Name: Minimierung der Venenblutung nach der Infusion während der intrahepatischen Inseltransplantation bei Mäusen (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-05-10T15:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 41 s
Description: Lernen Sie optimierte chirurgische Verfahren zur intraportalen Inseltransplantation bei Mäusen. Diese Methode minimiert blutungsbedingte Todesfälle und ermöglicht sichere Forschung zu Lebererkrankungen und Diabetes.

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Diese Studie wurde vom Department of Veterans Affairs (VA-ORD BLR&D Merit I01BX004536) und dem National Institute of Health grants # 1R01DK105183, DK120394, DK118529, an HW unterstützt. Wir möchten uns bei Ihnen, Herrn Michael Lee und Frau Lindsay Swaby, für die Sprachbearbeitung bedanken.

Alle Verfahren wurden mit Genehmigung der Institutional Animal Care and Use Committees an der Medical University of South Carolina und des Ralph H Johnson Medical Center in Charleston durchgeführt.
1. Diabetes-Induktion mit Streptozotocin (STZ)
<ol><li>Vorbereitung der Empfängermäuse:<ol>
<li>Wiegen Sie alle Mäuse einzeln.</li>
		<li>Überprüfen Sie den Blutzuckerspiegel aus einer Blutprobe der Heckvene mit einem Glucometer.</li>
	</ol>
</li>
	<li>STZ-Dosisbestimmung für drei verschiedene Szenarien:<ol>
<li>Bei Mäusen mit Fettlebererkrankung eine Dosis STZ [40 mg/kg/Tag, intraperitoneale (i.p.) Injektion] für 5 aufeinanderfolgende Tage.</li>
		<li>Bei NOD-SCID-Mäusen 125 mg/kg STZ, einmalige Injektion, i.p. nach dem Fasten über Nacht.</li>
		<li>Bei C57BL/6-Mäusen 225 mg/kg STZ injizieren, Einzelinjektion, i.p.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Berechnungen für STZ (13,5 mg/ml): HINWEIS: Diese Berechnung gilt für fünf C57BL/6-Mäuse mit einem Körpergewicht von 30 g:<ol>
<li>Gesamtkörpergewicht: 5 Mäuse x 30 g/Maus = 150g</li>
		<li>STZ benötigt: 150 g x 225 mg/1000g STZ = 33,75 mg</li>
	</ol>
</li>
	<li>STZ-Vorbereitung:<ol>
<li>Wiegen Sie die STZ nach der vorberechneten Dosis.</li>
		<li>Das gewogene STZ-Pulver in ein 10 ml Becherglas auf Eis geben.</li>
		<li>3 ml Natriumcitratlösung in das Becherglas geben, um die STZ aufzulösen.</li>
		<li>Gut mischen, durch eine 0,22-μm-Pore sterilisieren und die STZ-Lösung innerhalb von 10 Minuten nach der Zubereitung verwenden.</li>
	</ol>
</li>
	<li>STZ-Injektion:<ol>
<li>Laden Sie die gewünschte Menge an STZ-Lösung (ausreichend für eine Maus) in eine 1-ml-Spritze.</li>
		<li>Führen Sie eine intraperitoneale Injektion am unteren rechten Quadranten des Mausabdomens durch.</li>
		<li>Beobachten Sie Mäuse für 5 Minuten nach der Injektion und überprüfen Sie auf Anzeichen von Beschwerden während dieser Zeit, bevor Sie sie wieder in die Käfige legen.</li>
		<li>Überwachen Sie den Blutzuckerspiegel aus einer Blutprobe mit einer Schwanzvenenblutprobe täglich nach der STZ-Injektion. HINWEIS: In diesem Experiment gelten Mäuse als Diabetiker, wenn der nicht nüchterne Blutzucker an zwei aufeinanderfolgenden Tagen > 350 mg / dl liegt.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. Inselvorbereitung
HINWEIS: Menschliche Inseln wurden in CMRL-1066-Medien kultiviert, ergänzt mit 10% fetalem Rinderserum (FBS) und 1% Penicillin/Streptomycin (P/S) bei einer Dichte von 10.000 Inseläquivalenten (IEQ) pro 100 mm Zellkulturschale9. Mausinseln wurden in DMEM mit 10% FBS und 1% P / S mit der gleichen Dichte kultiviert13. Männliche NOD-SCID- und C57BL/7-Mäuse im Alter zwischen 6 und 10 Wochen wurden aus kommerziellen Quellen gewonnen.
<ol><li>Lösen Sie kultivierte Inseln durch leichtes Kratzen von der Zellkulturschale.</li>
	<li>Wählen Sie die gewünschte Anzahl von Inseln (z. B. 300-350 Inseln) mit einer 1cc-Spritze aus und legen Sie sie in sterile 1,5-ml-Mikrozentrifugenröhrchen auf Eis.</li>
	<li>Drehen Sie das Röhrchen 10 Sekunden lang mit der Mikrozentrifuge.</li>
	<li>Entfernen Sie den Überstand und lassen Sie etwas Flüssigkeit zurück, um den Verlust des Pellets zu vermeiden.</li>
	<li>Resuspendiert das Pellet in 200 μL HBSS mit 0,5% Rinderserumalbumin (BSA).</li>
	<li>Aspirieren Sie die resuspendierten Inseln in eine 0,5 ml Insulinspritze.</li>
	<li>Stellen Sie die Spritze in die aufrechte Position. Lassen Sie die Inseln für 1 min sinken.</li>
	<li>Drücken Sie die Spritze, um alle Blasen zu entfernen, so dass etwa 100-150 μL Flüssigkeit übrig bleiben, die Inseln enthält.</li>
	<li>Legen Sie die Spritze mit dem Kopf nach unten und klopfen Sie vorsichtig auf die Seite der Spritze, damit sich die Inseln gleichmäßig über die Flüssigkeit verteilen. Islets sind jetzt bereit für die Injektion.</li>
</ol>3. Inseltransplantation
<ol><li>Induzieren und pflegen Sie die Maus unter Vollnarkose mit 2% Isofluran. Überprüfen Sie, ob Pedalreflexe fehlen, um eine ordnungsgemäße Anästhesie des Tieres zu gewährleisten.</li>
	<li>Rasieren und entfernen Sie das Fell im Bauchbereich der Maus.</li>
	<li>Verabreichen Sie eine präoperative Einzeldosis Buprenorphin (0,1 mg/kg i.p.).</li>
	<li>Desinfizieren Sie den Operationsbereich mit drei abwechselnden Tüchern aus 2% Jod und 75% Alkohol.</li>
	<li>Führen Sie eine Laparotomie mit einer Mikroschere durch, um einen Schnitt von 1-1,5 cm zu erzeugen.</li>
	<li>Öffnen Sie die Peritonealhöhle mit einem Retraktor. Befolgen Sie entweder Methode A oder Methode B, wie unten beschrieben.</li>
</ol>4. Methode A: (Blutung mit Gelschaum stoppen, Abbildung 1A)14,15,16
<ol><li>Mausvorbereitung<ol>
<li>Legen Sie eine sterile Gaze um den Einschnitt.</li>
		<li>Ziehen Sie den Darm vorsichtig mit einer Pinzette heraus und halten Sie ihn auf der Gaze.</li>
		<li>Identifizieren Sie die Pfortader anhand ihrer Position und legen Sie sie gut frei.</li>
		<li>Bedecken Sie den Darm während der gesamten Operation mit einer warmen, salzhaltigen Gaze.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Führen Sie die vorgespannte Insulinspritzennadel der Insel durch die Pfortader in der Nähe des Zwölffingerdarms ein (Abbildung 1B). Halten Sie dazu die Nadel mit dem Loch (der Abschrägung) nach unten und positionieren Sie den Winkel der Öffnungsfläche parallel zur Pfortaderwand, bevor Sie durch die Wand eindringen.<ol>
<li>Ziehen Sie den Kolben, um etwas Blut (20-50 μL) in die Spritze zu ziehen, um zuerst die Inseln zu mischen.</li>
		<li>Tränken Sie die Inseln langsam in die Pfortader, während Sie den Sprung wiederholt ziehen und drücken.</li>
		<li>Legen Sie ein Stück Gelschaum (ca. 0,5 cm x 0,5 cm groß) auf, um die Injektionsstelle abzudecken.</li>
		<li>Drücken Sie den Gelschaum mit einer Baumwollspitze nach unten, während Sie die Nadel aus der Pfortader herausziehen.</li>
		<li>Drücken Sie etwa 2 Minuten lang weiter auf das Gel, um zu bestätigen, dass keine aktive Blutung vorliegt.</li>
		<li>Rollen Sie die Baumwollspitze über und weg vom Gelschaum, um sicherzustellen, dass der Gelschaum die Pfortader gut bedeckt.</li>
	</ol>
</li>
</ol>5. Methode B: (Blutungen mit Fettpolster stoppen, Abbildung 1C)17
<ol><li>Legen Sie die Pfortader gründlich frei.<ol>
<li>Verwenden Sie zwei Baumwollspitzen, um die freiliegende Pfortader sowohl von der linken als auch von der rechten Seite zu halten.</li>
		<li>Identifizieren Sie das Fettgewebepolster zwischen dem Zwölffingerdarm und der Pfortader.</li>
		<li>Dringen Sie durch das Fettpolster ein, bevor Sie die Nadel in die Pfortader einführen (Abbildung 1D).</li>
		<li>Die Inseln werden nach dem ähnlichen Verfahren infundiert, das oben in den Teilen 4.2.1 und 4.2.2 der Methode A beschrieben wurde.</li>
		<li>Ziehen Sie die Nadel heraus, während Sie mit einer Baumwollspitze auf das Fett drücken.</li>
		<li>Drücken Sie nach dem Entfernen der Nadel 1 min lang weiter auf das Fettpolster.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Nachdem Sie bestätigt haben, dass es keine Blutungen aus der Pfortader gibt, bringen Sie den Darm vorsichtig in die Peritonealhöhle in seiner ursprünglichen Position zurück.</li>
	<li>Lassen Sie 0,5 ml warme Kochsalzlösung (36-37 ° C) in der Bauchhöhle vor dem Schließen. HINWEIS: Warme Kochsalzlösung erleichtert die postoperative Darmbewegung und -erholung und beugt Darmnekrose vor.</li>
	<li>Schließen Sie die Muskelschicht mit einer 5-0-Naht ab.</li>
	<li>Schließen Sie die Hautschicht mit einer 4-0-Naht ab.</li>
	<li>Legen Sie die Maus in einen sauberen Käfig auf einem Heizkissen, bis sie sich vollständig von der Narkose erholt hat.</li>
	<li>Geben Sie weiterhin alle 12 Stunden ein Analgetikum (z. B. Buprenorphin 0,1 mg / kg i.p.) und zusätzliche Wärme für 48 h nach der Operation an. HINWEIS: Die Inseltransplantation dauert ca. 15-20 Minuten.</li>
</ol>6. H & E-Färbung und Foto des gesamten Leberabschnitts
<ol><li>Leberdurchblutung<ol>
<li>Die Maus unter Narkose setzen, wie oben in Teil 3.1 beschrieben.</li>
		<li>Legen Sie vorsichtig die Pfortader frei und schneiden Sie die untere Hohlvene ab.</li>
		<li>Perfusionieren Sie die Leber manuell mit 20 ml 10% Paraformaldehyd über die Pfortader für etwa 5 Minuten mit einer 20-ml-Spritze mit 25G-Nadel18. HINWEIS: Die Leberdurchblutung kann Blut aus dem Lebergewebe entfernen und die Leberfixierung verbessern, ohne die Inseltransplantate zu stören.</li>
		<li>Sezieren Sie die durchblutete ganze Leber von anderen Organen.</li>
		<li>Fixieren Sie das durchblutete Lebergewebe in 10% Paraformaldehyd für 24 h.</li>
		<li>Betten Sie das Gewebe in Paraffin ein.</li>
		<li>Schneiden Sie Gewebeschnitte mit einer Dicke von jeweils 5 μm und legen Sie sie zum Färben auf einen Glasobjektträger.</li>
		<li>H&E-, Insulin-, Fibrin- und polymorphkernige Neutrophilenfärbung (PMN) mit Standardmethoden durchführen15,16.</li>
		<li>Scannen Sie den gesamten Leberschnitt unter einem Mikroskop.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

<ol><li>Pellegrini, S., Cantarelli, E., Sordi, V., Nano, R., Piemonti, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+state+of+the+art+of+islet+transplantation+and+cell+therapy+in+type+1+diabetes%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Diabetology%22%5BJournal%5D)">The state of the art of islet transplantation and cell therapy in type 1 diabetes.</a> Acta Diabetology. 53 (5), 683-691 (2016).</li>
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</ol>

Alle Autoren erklären, dass sie keinen Interessenkonflikt haben.

In dieser Studie wurden zwei verbesserte Verfahren demonstriert, die Blutungen verhindern und die Mausmortalität während der Maus-IIT reduzieren können. Diese Studie ermöglicht es den Forschern, das Inseltransplantationsmodell zu visualisieren, das bei der Untersuchung der sofortigen blutvermittelten Entzündungsreaktion nach der Transplantation einzigartig ist. Das IIT-Modell ist ein unverwechselbares Modell für die Untersuchung des Überlebens von Inselzellen und hepatischer ischämischer Verletzungen als Reaktion auf die...

Die intraportale Inseltransplantation (IIT) über die Pfortader ist die am häufigsten verwendete Methode für die Transplantation menschlicher Inseln in klinischen Umgebungen. Das IIT-Modell der Maus bietet eine großartige Gelegenheit, die Inseltransplantation zu untersuchen und vielversprechende interventionelle Ansätze zu testen, die die Wirksamkeit der Inseltransplantation verbessern können1. IIT wurde erstmals in den 1970er Jahren beschrieben und von mehreren Gruppen verwendet1,2,3,4,5. Es gewann nach dem Durchbruch in der menschlichen Inseltransplantation im Jahr 20006 wieder an Popularität,7. Die meisten Inseltransplantationsstudien verwendeten jedoch die Nierenkapsel aufgrund ihres leichten Erfolgs als bevorzugten Ort für die experimentelle Inseltransplantation. Im Gegenteil, IIT ist technisch anspruchsvoller und wird seltener für Inseltransplantationsstudien verwendet8,9. Im Gegensatz zum IIT leiden Inseln, die unter die Nierenkapsel transplantiert werden, jedoch nicht an der unmittelbaren blutvermittelten Entzündungsreaktion, die durch Thrombose, Entzündungen und Lebergewebeischämie gekennzeichnet ist, und haben daher eine bessere Funktion als in die Leber transplantierte Inseln. Das Nierenkapselmodell kann daher die Belastungen, denen Inselchen bei der Transplantation menschlicher Inseln ausgesetzt sind, möglicherweise nicht vollständig nachahmen10,11,12.
Eine der Hauptkomplikationen der IIT bei Mäusen sind Blutungen von der Injektionsstelle nach der Transplantation, die 10-30% der Mortalität bei verschiedenen Mausstämmen verursachen können12. In diesem Artikel wurden zwei verfeinerte Ansätze entwickelt, um Blutungen schneller und sicherer zu stoppen und die Maussterblichkeit nach einem IIT zu reduzieren. Die visuelle Demonstration dieser raffinierten Details wird den Forschern helfen, die wichtigsten Schritte dieses technisch anspruchsvollen Verfahrens zu identifizieren. Darüber hinaus wurde die Lage der Inseltransplantate in der Leber des Empfängers durch histologische Untersuchung des mit Hämatoxylin und Eosin (H & E) gefärbten Lebergewebes (ganzer Abschnitt) bestimmt, das transplantierte Inseln trägt.

<table><tbody><tr><td>10% neutrales gepuffertes Formalin v/v</td><td>Fisher Scientific</td><td>23426796</td><td></td></tr><tr><td>1 mL Spritze mit Nadel</td><td>AHS</td><td>AH01T 20 mL</td><td></td></tr><tr><td>Spritze</td><td>BD</td><td>301031</td><td></td></tr><tr><td>25G x 5/8" Injektionsnadeln</td><td>BD</td><td>305122</td><td></td></tr><tr><td>Alkoholvorbereitungspads, steril</td><td>Fisher Scientific</td><td>22-363-750</td><td></td></tr><tr><td>Tieranästhesie System</td><td>VetEquip, Inc.</td><td></td><td></td>901806</tr><tr><td>Buprenorphinhydrochlorid, Injektion</td><td>Par Sterile Products, LLC</td><td>NDC 42023-179-05</td><td></td></tr><tr><td>Zentrifugenröhrchen, 15 mL</td><td>Fisher Scientific</td><td>0553859A</td><td></td></tr><tr><td>CMRL-1066</td><td>Corning</td><td>15110CV</td><td></td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Corning</td><td>10013CV</td><td></td></tr><tr><td>Ethanol, absolut (200 proof), molekularbiologische Qualität</td><td>Fisher Scientific</td><td></td><td></td>BP2818500</tr><tr><td>Extra feine Mikro-Präparierschere 4" gerade scharf</td><td>Roboz Chirurgisches Instrument Co.</td><td>RS-5882</td><td></td></tr><tr><td>Fötales Rinderserum (FBS)</td><td>Corning</td><td>35011CV</td><td></td></tr><tr><td>FreeStyle&nbsp; Blutzuckermessgerät</td><td>Abbott</td><td>Lite</td><td></td></tr><tr><td>FreeStyle Blutzuckerteststreifen</td><td>Abbott</td><td>Lite</td><td></td></tr><tr><td>Gelfoam (resorbierbarer Gelatineschwamm, USP)</td><td>Pharmazie & Upjohn Company</td><td>34201</td><td></td></tr><tr><td>Graefe Pinzette 4" extra zarte Spitze</td><td>Roboz Chirurgisches Instrument Co.</td><td>RS-5136</td><td></td></tr><tr><td>Heizkissen</td><td>Amazon</td><td>B07HMKMBKM</td><td></td></tr><tr><td>Hegar-Baumgartner Nadelhalter 5,25"</td><td>Roboz Chirurgisches Instrument Co.</td><td>RS-7850</td><td></td></tr><tr><td>Insulinspritze mit 27-Gauge-Nadel</td><td>BD</td><td>879588</td><td></td></tr><tr><td>Jod-Vorbereitungspads</td><td>Fisher Scientific</td><td>19-027048</td><td></td></tr><tr><td>Isofluran</td><td>Piramal Intensivpflege</td><td>NDC 66794-017-25</td><td></td></tr><tr><td>Penicillin/Streptomycin (P/S)</td><td>HyClone</td><td>SV30010</td><td></td></tr><tr><td>Polypropylen-Naht 4-0</td><td>Med-Vet International</td><td>MV-8683</td><td></td></tr><tr><td>Polypropylen-Nahtmaterial 5-0</td><td>Med-Vet International</td><td>MV-8661</td><td></td></tr><tr><td>Natriumchlorid, 0,9 % intravenöse Lösung</td><td>VWR</td><td>2B1322Q</td><td></td></tr><tr><td>Streptozocin (STZ)</td><td>Sigma</td><td>S0130</td><td></td></tr><tr><td>OP-Tuch, steril</td><td>Med-Vet International</td><td>DR1826</td><td></td></tr><tr><td>Gewebekassette</td><td>Fisher Scientific</td><td>22-272416</td><td></td></tr></tbody></table>

minimierung der venenblutung nach der infusion während der intrahepatischen inseltransplantation bei mäusen

Minimizing Post-Infusion Portal Vein Bleeding during Intrahepatic Islet Transplantation in Mice

Obwohl die Leber derzeit als primärer Transplantationsort für menschliche Inseln in klinischen Umgebungen akzeptiert wird, werden Inseln in den meisten präklinischen Inseltransplantationsstudien von Nagetieren unter die Nierenkapsel transplantiert. Dieses Modell wird häufig verwendet, da die murine intrahepatische Inseltransplantation technisch eine Herausforderung darstellt und ein hoher Prozentsatz der Mäuse an chirurgischen Komplikationen sterben könnte, insbesondere an Blutungen von der Injektionsstelle nach der Transplantation. In dieser Studie werden zwei Verfahren gezeigt, die die Häufigkeit von Pfortaderblutungen nach der Infusion minimieren können. Die erste Methode wendet einen resorbierbaren hämostatischen Gelatineschwamm auf die Injektionsstelle an, und die zweite Methode besteht darin, die Inselinjektionsnadel zuerst durch das Fettgewebe und dann in die Pfortader zu durchdringen, indem das Fettgewebe als physikalische Barriere verwendet wird, um Blutungen zu stoppen. Beide Methoden könnten den blutungsbedingten Mäusetod wirksam verhindern. Der gesamte Leberabschnitt mit Inselverteilung und Anzeichen einer Inselthrombose nach der Transplantation, ein typisches Merkmal für die intrahepatische Inseltransplantation, wurden vorgestellt. Diese verbesserten Protokolle verfeinern die intrahepatischen Inseltransplantationsverfahren und können Labors helfen, das Verfahren zur Untersuchung des Überlebens und der Funktion von Inselchen in präklinischen Umgebungen einzurichten.

Über die Vene portal führten wir syngene und xenogene Inseltransplantationen durch. Die Funktion des Inseltransplantats wurde in beiden Inseltransplantationsmodellen dosisabhängig beobachtet. Im syngenen Inseltransplantationsmodell mit C57BL/6-Mäusen führte die Transplantation von 250 Inseln zu einer vorübergehenden Normoglykämie, bevor die Mäuse zur Hyperglykämie zurückkehrten. Mäuse, die 500 Inseln erhielten, erreichten und hielten die Normoglykämie länger als 30 Tage nach der Transplantation aufrecht (<strong class="x...

Hier stellen wir verfeinerte chirurgische Verfahren zur erfolgreichen Durchführung der intraportalen Inseltransplantation, einem klinisch relevanten, aber technisch anspruchsvollen chirurgischen Eingriff, bei Mäusen vor.

Minimierung der Venenblutung nach der Infusion während der intrahepatischen Inseltransplantation bei Mäusen

Although the liver is currently accepted as the primary transplantation site for human islets in clinical settings, islets are transplanted under the ...

Die Leber ist ein primärer Ort für die Transplantation im klinischen Umfeld der menschlichen Inseln. Die intrahepatische Inseltransplantation von Mäusen ist technisch eine Herausforderung, und ein hoher Prozentsatz der Mäuse könnte an chirurgischen Komplikationen, insbesondere Blutungen, sterben. In dieser Studie konnten die beiden Methoden, die wir gezeigt haben, beide den blutungsbedingten Maustod effektiv verhindern.Unsere Methode kann auf die Erforschung von Leberkrebs und anderen Lebererkrankungen angewendet werden, indem die Injektion von Krebszellen, mesenchymalen Stammzellen und Hepatozyten direkt in die Leber ermöglicht wird. Lösen Sie zunächst eine menschliche Inselkultur mit sanftem Kratzen. Verwenden Sie eine 1-Kubikzentimeter-Spritze, um 300 bis 350 Inseln in sterile 1,5-Milliliter-Mikrozentrifugenröhrchen auf Eis aufzunehmen.Wenn alle Inseln entnommen wurden, zentrifugieren Sie die Röhrchen für 10 Sekunden, um die Zellen zu sedimentieren. Verwerfen Sie alle bis auf ein kleines Volumen Überstands, um den Verlust von Pellets zu verhindern, und suspendieren Sie die Inseln in 200 Mikrolitern HBSS mit 5% BSA. Laden Sie die suspendierten Inseln in eine 5-Milliliter-Insulinspritze und drehen Sie das Spritzennadelende für 1 Minute nach oben, damit sich die Inseln am Kolben absetzen können.Drücken Sie den Kolben, um Blasen zu entfernen, halten Sie etwa 100 bis 150 Mikroliter Lösung in der Spritze und drehen Sie die Spritze mit sanftem Klopfen um, um die Inseln gleichmäßig zu verteilen. Nachdem Sie eine mangelnde Reaktion auf den Pedalreflex bestätigt haben, tragen Sie Salbe auf die Augen auf, um ein Austrocknen zu verhindern. Rasieren Sie den Bauch der betäubten Maus, um das Fell zu entfernen, und desinfizieren Sie den Operationsbereich mit drei abwechselnden Tüchern von 2% Jod und 75% Alkohol.Als nächstes machen Sie einen 1 bis 1,5 Zentimeter großen Schnitt im Bauch und öffnen Sie die Peritonealhöhle. Legen Sie ein steriles Stück Gaze um den Einschnitt und verwenden Sie Pinzetten oder Baumwollspitzen, um den Darm vorsichtig auf die Gaze zu übertragen. Die bedecken dann den Darm mit einem Stück salzgetränkter Gaze und legen die Pfortader frei.Um Inseltransfer-induzierte Blutungen mit Gelschaum zu stoppen, halten Sie die Nadel mit der Fase nach unten und positionieren Sie die Nadelspitze mit der Öffnung parallel zur Pfortaderwand, bevor Sie die Nadel in die Pfortader einführen. Ziehen Sie den Kolben ein, um 20 bis 50 Mikroliter Blut in die Spritze zu ziehen, um sie mit den Inseln zu vermischen, bevor Sie die Inseln in die Pfortader infundieren, während Sie den Kolben wiederholt drücken und zurückziehen. Wenn alle Inseln geliefert wurden, legen Sie ein etwa 5 x 5 Zentimeter großes Stück Gelschaum über die Injektionsstelle.Verwenden Sie eine Baumwollspitze, um den Gelschaum nach unten zu drücken, während Sie die Nadel aus der Pfortader entfernen. Halten Sie das Gel etwa 2 Minuten an Ort und Stelle und rollen Sie den Gelschaum, um sicherzustellen, dass er die Pfortader bedeckt. Sobald die Blutung gestoppt ist, bringen Sie den Darm vorsichtig in die Bauchhöhle in der ursprünglichen Position zurück und injizieren Sie 500 Mikroliter warme Kochsalzlösung in die Bauchhöhle.Verwenden Sie Nähte, um die Muskel- und Hautschichten zu schließen. Legen Sie die Maus dann in einen sauberen Käfig auf einem Heizkissen mit Überwachung bis zur vollständigen Wiederherstellung von der Anästhesie, verabreichen Sie Analgetika alle 12 Stunden und erhitzen Sie für 48 Stunden. Um Inseltransfer-induzierte Blutungen mit einem Fettpolster zu stoppen, verwenden Sie nach der Freilegung der Pfortader wie gezeigt zwei Baumwollspitzen, um die freiliegende Vene auf der linken und rechten Seite zu halten und das Fettgewebepolster zwischen dem Zwölffingerdarm und der Pfortader zu lokalisieren.Penetrieren Sie das Fettpolster mit der Nadelspitze, bevor Sie es in die Pfortader einführen. Gießen Sie die Inseln in die Pfortader, wie gezeigt. Wenn alle Inseln geliefert wurden, drücken Sie das Fettgewebe mit einer Baumwollspitze für ca. 1 Minute, während Sie die Nadel aus der Vene entfernen.Bringen Sie dann den Darm in die Bauchhöhle zurück und führen Sie den Rest der postoperativen Pflegeverfahren wie gezeigt durch. Die Auswirkungen der Inseltransplantation sind dosisabhängig, da eine normale Glykämie 30 Tage nach der syngenen Inseltransplantation beobachtet wird, wenn 500 Inseln übertragen werden, aber nur eine vorübergehende Normoglykämie beobachtet wird, wenn 250 Inseln geliefert werden, wobei die Mäuse 10 Tage nach der Transplantation zur Hyperglykämie zurückkehren. Ein erhöhtes Körpergewicht wird in beiden Gruppen beobachtet und identische Reaktionen beobachtet, wenn menschliche Inseln in diabetische NOD-SCID-Mäuse transplantiert werden, wobei Normoglykämie beobachtet wird, wenn eine höhere Anzahl von Inseläquivalenten transplantiert wird, aber keine kleinere Anzahl.Die Mehrheit der Mäuse, die nach dem Transfer Blutungen haben, sterben nach der Operation, während die Mäuse ohne Blutungen überleben. 28 Tage nach der Transplantation zeigt die Insulinfärbung eine gleichmäßige Verteilung der menschlichen Insel in der gesamten Leber, meist in der Nähe von Blutgefäßen. Neben Insulin werden auch Fibrin und polymorphe Zellfiltration innerhalb der transplantierten menschlichen Inseln beobachtet.Die intrahepatische Inseltransplantation erzeugt ein großes Loch in der Pfortadere, das Blutungen verursachen kann. Die Verwendung unserer beiden verbesserten Verfahren kann Blutungen verhindern und die Mortalität nach der Inseltransplantation reduzieren. Das intraportale Inseltransplantationsmodell kann die klinische Transplantation menschlicher Inseln nachahmen.Unsere verfeinerten Verfahren können zu höheren Überlebensraten für die Empfänger führen, die eine weitere Untersuchung der Inselfunktion nach der Transplantation ermöglichen.

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Forschung

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Medicine

Medizin

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Minimierung der Venenblutung nach der Infusion während der intrahepatischen Inseltransplantation bei Mäusen

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