, ifelse(res_edgeR$logFC > 2 ,'up','down'),'not')) Zusammenfassung(res_edgeR$sig) ##down nicht oben ##1578 15965 3121</li>
	<li>Geben Sie die Ergebnistabelle in eine Datei aus. write.csv(res_edgeR, file = 'res_edgeR.csv')</li>
	<li>Erstellen Sie das Vulkandiagramm. Vulkan(res_edgeR,"logFC","FDR",2,0.05)</li>
	<li>Klicken Sie auf Exportieren, um das Vulkandiagramm zu speichern.</li>
</ol>4. Differentialexpressionsanalyse durch "DESeq2"
<ol><li>Klicken Sie auf Ausführen, um die R-Pakete "DESeq2" zu installieren. BiocManager::install("DESeq2")</li>
	<li>Klicken Sie auf Ausführen, um R-Pakete "DESeq2" zu laden. Bibliothek(DESeq2)</li>
	<li>Führen Sie den folgenden R-Code aus, um den Gruppierungsfaktor zu bestimmen. Gruppe <-Teilzeichenfolge(colnames(cnt),14,15) Gruppe [Gruppe %in% "01"] <- "Krebs" Gruppe [Gruppe %in% "11"] <- "Normal" group=factor(group, levels = c("Normal","Krebs"))</li>
	<li>Erstellen Sie das DESeqDataSet-Objekt. dds <-DESeqDataSetFromMatrix (cnt, DataFrame(group), design = ~group) Dds ##class: DESeqDataSet Nr. #dim: 20664 45 ##metadata(1): Version ##assays(1): zählt ##rownames(20664): TSPAN6 DPM1 ... RP11-274B21.13 LINC01144 ##rowData Namen(0): ##colnames(45): TCGA-3X-AAVA-01A-11R-A41I-07 ... ##colData Namen(1): Gruppe</li>
	<li>Führen Sie die Analyse durch. dds <- DESeq(dds)</li>
	<li>Generieren Sie die Ergebnistabelle. res_DESeq2 <- data.frame(results(dds)) Kopf(res_DESeq2) ## baseMean log2FoldChange lfcSE stat pvalue padj ##TSPAN6 4704.9243 -0.8204515 0.3371667 -2.433370 1.495899e-02 2.760180e-02 ##DPM1 1205.9087 -0.3692497 0.1202418 -3.070894 2.134191e-03 4.838281e-03 ##SCYL3 954.9772 0.2652530 0.2476441 1.071106 2.841218e-01 3.629059e-01 ##C1orf112 277.7756 0.7536911 0.2518929 2.992109 2.770575e-03 6.101584e-03 ##FGR 345.8789 -0.6423198 0.3712729 -1.730047 8.362180e-02 1.266833e-01 ##CFH 27982.3546 -3.8761382 0.5473363 -7.081823 1.422708e-12 1.673241e-11 HINWEIS: Das Ergebnis wird in "res_DESeq2" gespeichert, das den Mittelwert der normalisierten Leseanzahl (baseMean), den Log-Fold-Änderungswert (log2FoldChange), den Log-Fold-Change-Standardfehler (lfcSE), die Wald-Statistik (stat), den ursprünglichen p-Wert (pvalue) und den korrigierten p-Wert (padj) enthält.</li>
	<li>Identifizieren Sie DEGs. res_DESeq2$sig = as.factor( ifelse(res_DESeq2$padj < 0.05 & abs(res_DESeq2$log2FoldChange) > 2, ifelse(res_DESeq2$log2FoldChange > 2 ,'up','down'),'not')) Zusammenfassung(res_DESeq2$sig) ##down nicht oben ##1616 16110 2938</li>
	<li>Geben Sie die Ergebnistabelle in eine Datei aus. write.csv(res_DESeq2, file = 'res_DESeq2.csv')</li>
	<li>Erstellen Sie das Vulkandiagramm. vulkan(res_DESeq2,"log2FoldChange","padj",2,0.05)</li>
	<li>Klicken Sie auf Exportieren, um das Vulkandiagramm zu speichern.</li>
</ol>5. Venn-Diagramm
<ol><li>Klicken Sie auf Ausführen, um das R-Paket "VennDiagram" zu installieren. install.packages("VennDiagram")</li>
	<li>Klicken Sie auf Ausführen, um das R-Paket "VennDiagram" zu laden. Bibliothek (VennDiagram)</li>
	<li>Erstellen Sie ein Venn-Diagramm von regulierten DEGs. grid.newpage() grid.draw(venn.diagram(list(Limma=rownames(res_ limma[res_limma$sig=="up",]), edgeR=rownames(res_edgeR[res_edgeR$sig=="up",]), DESeq2=Zeilennamen(res_DESeq2[res_DESeq2$sig== "up",])), NULL,Höhe = 3,Breite = 3,Einheiten = "in", col="black",lwd=0.3,fill=c("#FF6666","#FFFF00", "#993366"), alpha=c(0,5, 0,5, 0,5),main = "Hochregulierte DEGs"))</li>
	<li>Klicken Sie auf Exportieren, um das Venn-Diagramm zu speichern.</li>
	<li>Erstellen Sie ein Venn-Diagramm von herunterregulierten DEGs. grid.newpage() grid.draw(venn.diagram(list(Limma=rownames(res_ limma[res_limma$sig=="down",]), edgeR=Zeilennamen(res_edgeR[res_edgeR$sig== "unten",]), DESeq2=rownames(res_DESeq2[res_DESeq2$sig=="down",])), NULL,Höhe = 3,Breite = 3,Einheiten = "in", col="black",lwd=0.3,fill=c("#FF6666","#FFFF00", "#993366"), alpha=c(0,5, 0,5, 0,5),main = "Down-regulated DEGs"))</li>
	<li>Klicken Sie auf Exportieren, um das Venn-Diagramm zu speichern.</li>
</ol>

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<li>Reeb, P. D., Steibel, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluating+statistical+analysis+models+for+RNA+sequencing+experiments%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Genetics%22%5BJournal%5D)">Evaluating statistical analysis models for RNA sequencing experiments.</a> Frontiers in Genetics. 4, 178(2013).</li>
<li>Rocke, D. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Excess+False+Positive+Rates+in+Methods+for+Differential+Gene+Expression+Analysis+using+RNA-Seq+Data%5BTitle%5D)+AND+%22bioRxiv%22%5BJournal%5D)">Excess False Positive Rates in Methods for Differential Gene Expression Analysis using RNA-Seq Data.</a> bioRxiv. , (2015).</li>
<li>Agarwal, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+and+calibration+of+transcriptome+data+from+RNA-Seq+and+tiling+arrays%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+genomics%22%5BJournal%5D)">Comparison and calibration of transcriptome data from RNA-Seq and tiling arrays.</a> BMC genomics. 11, 383(2010).</li>
<li>Leng, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((EBSeq%3A+an+empirical+Bayes+hierarchical+model+for+inference+in+RNA-seq+experiments%5BTitle%5D)+AND+%22Bioinformatics%22%5BJournal%5D)">EBSeq: an empirical Bayes hierarchical model for inference in RNA-seq experiments.</a> Bioinformatics. 29, Oxford, England. 1035-1043 (2013).</li>
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Das Manuskript wurde noch nicht veröffentlicht und wird nicht für eine Veröffentlichung an anderer Stelle in Betracht gezogen. Alle Autoren haben zur Erstellung dieses Manuskripts für wichtige intellektuelle Inhalte beigetragen und das endgültige Manuskript gelesen und genehmigt. Wir erklären, dass kein Interessenkonflikt besteht.

Reichlich vorhandene Aberrat-Transkripte bei Krebserkrankungen können leicht durch RNA-seq-Differentialanalyse identifiziert werden5. Die Anwendung der RNA-seq-Differentialexpressionsanalyse ist jedoch oft eingeschränkt, da sie bestimmte Kenntnisse mit der R-Sprache und die Fähigkeit, geeignete Methoden zu wählen, erfordert. Um dieses Problem anzugehen, bieten wir eine detaillierte Einführung in die drei bekanntesten Methoden (limma, EdgeR und DESeq2) und Tutorials zur Anwendung der RNA-seq-Differ...

Die RNA-Sequenzierung (RNA-seq) ist eine der am weitesten verbreiteten Technologien in der Transkriptomik mit vielen Vorteilen (z. B. hohe Datenreproduzierbarkeit) und hat unser Verständnis der Funktionen und Dynamik komplexer biologischer Prozesse dramatisch verbessert1,2. Die Identifizierung von Aberrat-Transkripten unter verschiedenen biologischen Kontexten, die auch als differentiell exprimierte Gene (DEGs) bezeichnet werden, ist ein wichtiger Schritt in der RNA-seq-Analyse. RNA-seq ermöglicht ein tiefes Verständnis der pathogenesebezogenen molekularen Mechanismen und biologischen Funktionen. Daher wurde die Differentialanalyse als wertvoll für die Diagnostik, Prognose und Therapie von Tumoren3,4,5angesehen. Derzeit wurden weitere Open-Source-R/Bioconductor-Pakete für die RNA-seq-Differentialexpressionsanalyse entwickelt, insbesondere limma, DESeq2 und EdgeR1,6,7. Die Differentialanalyse erfordert jedoch bestimmte Fähigkeiten mit der Sprache R und die Fähigkeit, die geeignete Methode zu wählen, die im Lehrplan der medizinischen Ausbildung fehlt.
In diesem Protokoll wurden basierend auf den Cholangiokarzinom (CHOL) RNA-seq-Zähldaten, die aus dem Cancer Genome Atlas (TCGA) extrahiert wurden, drei der bekanntesten Methoden (Limma8, EdgeR9 und DESeq210) vom R-Programm11 durchgeführt, um die DEGs zwischen CHOL und normalem Gewebe zu identifizieren. Die drei Protokolle limma, EdgeR und DESeq2 sind ähnlich, haben aber unterschiedliche Schritte zwischen den Prozessen der Analyse. Zum Beispiel sind die normalisierten RNA-seq-Zähldaten für EdgeR und Limma8,9notwendig, während DESeq2 seine eigenen Bibliotheksdiskrepanzen verwendet, um Daten anstelle von Normalisierung10zu korrigieren. Darüber hinaus eignet sich edgeR speziell für RNA-seq-Daten, während das limma für Microarrays und RNA-seq verwendet wird. Ein lineares Modell wird von limma zur Bewertung der DEGs12übernommen, während die Statistiken in edgeR auf den negativen Binomialverteilungen basieren, einschließlich empirischer Bayes-Schätzung, exakter Tests, verallgemeinerter linearer Modelle und Quasi-Wahrscheinlichkeitstests9.
Zusammenfassend stellen wir die detaillierten Protokolle der RNA-seq-Differentialexpressionsanalyse unter Verwendung von limma, DESeq2 bzw. EdgeR zur Verfügung. Durch bezugnahmend auf diesen Artikel können Benutzer die RNA-seq-Differentialanalyse einfach durchführen und die geeigneten Differentialanalysemethoden für ihre Daten auswählen.

<table><tbody><tr><td>R</td><td></td><td>Version 3.6.2</td><td>kostenlose Software</td></tr><tr><td>Rstudio</td><td></td><td></td><td>kostenlose Software</td></tr></tbody></table>

drei differentielle expressionsanalysemethoden für die rna-sequenzierung: limma, edger, deseq2

Three Differential Expression Analysis Methods for RNA Sequencing: limma, EdgeR, DESeq2

Die RNA-Sequenzierung (RNA-seq) ist eine der am weitesten verbreiteten Technologien in der Transkriptomik, da sie den Zusammenhang zwischen der genetischen Veränderung und komplexen biologischen Prozessen aufdecken kann und einen großen Wert in der Diagnostik, Prognose und Therapeutik von Tumoren hat. Die Differentialanalyse von RNA-seq-Daten ist entscheidend, um aberrante Transkriptionen zu identifizieren, und limma, EdgeR und DESeq2 sind effiziente Werkzeuge für die Differentialanalyse. Die RNA-seq-Differentialanalyse erfordert jedoch bestimmte Fähigkeiten mit der Sprache R und die Fähigkeit, eine geeignete Methode zu wählen, die im Lehrplan der medizinischen Ausbildung fehlt.
Hierin stellen wir das detaillierte Protokoll zur Identifizierung differentiell exprimierter Gene (DEGs) zwischen Cholangiokarzinom (CHOL) und normalem Gewebe durch Limma, DESeq2 bzw. EdgeR zur Verfügung, und die Ergebnisse werden in Vulkandiagrammen und Venn-Diagrammen gezeigt. Die drei Protokolle limma, DESeq2 und EdgeR sind ähnlich, haben aber unterschiedliche Schritte zwischen den Prozessen der Analyse. Beispielsweise wird ein lineares Modell für die Statistik in Limma verwendet, während die negative Binomialverteilung in edgeR und DESeq2 verwendet wird. Darüber hinaus sind die normalisierten RNA-Seq-Zähldaten für EdgeR und Limma notwendig, aber nicht für DESeq2.
Hier stellen wir ein detailliertes Protokoll für drei Differentialanalysemethoden zur Verfügung: limma, EdgeR und DESeq2. Die Ergebnisse der drei Methoden überschneiden sich teilweise. Alle drei Methoden haben ihre eigenen Vorteile, und die Wahl der Methode hängt nur von den Daten ab.

Es gibt verschiedene Ansätze, um das Ergebnis der Differentialexpressionsanalyse zu visualisieren, unter denen insbesondere das Vulkandiagramm und das Venn-Diagramm verwendet werden. limma identifizierte 3323 DEGs zwischen dem CHOL und normalem Gewebe mit den |logFC|≥2 und adj. P.Val &lt;0,05 als Schwellenwerte, darunter 1880 in CHOL-Geweben herunterreguliert und 1443 hochreguliert wurden (Abbildung 1a). In der Zwischenzeit identifizierte edgeR die 1578 herunterregulierten DEGs und 3121 hoch...

Ein detailliertes Protokoll der methoden der differentiellen Expressionsanalyse für die RNA-Sequenzierung wurde bereitgestellt: limma, EdgeR, DESeq2.

Drei Differentielle Expressionsanalysemethoden für die RNA-Sequenzierung: limma, EdgeR, DESeq2

RNA sequencing (RNA-seq) is one of the most widely used technologies in transcriptomics as it can reveal the relationship between the genetic alteration ...

Drei Methoden der differentiellen Expressionsanalyse für die RNA-Sequenzierung: limma, EdgeR und DESeq2. Öffnen Sie das Programm RStudio, und laden Sie dann die Datei R, DEGs. Die Datei kann aus ergänzenden Dateien erworben werden. Eins.Herunterladen und Vorverarbeitung von Daten.1.1. Laden Sie die Hochdurchsatz-Sequenzierungsdaten des Cholangiokarzinoms aus dem Cancer Genome Atlas herunter. Diese Registerkarte kann leicht mit dem folgenden Code erreicht werden.Klicken Sie auf Ausführen, um das R-Paket zu installieren. Klicken Sie auf Ausführen, um das R-Paket zu laden. Legen Sie das Arbeitsverzeichnis fest.Wählen Sie die Krebsart. Führen Sie R-Code aus der GDCquery-Datei aus, um die Daten herunterzuladen. Die Datei GDCquery kann aus ergänzenden Dateien/Skripten erworben werden.Nach der Ausführung können die Cholangiokarzinom-RNA-Sequenzierungszähldaten heruntergeladen und CNT genannt werden, wobei Zeilen Ensemble-Gen-IDs und Spalten Symbol-IDs darstellen. Bitte beachten Sie die Zahlen an den Positionen 14 bis 15 in den Symbol-IDs. Die Zahlen reichen von 01 bis 09 und weisen auf Tumore und 10 bis 19 auf normale Gewebe hin.1.2.Konversation von Ensemble-Gen-IDs zu Gensymbolen. Importieren Sie die Anmerkungsdatei entsprechend ihrem Speicherpfad in R. Die Anmerkungsdatei kann aus ergänzenden Dateien entnommen werden.Führen Sie den R-Code aus der Datei gtf v22 aus. Die aus ergänzenden Dateien/Skripten erworben werden können. Apply inn"function und um die Ensemble-Gen-IDs in Gensymbole umzuwandeln.1.3.Filtern Sie niedrig exprimierte Gene. Klicken Sie auf Ausführen, um Paket edgeR zu installieren"Klicken Sie auf Ausführen, um das R-Paket edgeR zu laden"Führen Sie folgenden R-Code aus, um Gene mit Einer Anzahl pro Million Von mehr als einem in mindestens zwei Stichproben zu halten. Zwei. Analyse differenzieller Ausdrücke durch limma"Klicken Sie auf Ausführen, um das R-Paket limma zu installieren"Klicken Sie auf Ausführen, um das R-Paket limma zu laden"edgeR"Führen Sie den folgenden R-Code aus, um eine Entwurfsmatrix zu erstellen.Extrahieren Sie Gruppeninformationen. Setzen Sie 01" als Tumorgewebe. Stellen Sie 11 "als normales Gewebe ein.Erstellen Sie eine Designmatrix. Erstellen Sie das DGEList-Objekt. Normalisieren Sie die Daten.Führen Sie den folgenden R-Code aus, um die auf der Limma-Trend-Methode basierende Differentielle Ausdrucksanalyse durchzuführen. Berechnen Sie den CPM-Wert. Klicken Sie auf Ausführen, um ein lineares Modell anzupassen, um die Daten vorherzusagen oder die Beziehung zwischen Variablen abzuleiten.Berechnen Sie den T-Wert, den F-Wert und die Log-Quoten basierend auf Bayesian. Extrahieren Sie die Ergebnistabelle. Die Ergebnisse der Differentialausdrucksanalyse werden in res_limma" gespeichert, die den log2-fachen Änderungswert enthält.Das durchschnittliche log2-Expressionsniveau des Gens im Experiment. Die modifizierte T-Statistik, der P-Wert, die falsche Entdeckungsrate korrigierten den p-Wert und die Log-Quoten differentiell exprimierter Gene. Identifizieren Sie die differentiell exprimierten Gene.Der angepasste P-Wert kleiner als 0,05 und der absolute Wert der log-falschen Veränderung größer oder gleich zwei sind also Schwellenwerte, um die differentiell exprimierten Gene zu screenen. Die Ergebnisse zeigen, dass im Vergleich zu den normalen Geweben 1.443 Gene hochreguliert und 1.880 Gene in Cholangiokarzinomgeweben herunterreguliert sind. Geben Sie die Ergebnistabelle in eine Datei aus.Klicken Sie auf Ausführen, um das R-Paket ggplot2 zu installieren"Klicken Sie auf Ausführen, um das R-Paket ggplot2 zu laden"Führen Sie R-Code aus der Vulkandatei aus, um das Vulkandiagramm zu erstellen, und die Datei Volcano kann aus zusätzlichen Dateien erworben werden. Gene können entsprechend ihrer log2-fachen Änderung und angepassten P-Werten auf verschiedene Positionen abgebildet werden. So sind hochregulierte differentiell exprimierte Gene rot eingefärbt.und die herunterregulierten differentiell exprimierten Gene sind grün gefärbt. Klicken Sie auf "Exportieren", um das Vulkandiagramm zu speichern. Drei. Analyse differenzieller Ausdrücke durch edgeR"Klicken Sie auf Ausführen, um das R-Paket edgeR zu laden"Führen Sie den folgenden R-Code aus, um eine Entwurfsmatrix zu erstellen.Klicken Sie auf Ausführen, um das DGEList-Objekt zu erstellen und die Daten zu normalisieren. Klicken Sie auf Ausführen, um die Streuung des Genexpressionswerts zu schätzen. Klicken Sie auf Ausführen, um das Modell zum Zählen von Daten anzupassen.Führen Sie statistische Tests durch. Extrahieren Sie die Ergebnistabelle. Das Ergebnis wird in res edgeR gespeichert, das den Änderungswert für die Protokollfaltung, logCPM, F, p-Wert und den korrigierten p-Wert für die falsche Erkennungsrate enthält.Identifizieren Sie die differentiell exprimierten Gene. Das Ergebnis res edgeR" zeigt, dass im Vergleich zu den normalen Geweben 3.121 Gene hochreguliert und 1.578 Gene im Cholangiokarzinomgewebe herunterreguliert sind. Geben Sie die Ergebnistabelle in eine Datei aus.Erstellen Sie das Vulkandiagramm. Klicken Sie auf Exportieren, um das Vulkandiagramm zu speichern. Vier. Differentialexpressionsanalyse durch DESeq2.Klicken Sie auf Ausführen, um das R-Paket DESeq2 zu installieren"Klicken Sie auf Ausführen, um das R-Paket DESeq2 zu laden"Führen Sie den folgenden R-Code aus, um den Tastenfaktor zu bestimmen. Erstellen Sie das DESeq2-Datensatzobjekt. Führen Sie Analysen durch.Generieren Sie die Ergebnistabelle. Das Ergebnis wird in res DESeq2 gespeichert, das den Mittelwert der normalisierten Leseanzahl, den Änderungswert für die Protokollfaltung, den Standardpfeil zur Änderung der Protokollfalte, die Schweißstatistik, den ursprünglichen P-Wert und den korrigierten P-Wert enthält. Identifizieren Sie DEGs.Das Ergebnis von DESeq2 zeigt, dass im Vergleich zu den normalen Geweben zweitausendneunhundertachtunddreißig Gene hochreguliert sind und eintausendsechshundertsechzehn Gene in Cholangiokarzinomgeweben herunterreguliert sind. Geben Sie die Ergebnistabelle in eine Datei aus. Erstellen Sie das Vulkandiagramm.Klicken Sie auf Exportieren, um das Vulkandiagramm zu speichern. Fünf. Venn-Diagramm. Klicken Sie auf Ausführen, um das Venn-Diagramm des R-Pakets zu installieren.Klicken Sie auf Ausführen, um das Venn-Diagramm des R-Pakets zu laden. Erstellen Sie ein Venendiagramm von hochregulierten differentiell exprimierten Genen. Klicken Sie auf Exportieren, um das Van-Diagramm zu speichern, Erstellen Sie ein Venn-Diagramm von herunterregulierten differentiell exprimierten Genen.Klicken Sie auf Exportieren, um das Venn-Diagramm zu speichern. Sechs. Repräsentative Ergebnisse. Abbildung eins zeigt die Vulkandiagramme aller Gene, die von limma, edgeR und DESeq2 erworben wurden.Der negative log p-Wert wird mit der Änderung der Logfaltung auftreibt. Rote Punkte repräsentieren die hochregulierten differentiell exprimierten Gene, und die grünen Punkte repräsentieren die herunterregulierten differentiell exprimierten Gene. Limma identifiziert die eintausendachthundertachtzig herunterregulierten differentiell exprimierten Gene und die eintausendvierhundertdvierundvierzig hochregulierten differentiell exprimierten Gene in Cholangiokarzinomgeweben.EdgeR identifiziert die eintausendfünfhundertachtundsiebzig herunterregulierten differentiell exprimierten Gene und dreitausendeinhunderteinundzwanzig hochregulierte differentiell exprimierte Gene. DESeq2 identifizieren eintausendsechshundertsechzehn herunterregulierte differentiell exprimierte Gene und zweitausendneunhundertachtunddreißig hochregulierte differentiell exprimierte Gene. Abbildung zwei, Venn-Diagramme zeigen Überlappungen zwischen den Ergebnissen, die von limma edgeR und DESeq2 geteilt werden.Vergleichen Sie die Ergebnisse dieser drei Methoden, Eintausendvierhunderteinunddreißig hochregulierte differentiell exprimierte Gene, und eintausendfünfhunderteinunddreißig herunterregulierte differentiell exprimierte Gene überlappen sich. Sieben.Fazit. In diesem Protokoll haben wir hier ein detailliertes Protokoll verschiedener Arten der Messanalyse für eine hohe Sequenz von Zähldaten unter Verwendung von R-Paketen, Limma, EdgeR und DESeq2 bereitgestellt. Drei Methoden haben ähnliche und Stabs unter ihrem Prozess ihrer Analyse.Und dann überschneiden sich ihre von diesen drei Medikamenten teilweise. Alle drei Medikamente haben ihre eigenen Vorteile. Und die Wahl hängt nur von der Zeit Ihrer Daten ab.Wenn es meine aktuellen Daten gibt, sollte Limma mit Priorität angegeben werden, aber Generierungssequenzierungsdaten in edgeR und DESeq2 werden bevorzugt.

three-differential-expression-analysis-methods-for-rna-sequencing

Research

Forschung

JoVE Journal

Cancer Research

Krebsforschung

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RNA-seq Analyse Transkriptomen Thrombin-behandelt und Control Human Pulmonary mikrovaskulären Endothelzellen

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Drei Differentielle Expressionsanalysemethoden für die RNA-Sequenzierung: limma, EdgeR, DESeq2

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