Name: Aufnahme fluoreszierender markierter kleiner extrazellulärer Vesikel in vitro und im Rückenmark (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-05-23T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 1 s
Description: Lernen Sie die Aufnahme fluoreszierend markierter kleiner extrazellulärer Vesikel in vitro und im Rückenmark. Dieses Protokoll ermöglicht die Visualisierung von sEV-Uptake durch Astrozyten und Neuronen.

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Diese Studie wurde durch Zuschüsse von NIH NINDS R01NS102836 und dem Pennsylvania Department of Health Commonwealth Universal Research Enhancement (CURE) unterstützt, die an Seena K. Ajit vergeben wurden. Wir danken Dr. Bradley Nash für die kritische Lektüre des Manuskripts.

HINWEIS: Alle Verfahren wurden in Übereinstimmung mit dem NIH-Leitfaden für die Pflege und Verwendung von Labortieren durchgeführt und vom Institutional Animal Care & Use Committee des Drexel University College of Medicine genehmigt. Zeitschwangere CD-1-Mäuse wurden für die astrozytäre Kultur verwendet, und alle Dämme wurden 15 Tage nach der Imprägnierung erhalten. Zehn bis zwölf Wochen alte C57BL/6-Mäuse wurden für In-vivo-Aufnahmeexperimente verwendet.
1. Isolierung von sEVs aus RAW 264.7 Makrophagenzellen
<ol><li>Kultur RAW 264,7 Zellen in 75 cm2 Kolben in DMEM Exosomen-erschöpftem Medium mit 10% Exosomen-depleted fetal bovine serum (FBS) und 1% Penicillin-Streptomycin (Pen-Streptokokken) für 24-48 h.</li>
	<li>Sammeln Sie 300 ml konditioniertes Medium und Zentrifuge bei 300 × g für 10 min bei 4 °C.</li>
	<li>Überstand und Zentrifuge bei 2.000 × g für 20 min bei 4 °C sammeln.</li>
	<li>Den Überstand in Zentrifugenröhrchen überführen, 35 min bei 12.000 × g bei 4 °C zentrifugieren.</li>
	<li>Sammeln Sie den Überstand und filtern Sie durch einen 0,22 μm Spritzenfilter.</li>
	<li>Übergabe in Ultrazentrifugenröhrchen und Zentrifuge für 80 min bei 110.000 × g bei 4 °C.</li>
	<li>Lagern Sie den Überstand (exosomenarmes Medium), resuspendieren Sie das Pellet in 2 mL 1x phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS) und zentrifugieren Sie für 1 h bei 110.000 × g bei 4 °C.</li>
	<li>Resuspendieren Sie das Pellet in 100 μL PBS zur weiteren Charakterisierung mittels Nanopartikel-Tracking-Analyse (NTA) und Transmissionselektronenmikroskopie (TEM) oder im RipA-Puffer (Radioimmunoprecipitation Assay) für Western Blotting.</li>
</ol>2. Charakterisierung von sEVs
<ol><li>Nanopartikel-Tracking-Analyse (NTA) HINWEIS: Die Größenverteilung und Partikelanzahl/Konzentration der gereinigten sEVs aus RAW 264.7-Zellen wurden mit NTA gemessen.<ol>
<li>Verdünnen Sie die sEVs in gefiltertes PBS, um 20-60 Vesikel pro Sichtfeld für eine optimale Verfolgung zu erhalten.</li>
		<li>Die verdünnte Probe wird mit einer Spritzenpumpe mit konstantem Durchfluss in eine Durchflusszelle einführt.</li>
		<li>Nehmen Sie 3-5 Videos von jeweils 30 s auf. Stellen Sie die Verschlusszeit und Verstärkung ein und fokussieren Sie die Kameraeinstellungen manuell, damit die maximale Anzahl von Vesikeln sichtbar ist und verfolgt und analysiert werden kann.</li>
		<li>Führen Sie die Proben zwischen den einzelnen Aufzeichnungen auf, um Replikationsmessungen durchzuführen. Optimieren Sie die NTA-Einstellungen nach der Erfassung und halten Sie die Einstellungen zwischen den Samples konstant.</li>
		<li>Analysieren Sie jedes Video mit der NTA-Software, um die durchschnittliche Größe und Konzentration der Vesikel zu erhalten.</li>
		<li>Führen Sie alle NTA-Messungen mit identischen Systemeinstellungen durch, um Konsistenz zu erhalten.</li>
	</ol></li>
	<li>Westlicher Schandfleck<ol>
<li>Quantifizieren Sie die Gesamtproteinmengen in sEVs, Zelllysaten und exosomenarmen Medien mit einem Protein-Assay-Kit gemäß den Anweisungen des Herstellers.</li>
		<li>Zur Zelllysatpräparation die RAW 264,7 Zellen in 75 cm2 Kolben bis zu 80-90% konfluent züchtigen. Lösen Sie die Zellen mit 0,25% Trypsin für 10-15 min, neutralisieren Sie das Trypsin mit Nährmedien und pelletieren Sie die Zellen, indem Sie bei 400 × g für 5 min drehen. Resuspendieren Sie die Zellen in frischem Wachstumsmedium.</li>
		<li>Zählen Sie die Zellen mit einem Hämozytometer und übertragen Sie 1 × 106 Zellen in ein anderes Röhrchen. Waschen Sie die Zellen zweimal mit PBS unter den gleichen Zentrifugationsbedingungen wie oben und fügen Sie dem Zellpellet aus dem letzten Spin 50 μL Lysepuffer (RIPA-Puffer mit Protease-Inhibitor-Cocktail hinzugefügt) hinzu.</li>
		<li>Wirbeln Sie die Zellen vor und halten Sie sie für 20 Minuten auf Eis. Das Gemisch bei 10.000 × g für 30 min bei 4 °C zentrifugieren, den Überstand (d.h. das Lysat) in frischen Mikrozentrifugenröhrchen sammeln und bis zur Verwendung bei −80 °C aufbewahren.</li>
		<li>Konzentrieren Sie 2 ml exosomenarme Medien auf 100 μL mit 3 kDa-cutoff-Zentrifugalfiltern, bevor Sie die Proteinmenge quantifizieren. Mischen Sie die sEVs mit Lysepuffer im Verhältnis 1: 1, Wirbel für 30 s und inkubieren Sie auf Eis für 15 Minuten, um die Menge an Protein zu quantifizieren.</li>
		<li>Mischen Sie gleiche Mengen an Protein (2 μg) der sEVs, RAW 264,7 Zelllysat und Exosomen-erschöpfte Medien mit reduzierendem Probenpuffer.</li>
		<li>Denaturieren Sie die Proben bei 95 °C für 5 min, halten Sie sie 5 min auf Eis und drehen Sie sie für 2 min bei 10.000 × g. Laden Sie die Proben auf ein 12% Tris-Glycin-Proteingel und lassen Sie das Gel bei 125 V für 45 minuten laufen.</li>
		<li>Übertragen Sie das Protein auf eine Polyvinylidendifluorid (PVDF) -Membran bei 25 V für 2 h.</li>
		<li>Nach dem Transfer die PVDF-Membranen mit Sperrpuffer (siehe Materialtabelle)für 1 h bei Raumtemperatur blockieren.</li>
		<li>Inkubieren Sie den Blot mit primären Antikörpern auf einem Shaker über Nacht bei 4 °C. HINWEIS: Primäre Antikörper waren Anti-CD81 (1:1.000), Anti-Alpha-1,3/1,6-Mannosyltransferase (ALG-2)-interagierendes Protein X (Alix) (1:1.000), Anti-Calnexin (1:1.000) und Anti-Glyceraldehyd-3-Phosphat-Dehydrogenase (GAPDH) (1:1.000).</li>
		<li>Waschen Sie die Blots 3 x 15 min mit 1x Tris-gepufferter Kochsalzlösung, 0,1% Tween 20 (TBST) und inkubieren Sie bei Raumtemperatur mit Ziegen-Anti-Maus-IgG-Meerrettichperoxidase (HRP)- oder Esel-Anti-Kaninchen-IgG-HRP-konjugierten sekundären Antikörpern (1:10.000) für 1 h auf dem Shaker.</li>
		<li>Waschen Sie die Blots 3 x 15 min mit 1x TBST und detektieren Sie die Proteine mit einem HRP-Substrat.</li>
		<li>Analysieren Sie die Blots durch verbesserte Chemilumineszenz mit einem Western Blot Imager.</li>
	</ol></li>
	<li>Transmissionselektronenmikroskopie (TEM)<ol>
<li>Fixieren Sie sEVs, indem Sie sie in 2% Paraformaldehyd (PFA) in 0,1 M Phosphatpuffer (PB) resusdieren; Wirbel für 2 x 15 s.</li>
		<li>Legen Sie einen Tropfen 10 μL sEV-Suspension auf sauberen Parafilm. Schweben Sie das kohlenstoffbeschichtete Formvar-Gitter auf dem Tropfen mit der beschichteten Seite zur Aufhängung hin. Lassen Sie die Membranen in trockener Umgebung 20 Minuten einziehen.</li>
		<li>Legen Sie die Gitter (Membranseite nach unten) auf einen Tropfen PB, um sie 3 x 2 min zu waschen.</li>
		<li>Die Gitter für 5 min auf 50 μL 1% Glutaraldehyd übertragen.</li>
		<li>Waschen Sie die Gitter mit 100 μL destilliertem Wasser für 8 x 2 min.</li>
		<li>Kontrastieren Sie die Probe, indem Sie die Gitter für 2 min auf einen Tropfen von 1% Uranylacetat legen.</li>
		<li>Betten Sie die Probe mit 50 μL 0,2% Uranylacetat mit 2% Methylcelluloselösung für 10 min auf eine mit Parafilm bedeckte Eisschale ein.</li>
		<li>Verwenden Sie Edelstahlschlaufen, um die Gitter zu halten und überschüssige Flüssigkeit mit Filterpapier zu entfernen.</li>
		<li>Trocknen Sie das Gitter für 10 Minuten an der Luft, während Sie sich noch auf der Schleife beflüchte.</li>
		<li>Unter einem Transmissionselektronenmikroskop bei 80 kV beobachten.</li>
	</ol></li>
</ol>3. Kennzeichnung von sEVs
<ol><li>Verdünnen Sie 20 μg sEVs in 1 ml Verdünnungsmittelpuffer oder das gleiche Volumen PBS in 1 ml Verdünnungsmittelpuffer zur Farbstoffkontrolle.</li>
	<li>3 μL PKH67- oder PKH26-Farbstoff in 1 ml Verdünnungspuffer verdünnen und durch Pipettieren mischen.</li>
	<li>Verdünnter PKH-Farbstoff zu den verdünnten sEVs geben und durch Pipettieren mischen. 5 min im Dunkeln bei Raumtemperatur inkubieren. Für eine Farbstoffkontrolle mischen Sie den verdünnten Farbstoff mit verdünnten PBS aus Schritt 3.1.</li>
	<li>2 ml 1% Rinderserumalbumin (BSA) in PBS in das Röhrchen mit dem Farbstoff und der sEV-Mischung und in das Farbstoffkontrollröhrchen geben, um überschüssigen Farbstoff zu absorbieren.</li>
	<li>Zentrifuge für 1 h bei 110.000 × g bei 4 °C. Entsorgen Sie den Überstand, resuspendieren Sie das Pellet in 2 mL PBS und zentrifugieren Sie für 1 h bei 110.000 × g bei 4 °C. Wiederholen Sie die Wäsche mit PBS und drehen Sie die markierten sEVs oder die Farbstoffkontrolle in einem gleichen PbS-Volumen wieder auf.</li>
	<li>Quantifizieren Sie die Menge an Gesamtprotein mit der Bradford-Methode.</li>
</ol>4. Aufnahme von sEVs durch Neuro-2a-Zellen
<ol><li>Legen Sie 18-mm-Coverlips in eine 12-Well-Platte und eine Platte 10 ×10 4 Neuro-2a-Zellen in jede Vertiefung in insgesamt 1 ml vollständiges DMEM-Medium mit 10% FBS und 1% Pen-Strep.</li>
	<li>Ändern Sie das Medium in dmEM-exosomenarmes Medium, wenn die Zellkonfluenz 80-90% beträgt. Fügen Sie 1, 5 oder 10 μg markierte sEVs in jeder Vertiefung für 1, 4 und 24 h für die dosis- und zeitabhängige Aufnahme hinzu oder fügen Sie ein gleiches Volumen an Farbstoffkontrolle hinzu.</li>
</ol>5. Primäre astrozytäre Kulturen
<ol><li>Betäuben Sie 4 postnatale Welpen 4 Tage nach der Geburt, indem Sie eine Hypothermie induzieren.</li>
	<li>Sammeln Sie die Gehirne in einer 60-mm-Petrischale, die eiskalte Hank's Balanced Salt Solution (HBSS) enthält, ergänzt mit 10 mM 4-(2-Hydroxyethyl)-1-piperazinethansulfonsäure (HEPES).</li>
	<li>Sezieren Sie beide kortikalen Lappen und entfernen Sie die Meningen. Die Gewebe mit einer sterilisierten Klinge zerhacken.</li>
	<li>Das Gewebe wird in ein 15 ml konisches Röhrchen mit Papain/Desoxyribonuklease I Dissoziationspuffer gegeben und 20 min bei 37 °C inkubiert. Alle 5 Min. schwenken. HINWEIS: Für 4 Mauskortikale werden 9 ml 7,5 U/ml Papain in HBSS bei 37 °C für mindestens 30 min aktiviert, durch einen 0,22 μm Spritzenfilter filtriert und mit Desoxyribonuklease I bis zu einer Endkonzentration von 0,1 mg/ml gemischt.</li>
	<li>Saugen Sie den Überstand an und fügen Sie 5 ml vollständiges DMEM hinzu, um die Enzymaktivität zu inaktivieren. Vorsichtig triturieren, um das Gewebe mit einer 5 mL serologischen Glaspipette und einer flammpolierten Pasteur-Pipette zu dissoziieren.</li>
	<li>Die Zellsuspension durch ein 40 μm Zellsieb geben und die Zellen bei 250 × g für 5 min bei 4 °C zentrifugieren. Saugen Sie das Medium an und säen Sie die Zellen in 10 ml vollständigem DMEM in einem 75 cm2 Kolben aus. Ersetzen Sie das überstehende Medium 4 h nach der Beschichtung durch 15 mL frisches DMEM-Medium.</li>
	<li>Nach 14 Tagen in vitroden Kolben in einen Orbitalschüttler geben, um die Mikroglia und Oligodendrozyten bei 320 U / min für 6 h zu lösen.</li>
	<li>Trypsinisieren Sie die verbleibenden Astrozyten mit 5 ml des Zelldissoziationsenzyms (Materialtabelle) für 10 min bei 37 °C. Fügen Sie 5 ml vollständiges DMEM hinzu, um die enzymatische Wirkung zu inaktivieren, und pelletieren Sie die Zellen bei 250 × g für 5 min bei 4 °C.</li>
	<li>Stellen Sie die Zellen in vollständigem DMEM wieder auf. 5 × 104 Zellen auf 12 mm #1,5 Coverlips in einer 24-Well-Platte.</li>
</ol>6. Aufnahme von sEVs durch Astrozyten
<ol><li>Wenn Astrozyten 80-90% Konfluenz erreichen, wechseln Sie das Medium in DMEM-Exosom-erschöpftes Medium.</li>
	<li>Fügen Sie 1 μg unmarkierte, markierte sEVs, ein gleiches Volumen an Farbstoffkontrolle oder PBS zu den Zellen hinzu. Verwenden Sie die Zellen zur Färbung 1 h und 24 h nach der sEV-Behandlung.</li>
</ol>7. Immunfluoreszenz
<ol><li>Spülen Sie die Zellen mit PBS 3x aus und fixieren Sie sie mit 4% PFA in PB für 10 min bei Raumtemperatur.</li>
	<li>Waschen Sie die festen Zellen 3 x 5 min mit PB und permeabilisieren Sie sie mit 0,1% Triton X-100 in PB für 10-15 min und waschen Sie sie mit PB 3 x 5 min.</li>
	<li>Blockieren Sie die Zellen mit 5% normalem Ziegenserum (NGS) in PB für 1 h bei Raumtemperatur.</li>
	<li>Inkubieren Sie die Zellen mit primären Antikörpern: Mikrotubuli-assoziiertes Protein 2 (MAP2A, 1:500) für Neuro-2a-Zellen oder Gliafibrillary Acidic Protein (GFAP, 1:500) für primäre Astrozyten in frischen 5% NGS/PB über Nacht bei 4 °C mit sanftem Schütteln.</li>
	<li>3 x 10 min mit PB waschen und fluorophorkonjugierte sekundäre Antikörper (Goat Anti-Mouse IgG1, Alexa Fluor 594; oder Goat Anti-Mouse IgG H&L, Alexa Fluor 488) in 5% NGS geben und 2 h bei Raumtemperatur auf einer Wippe inkubieren.</li>
	<li>3 x 10 min mit PB waschen und mit 1 μg/ml Kernfleck 4',6-Diamidino-2-phenylindol (DAPI) 10 min bei Raumtemperatur inkubieren. Waschen Sie die Zellen erneut 3x mit PB.</li>
	<li>Montieren Sie die Coverlips auf #1 Dias mit einem Antifade-Montagemedium. Lassen Sie sie über Nacht im Dunkeln trocknen und lagern Sie die vorbereiteten Glasobjektträger bei 4 °C bis zur Bildgebung auf einem konfokalen Mikroskop.</li>
</ol>8. In-vivo-Aufnahme von sEVs
<ol><li>Intrathekale Injektion von 5 μg unmarkierten oder markierten sEVs, die in 10 μL PBS resuspendiert wurden, oder gleiches Volumen (10 μL) farbstoffkontrolle (wie in Abschnitt 3 hergestellt) in C57BL/6-Mäuse.</li>
	<li>Nach 6 und 18 Stunden nach der Injektion von sEVs betäuben Sie Mäuse tief durch intraperitoneale Injektion von 100 mg / kg Körpergewicht Ketamin und 10 mg / kg Körpergewicht Xylazin.</li>
	<li>Führen Sie eine intrakardiale Perfusion von Mäusen mit 0,9% Kochsalzlösung durch, um Blut auszuspülen, gefolgt von frisch zubereitetem eiskaltem 4% PFA / PB.</li>
	<li>Sezieren Sie das Rückenmark und fixieren Sie es in 4% PFA/PB bei 4 °C für 24 h. Kryoschutz das Gewebe in 30% Saccharose in PB bei 4 °C für 24 h oder bis das Gewebe sinkt. Lagern Sie das Gewebe bei 4 °C bis zur Immunhistochemie.</li>
</ol>9. Immunhistochemie
<ol><li>L4-L5 Rückenmark in O.C.T Compound einbetten. Auf Trockeneis einfrieren, bis es vollständig erstarrt ist.</li>
	<li>Durchschneiden Sie das Gewebe bei 30 μm (Querschnitt für das Rückenmark) mit einem Kryostaten und sammeln Sie die Abschnitte in einer 24-Well-Platte, die PB enthält. Waschen Sie die Abschnitte 3 x 5 min mit 0,3% Triton in PB.</li>
	<li>Blockieren Sie unspezifische Bindungsstellen mit 5% NGS in 0,3% Triton/PB für 2 h bei Raumtemperatur.</li>
	<li>Verdünnte primäre Antikörper: Anti-MAP2A (1:500), GFAP (1:1.000), Iba1 für Mikroglia (1:2.000) mit 5% NGS in 0,3% Triton/PB und inkubieren sie die Abschnitte über Nacht bei 4 °C auf einem Shaker.</li>
	<li>Waschen Sie die Abschnitte 3 x 5 min mit 0,3% Triton/PB und fügen Sie sekundäre Antikörper (Donkey Anti-Rabbit IgG Alexa Fluor 488, 1:500 oder Goat Anti-Mouse IgG Alexa Fluor 488, 1:500) in 5% NGS/PB für 2 h bei Raumtemperatur hinzu.</li>
	<li>3 x 5 min mit PB waschen und die Abschnitte in 1 μg/ml DAPI für 10 min bei Raumtemperatur inkubieren. Waschen Sie die Abschnitte 3 x 5 min mit PB.</li>
	<li>Montieren Sie die Schnitte auf einem sauberen Klebeobjektträger (Table of Materials) mit einem feinen Pinsel unter einem Lichtmikroskop.</li>
	<li>Befeuchten Sie den Abdeckrlip mit einem Montagemedium. Über Nacht im Dunkeln bei Raumtemperatur aushärten.</li>
	<li>Bild unter einem konfokalen Mikroskop mit den jeweiligen Lasern.</li>
</ol>

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</ol>

Die Autoren haben keine Interessenkonflikte offenzulegen.

In diesem Protokoll zeigten wir die Markierung von sEVs mit PKH-Farbstoffen und die Visualisierung ihrer Aufnahme im Rückenmark. PKH lipophile Fluoreszenzfarbstoffe werden häufig zur Markierung von Zellen durch Durchflusszytometrie und Fluoreszenzmikroskopie3,5,6,12,24,25verwendet. Aufgrund ihrer relativ langen Halbwertszeit ...

Kleine extrazelluläre Vesikel (sEVs) sind nanogroße, membranbasierte Vesikel mit einem Größenbereich von 50-150 nm. Sie stammen aus multi-vesikulären Körpern (MVBs) und werden bei der Fusion der MVBs mit der Plasmamembran aus Zellen freigesetzt. sEVs enthalten miRNAs, mRNAs, Proteine und bioaktive Lipide, und diese Moleküle werden in Form von Zell-zu-Zell-Kommunikation zwischen Zellen übertragen. sEVs können von Empfängerzellen durch eine Vielzahl von endozytischen Wegen internalisiert werden, und diese Erfassung von sEVs durch Empfängerzellen wird durch die Erkennung von Oberflächenmolekülen sowohl auf EVs als auch auf den Zielzellenvermittelt 1.
sEVs haben aufgrund ihrer Fähigkeit, molekulare und phänotypische Veränderungen in Akzeptorzellen auszulösen, ihres Nutzens als therapeutisches Mittel und ihres Potenzials als Träger für Frachtmoleküle oder pharmakologische Wirkstoffe an Interesse gewonnen. Aufgrund ihrer geringen Größe kann die Bildgebung und Verfolgung von sEVs eine Herausforderung darstellen, insbesondere für In-vivo-Studien und klinische Umgebungen. Daher wurden viele Methoden entwickelt, um sEVs zu kennzeichnen und abbilden, um ihre Bioverteilung und Verfolgung in vitro und in vivo2zu unterstützen.
Die gebräuchlichste Technik zur Untersuchung der sEV-Bioverteilung und der Wechselwirkungen mit Zielzellen bestehtdarin,sie mit fluoreszierenden Farbstoffmolekülen3,4,5,6,7zukennzeichnen. EVs wurden zunächst mit Zellmembranfarbstoffen markiert, die üblicherweise zur Abbildung von Zellen verwendet wurden. Diese fluoreszierenden Farbstoffe färben im Allgemeinen die Lipiddoppelschicht oder Proteine von Interesse auf sEVs. Mehrere lipophile Farbstoffe zeigen ein starkes fluoreszierendes Signal, wenn sie in das Zytosol eingebaut werden, darunter DiR (1,1′-Dioctadecyl-3,3,3′,3′-tetramethylindotricarbocyaniniodid), DiL (1 ,1′-Dioctadecyl-3, 3,3′, 3′-Tetramethylindocarbocyaninperchlorat) und DiD (1 ,1′-Dioctadecyl-3, 3,3′,3′-Tetramethylindocarbocyanin-4-Chlorbenzolsulfonatsalz)8,9,10,11.
Andere lipophile Farbstoffe, wie PKH67 und PKH26, haben eine hoch fluoreszierende polare Kopfgruppe und einen langen aliphatischen Kohlenwasserstoffschwanz, der sich leicht in jede Lipidstruktur einfüg und zu einer langfristigen Farbstoffretention und stabilen Fluoreszenz führt12. PKH-Farbstoffe können auch EVs kennzeichnen, was die Untersuchung der EV-Eigenschaften in vivo13ermöglicht. Viele andere Farbstoffe wurden verwendet, um Exosomen mittels Fluoreszenzmikroskopie und Durchflusszytometrie zu beobachten, einschließlich Lipidmarkierungsfarbstoffe14 und zelldurchlässige Farbstoffe wie Carboxyfluoresceindiacetat-Succinimidylester (CFDA-SE)15,16 und Calceinacetoxymethyl (AM)-Ester17.
Untersuchungen des sEV-vermittelten Crosstalks zwischen verschiedenen Zellen im ZNS haben wichtige Erkenntnisse über die Pathogenese neuroinflammatoratorischer und neurodegenerativer Erkrankungen geliefert18. Zum Beispiel können sEVs aus Neuronen Beta-Amyloid-Peptide und phosphorylierte Tau-Proteine verbreiten und bei der Pathogenese der Alzheimer-Krankheithelfen 19. Darüber hinaus enthalten EVs, die aus Erythrozyten gewonnen werden, große Mengen an Alpha-Synuclein und können die Blut-Hirn-Schranke überwinden und zur Parkinson-Pathologie beitragen20. Die Fähigkeit von sEVs, physiologische Barrieren21 zu überwinden und ihre Biomoleküle auf Zielzellen zu übertragen, macht sie zu bequemen Werkzeugen, um therapeutische Medikamente an das ZNS22zu liefern.
Die Visualisierung der sEV-Aufnahme durch unzählige ZNS-Zellen im Rückenmark ermöglicht sowohl mechanistische Studien als auch die Bewertung des therapeutischen Nutzens exogen verabreichter sEVs aus verschiedenen zellulären Quellen. Dieser Artikel beschreibt die Methodik zur Markierung von sEVs, die von Makrophagen abgeleitet sind, und zur Abbildung ihrer Aufnahme in vitro und in vivo im Lendenwirbelmark durch Neuronen, Mikroglia und Astrozyten, um die sEV-Abgabe durch Visualisierung qualitativ zu bestätigen.

<table><tbody><tr><td>Amicon Ultra 0,5 mL Zentrifugalfilter</td><td>MilliporeSigma</td><td>Z677094</td><td></td></tr><tr><td>Anti-Alix Antikörper</td><td>Abcam</td><td>ab186429</td><td>1:1000</td></tr><tr><td>Anti-Calnexin Antikörper</td><td>Abcam</td><td>ab10286</td><td>1:1000</td></tr><tr><td>Anti-CD81 Antikörper</td><td>Santa Cruz Biotechnology</td><td>sc-166029</td><td>1:1000</td></tr><tr><td>Anti-GAPDH Monoklonaler Antikörper (14C10)</td><td>Zellsignalisierung Technology</td><td>2118</td><td>1:1000</td></tr><tr><td>Anti-Glial Fibrillary Sauric Protein Antikörper</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>MAB360</td><td>1:500 für IF; 1:1000 für IHC</td></tr><tr><td>Anti-Iba1 Antikörper</td><td>Wako</td><td>019-19741</td><td>1:2000</td></tr><tr><td>Anti-MAP2A Antikörper</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>MAB378</td><td>1:500</td></tr><tr><td>Rinderserumalbumin (BSA)</td><td>VWR</td><td>0332</td><td></td></tr><tr><td>Zellsieb, 40 &mu; m</td><td>VWR</td><td>15-1040-1</td><td></td></tr><tr><td>Zentrifugenröhrchen</td><td>Thermo Scientific</td><td>3118-0050</td><td>12.000 x g</td></tr><tr><td>Deckglas, 12 mm, #1.5</td><td>Elektronenmikroskopie Sciences</td><td>72230-01</td><td></td></tr><tr><td>Deckglas, 18 mm, #1.5</td><td>Elektronenmikroskopie Sciences</td><td>72222-01</td><td></td></tr><tr><td>DAPI</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D9542-1MG</td><td>1 &micro; g/mL</td></tr><tr><td>DC Protein Assay</td><td>Bio-Rad</td><td>500-0116</td><td></td></tr><tr><td>Desoxyribonuklease I (DNAse I)</td><td>MilliporeSigma</td><td>D4513-1VL</td><td></td></tr><tr><td>Esel Anti-Kaninchen IgG H& L (HRP)</td><td>Abcam</td><td>ab16284</td><td>1:10000</td></tr><tr><td>Esel Anti-Kaninchen IgG H& L, Alexa Fluor 488</td><td>Invitrogen</td><td>A-21206</td><td>1:500</td></tr><tr><td>Double Frosted Mikroskop-Objektträger, #1</td><td>Thermo Scientific</td><td>12-552-5</td><td></td></tr><tr><td>DPBS ohne Calcium und Magnesium</td><td>Corning</td><td>21-031-CV</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM)</td><td>Corning</td><td>10-013-CV</td><td></td></tr><tr><td>Exosom-abgereichertes fötales Rinderserum</td><td>Gibco</td><td>A27208-01</td><td></td></tr><tr><td>Fötales Rinderserum (FBS)</td><td>Corning</td><td>35-011-CV</td><td></td></tr><tr><td>FluorChem M Bildgebungssystem</td><td>ProteinSimple</td><td></td><td></td></tr><tr><td>FV3000 Konfokales Mikroskop</td><td>Olympus</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Ziege Anti-Maus IgG H& L (HRP)</td><td>Abcam</td><td>ab6789</td><td>1:10000</td></tr><tr><td>Ziege Anti-Maus IgG H& L, Alexa Fluor 488</td><td>Invitrogen</td><td>A-11001</td><td>1:500</td></tr><tr><td>Ziege Anti-Maus IgG1, Alexa Fluor 594</td><td>Invitrogen</td><td>A-21125</td><td>1:500</td></tr><tr><td>Hank's Balanced Salt Solution (HBSS)</td><td>VWR</td><td>02-0121</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Gibco</td><td>15630080</td><td></td></tr><tr><td>HRP Substrat</td><td>Thermo Scientific</td><td>34094</td><td></td></tr><tr><td>Abfang-Blockierungspuffer, TBS</td><td>LI-COR Biosciences</td><td>927-60001</td><td></td></tr><tr><td>Laemmli SDS Probenpuffer</td><td>Alfa Aesar</td><td>AAJ61337AC</td><td></td></tr><tr><td>Micro Cover Glass, #1</td><td>VWR</td><td>48404-454</td><td></td></tr><tr><td>Microm HM550</td><td>Thermo Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>NanoSight NS300 System</td><td>Malvern Panalytical</td><td></td><td></td></tr><tr><td>NanoSight NTA 3.2 Software</td><td>Malvern Panalytical</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Neuro-2a-Zelllinie</td><td>ATCC</td><td>CCL-131</td><td></td></tr><tr><td>Normales Ziegenserum</td><td>Vektor Laboratorien</td><td>S-1000</td><td></td></tr><tr><td>O.C.T. Verbindung</td><td>Sakura Finetek</td><td>4583</td><td></td></tr><tr><td>Papain</td><td>Worthington Biochemical Corporation</td><td>NC9597281</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldehyd</td><td>Elektronenmikroskopie Wissenschaften</td><td>19210</td><td></td></tr><tr><td>Penicillin-Streptomycin</td><td>Gibco</td><td>15140122</td><td></td></tr><tr><td>PKH26</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>MINI26-1KT</td><td></td></tr><tr><td>PKH67</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>MINI67-1KT</td><td></td></tr><tr><td>Proteaseinhibitor Cocktail</td><td>Thermo Scientific</td><td>1862209</td><td></td></tr><tr><td>PVDF-Transfermembran</td><td>MDI</td><td>SVFX8302XXXX101</td><td></td></tr><tr><td>RAW 267.4 Zelllinie</td><td>ATCC</td><td>TIB-71</td><td></td></tr><tr><td>RIPA Puffer</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>R0278</td><td></td></tr><tr><td>Natriumchlorid</td><td>AMRESCO</td><td>0241-2.5KG</td><td></td></tr><tr><td>Superfrost Plus Gold Objektträger</td><td>Thermo Scientific</td><td>15-188-48</td><td>Selbstklebende Objektträger</td></tr><tr><td>T-75 Flaschen</td><td>Corning</td><td>431464U</td><td></td></tr><tr><td>Tecnai 12 Digitales Transmissionselektronenmikroskop</td><td>FEI Unternehmen</td><td></td><td></td></tr><tr><td>TEM Grids</td><td>Elektronenmikroskopie Wissenschaft</td><td>FSF300-cu</td><td></td></tr><tr><td>Tris-Glycin Protein Gel, 12%</td><td>Invitrogen</td><td>XP00120BOX</td><td></td></tr><tr><td>Tris-Glycin SDS Running Buffer</td><td>Invitrogen</td><td>LC26755</td><td></td></tr><tr><td>Tris-Glycin Transfer Buffer</td><td>Invitrogen</td><td>LC3675</td><td></td></tr><tr><td>TrypLE Express</td><td>Gibco</td><td>12605028</td><td>Zelldissoziationsenzym</td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Acros Organics</td><td>327371000</td><td></td></tr><tr><td>Trypsin, 0,25%</td><td>Corning</td><td>25-053-CL</td><td></td></tr><tr><td>Tween 20</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P1379</td><td></td></tr><tr><td>Ultrazentrifugenröhrchen</td><td>Beckman</td><td>344058</td><td>110.000 x g</td></tr></tbody></table>

aufnahme fluoreszierender markierter kleiner extrazellulärer vesikel in vitro und im rückenmark

Uptake of Fluorescent Labeled Small Extracellular Vesicles In Vitro and in Spinal Cord

Kleine extrazelluläre Vesikel (sEVs) sind 50-150 nm Vesikel, die von allen Zellen abgesondert werden und in Körperflüssigkeiten vorhanden sind. sEVs übertragen Biomoleküle wie RNA, Proteine und Lipide von Donor- zu Akzeptorzellen und sind damit wichtige Signalvermittler zwischen Zellen. Im zentralen Nervensystem (ZNS) können sEVs interzelluläre Signalübertragungen vermitteln, einschließlich Neuroimmuninteraktionen. sEV-Funktionen können untersucht werden, indem die Aufnahme von markierten sEVs in Empfängerzellen sowohl in vitro als auch in vivoverfolgt wird. Dieser Artikel beschreibt die Markierung von sEVs aus den konditionierten Medien von RAW 264.7-Makrophagenzellen unter Verwendung eines PKH-Membranfarbstoffs. Es zeigt die Aufnahme unterschiedlicher Konzentrationen markierter sEVs zu mehreren Zeitpunkten durch Neuro-2a-Zellen und primäre Astrozyten in vitro. Ebenfalls gezeigt wird die Aufnahme von sEVs, die intrathekal in Rückenmarksneuronen, Astrozyten und Mikroglia der Maus abgegeben werden, die durch konfokale Mikroskopie visualisiert werden. Die repräsentativen Ergebnisse zeigen zeitabhängige Variationen in der Aufnahme von sEVs durch verschiedene Zellen, was dazu beitragen kann, eine erfolgreiche sEVs-Abgabe in das Rückenmark zu bestätigen.

Nach der Isolierung von sEVs aus RAW 264.7-konditionierten Medien durch Zentrifugation wurde NTA verwendet, um die Konzentration und Größenverteilung der gereinigten sEVs zu bestimmen. Die durchschnittliche mittlere Größe von RAW 264,7-abgeleiteten sEVs betrug 140 nm und die Spitzenpartikelgröße betrug 121,8 nm, was bestätigt, dass die meisten nachweisbaren Partikel in der Lichtstreumessung in den Größenbereich von Exosomen oder sEVs bei 50-150 nm fielen (Abbildung 1A). Wie in den minimalen ...

Wir beschreiben ein Protokoll, um aus Makrophagen gewonnene kleine extrazelluläre Vesikel mit PKH-Farbstoffen zu kennzeichnen und ihre Aufnahme in vitro und im Rückenmark nach intrathekaler Entbindung zu beobachten.

Aufnahme fluoreszierender markierter kleiner extrazellulärer Vesikel in vitro und im Rückenmark

Small extracellular vesicles (sEVs) are 50-150 nm vesicles secreted by all cells and present in bodily fluids. sEVs transfer biomolecules such as RNA, ...

Die Visualisierung der Aufnahme kleiner extrazellulärer Vesikel, auch bekannt als sEVs, durch verschiedene Zellen im Rückenmark kann eine erfolgreiche Abgabe von sEVs bestätigen. Dies ermöglicht sowohl mechanistische als auch therapeutische Untersuchungen von intrathekal verabreichten sEVs aus verschiedenen Quellen in Nagetiermodellen. Dieses Protokoll kann verwendet werden, um die Aufnahme von sEVs durch Zellen in einem milden Rückenmark zu visualisieren, und kann helfen, die Rolle von sEVs und ihren Ladungsmolekülen bei Wirbelsäulenerkrankungen, Schmerzen und Entzündungen zu bewerten.Dieses Verfahren wird von mir zusammen mit Xuan Luo a nd Zhucheng Lin, den beiden Doktoranden im Labor von Dr. Seena Ajit, demonstriert. Beginnen Sie, indem Sie 18 Millimeter Abdeckungsrutsche in die 12-Well-Platte legen, dann Platten-Neuro-2a-Zellen in jeder Vertiefung mit insgesamt 1 Milliliter vollständigem DMEM mit 10% FBS und 1% Stiftstreusel. Wenn die Zellzahlgewandtheit 80 bis 90% erreicht hat, ändern Sie das Medium zu DMEM Exosome erschöpftem Medium in jeder Vertiefung fügen Sie ein, 5 oder 10 Mikrogramm markierte sEVs hinzu.Für 1, 4 und 24 Stunden. Für dosis- und zeitabhängige Aufnahme in den Rest der Vertiefungen bei gleichem Volumen der Farbstoffkontrolle. Sammeln Sie die Gehirne postnataler Welpen in einer 60 Millimeter großen Petrischale mit eiskalter Hanks-ausgewogener Salzlösung, ergänzt mit 10 millimollaren Hepes, sezieren Sie beide kortikalen Lappen und entfernen Sie die Hirnhäute.Dann hacken Sie das Gewebe mit einer sterilisierten Klinge. Das Gewebe wird in ein 15-Milliliter-Konusröhrchen mit Pepan oder Desoxyribonukleus, einem Dissoziationspuffer, inkubiert und 20 Minuten bei 37 Grad Celsius inkubiert, das Röhrchen alle 5 Minuten verwirbelt, den Überstand absaugen und 5 Milliliter vollständiges DMEM in das Röhrchen geben. Um die Enzymaktivität zu inaktivieren, versuchen Sie, die Gewebe sorgfältig mit einer 5 Milliliter Glaspersatz pipette und einer flammenpolierten Weidepipette zu dissoziieren.Führen Sie die Zellsuspension durch ein 40 Mikrometer großes Zellsieb und zentrifugieren Sie die Zellen dann bei 250 mal G für 5 Minuten bei 4 Grad Celsius, saugen Sie das Medium an und sehen Sie die Zellen in 10 Millilitern vollständigem DMEM in einem 75-Quadratzentimeter-Kolben. Ersetzen Sie nach 4 Stunden Beschichtung das Supernat und das Medium durch 15 Milliliter frisches DMEM-Medium. Nach 14 Tagen in vitro, um die Mikroglia und Oligodendrozyten zu lösen, den Kolben für 6 Stunden bei 320 U / min in einen Orbitalschüttler überführen.Verwenden Sie 5 Milliliter des Zelldissoziationsenzyms für 10 Minuten bei 37 Grad Celsius. Um zu tripsinisieren, fügen die verbleibenden Astrozyten, um die enzymatische Wirkung zu inaktivieren, fügen Sie 5 Milliliter vollständiges DMEM hinzu und pelletieren Sie dann die Zellen bei 250 mal G für 5 Minuten bei 4 Grad Celsius. Resuspendieren Sie die Zellen in vollständigem DMEM und sehen Sie, wie die Zellen auf der 12 Millimeter Zahl 1,5 Abdeckung in eine 24 Well Platte schlüpfen.Mit PBS die Zellen 3 mal ausspülen und dann mit 4% Power Formaldehyd oder PFA in PBS für 10 Minuten bei Raumtemperatur fixieren. Waschen Sie die festen Zellen 3 Mal für 5 Minuten mit PBS und permeabilisieren Sie sie mit 0,1% Triton X 100 in PBS für 10 bis 15 Minuten. Wiederholen Sie dann die Waschungen mit PBS.Verwenden Sie 5% normales Ziegenserum oder NGS in PBS für 1 Stunde bei Raumtemperatur, um die Zellen zu blockieren, inkubieren Sie die Neuro-2a-Zellen mit Map-Zwei-Wege-Antikörpern und die primären Astrozyten mit GFAP-Antikörpern in einem Verhältnis von 1 zu 500 in frischem 5% NGS oder PBS über Nacht bei 4 Grad Celsius mit sanftem Schütteln. Nachdem Sie die Zellen 3 Mal in PBS gewaschen haben, fügen Sie die Fluorophor-konjugierten sekundären Antikörper in 5% NGS hinzu. 2 Stunden bei Raumtemperatur vor Licht geschützt auf einer Wippe inkubieren.Wiederholen Sie das Waschen mit PBS und inkubieren Sie die Zelle mit 1 Mikrogramm pro Milliliter DAPI für 10 Minuten bei Raumtemperatur. Waschen Sie die Zellen erneut 3 Mal mit PBS. Montieren Sie mit einem Anti-Fade-Montagemedium die Cover-Slips auf Dias Nummer 1, lassen Sie sie über Nacht im Dunkeln trocknen und lagern Sie die vorbereiteten Glasobjektträger bei 4 Grad Celsius bis zur Bildgebung auf einem konfokalen Mikroskop.Sezieren Sie das Rückenmark und fixieren Sie es in 4% PFA in PBS bei 4 Grad Celsius für 24 Stunden. Schützen Sie die Gewebe in 30% Saccharose in PBS bei 4 Grad Celsius für 24 Stunden oder bis das Gewebe sinkt und lagern Sie das Gewebe dann bei 4 Grad Celsius bis zur Immunhistochemie, immmieren Sie das L4 L5 Rückenmark in OCT-Verbindung, dann frieren Sie es auf Trockeneis ein, bis es vollständig erstarrt ist. Verwenden Sie einen Kryostaten, um das Gewebe in 30 Mikrometern zu durchtrappen, und sammeln Sie die Abschnitte in einer 24-Well-Platte, die PBS enthält.Waschen Sie die Abschnitte 3 mal für jeweils 5 Minuten mit 0,3% Triton in PBS, blockieren Sie die unspezifischen Bindungsstellen mit 5% MGS in 0,3% Triton PBS für 2 Stunden bei Raumtemperatur. Inkubieren Sie die Abschnitte über Nacht bei 4 Grad Celsius auf einem Shaker. Waschen Sie die Abschnitte 3 mal für 5 Minuten mit 0,3% Triton in Pbs.Fügen Sie dann die entsprechende Konzentration der sekundären Antikörper hinzu. Laut Textmanuskript zwei Stunden bei Raumtemperatur inkubieren, die Abschnitte nur mit PBS waschen und inkubieren Sie sie in 1 Mikrogramm pro Milliliter DAPI für 10 Minuten bei Raumtemperatur. Wiederholen Sie dann die PBS-Wäschen unter einem Lichtmikroskop, montieren Sie die Abschnitte auf einem klaren Klebeobjektträger mit einem feinen Pinsel.Befeuchten Sie den Deckzettel mit dem Montagemedium und härten Sie über Nacht im Dunkeln bei Raumtemperatur aus, nehmen Sie Bilder unter einem konfokalen Mikroskop mit den jeweiligen Lasern auf, Die durchschnittliche mittlere Größe von RA 2 6 4 0,7 abgeleiteten sEVs betrug 140 Nanometer und die Spitzenpartikelgröße betrug 121,8 Nanometer. Mit den am besten nachweisbaren Partikeln, die in den Größenbereich von Exosomen oder sEVS fallen. Bei 50 bis 150 Nanometern zeigte das Western Blotting von sEVs, Zelllysat und exodepleted Media, dass sEV-abgeleitete Proteinproben die sEV-Markerproteine Alix CD81 und GAPDH enthielten.Das Zelllysat wurde mit endoplasmatischem Retikulum angereichert, dem residenten Protein Calnexin, so dass Calnexin als negativer Marker für zelluläre Kontamination diente, da es in den sEVs fehlte. Es wurde beobachtet, dass die Aufnahme von sEVs nach 1 Stunde erfolgte und für die 1, 5 und 10 Mikrogramm sEVs die Fluoreszenz nach der Inkubation nach 4 Stunden für 4, 5 und 10 Mikrogramm sEVs nachgewiesen werden konnte. Die Aufnahme von PKH 26-markierten sEVs durch primäre Astrozyten wurde untersucht und die maximale Fluoreszenz aus der sEVS-Aufnahme in primären kortikalen Astrozyten trat nach 24 Stunden auf PKH26-markierte sEVs wurden aufgenommen und maximale Fluoreszenz wurde nach 6 Stunden beobachtet, nach der Injektion in Neuronen Astrozyten und Mikrogliazellen.Die Einbeziehung von Steuerelementen, unbeschrifteten sEVs und Farbstoffkontrolle erzeugt Code zu einem Wind falsch positive jüngste Signale aufgrund der jetzt spezifischen Kennzeichnung Opry Tanz von Ungebundenen Farbstoff-Patch-Küsten. Die Aufnahme von seVs kann durch die Untersuchung des biomolekularen Frachttransfers auf Rezeptur und Zellen und Gewebe und die Bestimmung der Veränderungen der Expressionsniveaus von Biomolekülen oder Zielgenen bestätigt werden. Verhaltensstudien können auch durchgeführt werden, um die funktionellen Auswirkungen der sEV-Lieferung zu untersuchen.

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Extrazelluläre Vesikel (EVs) tragen zur Zellbiologie und interzellulären Kommunikation bei. Es besteht ein Bedarf an praktischen Assays, um die Aufnahme von Elektrofahrzeugen durch die Zellen zu visualisieren und zu quantifizieren. Das aktuelle Protokoll schlägt den EV-Aufnahmeassay vor, indem eine dreidimensionale Fluoreszenzbildgebung mittels konfokaler Mikroskopie verwendet wird, nachdem die EV-Isolierung durch ein mikrofluidisches Gerät auf Nanofiltrationsbasis erfolgt.

Extrazellulärer Vesikelaufnahme-Assay mittels konfokaler Mikroskop-Bildgebungsanalyse

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Dissection und Kultur kommissuralen Nervenzellen aus embryonalen Rückenmark

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Aufnahme fluoreszierender markierter kleiner extrazellulärer Vesikel in vitro und im Rückenmark

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