Name: Bewertung der globalen DNA-Doppelstrang-Endsektion mittels BrdU-DNA-Markierung in Verbindung mit Cell Cycle Discrimination Imaging (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-04-28T15:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 44 s
Description: Erfahren Sie die Quantifizierung von DNA-Endresektion in kultivierten Zellen mittels BrdU-Markierung und Zellzyklus-Diskriminierung. Diese Methode ermöglicht die Unterscheidung zwischen homologer Rekombination und nicht-homologer Endverknüpfung.

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Wir danken Marie-Christine Caron für die hervorragende technische Beratung. Diese Arbeit wird durch Mittel der Canadian Institutes of Health Research J.Y.M (CIHR FDN-388879) unterstützt. J.-Y.M. hat einen Tier 1 Canada Research Chair in DNA Repair and Cancer Therapeutics inne. J.O'S ist ein FRQS PhD Student Fellow und S.Y.M ist ein FRQS Postdoctoral Fellow.

1. Zellkultur, Behandlungen und Deckglasvorbereitung
HINWEIS: Alle Zellplattierungen, Transfektionen und Behandlungen, mit Ausnahme der Bestrahlung, sollten unter einer sterilen Zellkulturhaube stattfinden.
<ol><li>Tag 1<ol>
<li>Legen Sie in eine 6-Well-Platte einen einzelnen Deckglas in jeden Brunnen für so viele Bedingungen wie nötig. Platte ~ 150.000 HeLa-Zellen für die Transfektion oder medikamentöse Behandlung, je nach Wunsch. HINWEIS: Bei der Transfektion wird empfohlen, zum Zeitpunkt der Beschichtung eine umgekehrte Transfektion durchzuführen, oder es ist möglich, einige Stunden nach der Beschichtung eine Vorwärtstransfektion durchzuführen, um die Haftung zu ermöglichen. Eine umgekehrte Transfektion wird erreicht, indem die Transfektionsmischung zum Deckglas gegeben wird, bevor die Zellen hinzugefügt werden; Somit beginnt die Transfektion, bevor die Zellen zu kleben beginnen. Eine Vorwärtstransfektion hingegen ist die Zugabe der Transfektionsmischung nach der Haftung an der Oberfläche in der Regel am folgenden Tag. Es ist jedoch möglich, dies am selben Tag zu tun, vorausgesetzt, es wird genügend Zeit für die Zellen gegeben, um zu haften.</li>
		<li>Verwenden Sie für diese Methode 4 Vertiefungen: Vertiefung 1: siRNA-Kontrolle (siCTRL genannt); Gut 2: siRNA gegen PARP-1 (siPARP-1); Brunnen 3: unbehandelt; Vertiefung 4: Zellen, die 1 h vor der Bestrahlung mit 5 μM BMN673 behandelt werden sollen. ANMERKUNG: In diesem Protokoll wurden alle Prüfungen unter bestrahlten Bedingungen durchgeführt (siehe Abschnitt 1.3).</li>
		<li>Inkubieren Sie die Zellen bei 37 °C in einem 5% CO2 befeuchteten Inkubator über Nacht, obwohl das Transfektionsprotokoll eine Inkubation von bis zu 3 Tagen ermöglicht. Die Inkubationszeit vor der BrdU-Behandlung hängt von der siRNA-Transfektionseffizienz ab. Wenn es keine Transfektion gibt, reicht die Inkubation für 16 h aus, um die Einhaltung des Deckglases und ein gewisses Zellwachstum zu ermöglichen. HINWEIS: Die Bedingungen des Inkubators können je nach verwendeter Zelllinie geändert werden.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Tag 2<ol>
<li>BrdU in einer Endkonzentration von 10 μM in das entsprechende Kulturmedium geben und 16 h lang inkubieren (ein Zellzyklus). ANMERKUNG: Die BrdU-Lösung wird in Dimethylsulfoxid hergestellt; die verwendete Stammlösung beträgt 10 mM und wird in Aliquots bei -20 °C gelagert.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Tag 3<ol>
<li>Bestrahlen Sie die Platten mit einer Gesamtdosis von 5 Gy Röntgenbestrahlung (variieren Sie die Dosis der Bestrahlung je nach Bestrahlungstyp, z. B. Kleintierbestrahlungsgeräte vs. Tischbestrahlungsgeräte). Siehe die Materialtabelle für die Marke und das Modell des verwendeten Bestrahlungsgeräts.</li>
		<li>Bringen Sie die Platten zum Inkubator zurück und geben Sie die Zellen für 3 h frei.</li>
		<li>Bereiten Sie während der 3-stündigen Inkubationszeit die beiden Puffer A und B sowie 4% Paraformaldehyd (PFA) in 1x phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS) vor. HINWEIS: Die Puffer A und B und die Saccharose sollten am Tag der Fixierung frisch zubereitet werden, wobei frische Saccharoselösung verwendet wird, um eine Kontamination zu vermeiden.<ol>
<li>Bereiten Sie Puffer A (Pre-Extraction Buffer) gemäß der in Tabelle 1 beschriebenen Reihenfolge (30 ml) vor. HINWEIS: Die 1M Saccharose sollte am Tag der Anwendung vorbereitet werden, um eine Kontamination zu vermeiden.</li>
			<li>Puffer B (Cytoskeleton Stripping Buffer) gemäß der in Tabelle 1 (30 ml) beschriebenen Reihenfolge herstellen. HINWEIS: Puffer B muss in der angegebenen Reihenfolge hergestellt werden, um die Ausfällung von Tween-20 und Natriumdesoxycholatlösung zu verhindern.</li>
			<li>Bereiten Sie 4% PFA, 2 ml pro Zustand (10 ml), unter einer chemischen Haube vor (Tabelle 1).</li>
		</ol>
</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. Vorextraktion und Fixierung
HINWEIS: Alle Vorextraktionen und Fixierungen werden mit den Deckgläsern durchgeführt, die in der Gewebekulturplatte auf Eis oder bei 4 °C verbleiben. der Deckglas wird erst im letzten Schritt der Montage angehoben (siehe Diskussion).
<ol><li>Vorextraktion<ol>
<li>Aspirieren Sie das Medium, waschen Sie die Zellen vorsichtig zweimal mit 1x PBS und entfernen Sie das PBS. 2 ml Vorextraktionspuffer A zugeben und sofort bei 4 °C für 10 min inkubieren. HINWEIS: Es ist wichtig, dass die Inkubationszeit in Puffer A nicht verlängert wird. Eine verlängerte Inkubation in den Vorextraktionspuffern führt zu einer erhöhten Anzahl von abgelösten Zellen aus dem Deckglas. Alternativ kann anstelle der Inkubation bei 4 °C die Inkubation auf Eis erfolgen.</li>
		<li>Puffer A durch Aspiration entfernen. HINWEIS: Waschen Sie die Deckgläser nicht, nachdem Sie Puffer A entfernt haben. Fahren Sie mit dem nächsten Schritt fort.</li>
		<li>2 ml Cytoskeleton Stripping Buffer B zugeben und sofort bei 4 °C für 10 min inkubieren. Puffer B vorsichtig absaugen und die Zellen einmal vorsichtig mit 1x PBS waschen. Saugen Sie die 1x PBS vorsichtig ab.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Fixierung<ol>
<li>Fixieren Sie die Zellen, indem Sie 2 ml 4% PFA unter die chemische Haube geben. HINWEIS: PFA ist giftig und muss unter einer chemischen Haube manipuliert werden.</li>
		<li>Inkubieren Sie die Zellen bei Raumtemperatur für 20 min. Waschen Sie die Deckgläser zweimal mit 1x PBS und saugen Sie den Überschuss ab.</li>
		<li>Die Deckgläser mit 100% kaltem Methanol bedecken und die Deckgläser bei -20 °C für 5 min inkubieren. Zweimal mit 1x PBS waschen. HINWEIS: Das Protokoll kann hier angehalten werden. Die Deckgläser können bei 4 °C in 1x PBS gelagert und die Platte bei Bedarf in Alufolie eingewickelt werden. Die Zellen sollten nicht länger als 5 Tage vor der Fortsetzung des IF-Protokolls aufbewahrt werden.</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. Permeabilisierung
<ol><li>Inkubieren Sie die Zellen mit 2 ml 1x PBS, die 0,5% Triton X-100 enthalten, bei Raumtemperatur für 15 min. Waschen Sie die Deckgläser dreimal mit 2 ml 1x PBS.</li>
</ol>4. Immunfärbung
<ol><li>Blockierender Schritt<ol>
<li>Bereiten Sie genügend frischen Blockierpuffer (3% BSA in 1x PBS) vor, um 2 ml pro Deckglas zu verwenden. HINWEIS: Bereiten Sie einen zusätzlichen 5 ml Blockierungspuffer vor, um die Antikörperlösungen herzustellen.</li>
		<li>Geben Sie 2 ml Blockierpuffer in jede Vertiefung und inkubieren Sie bei Raumtemperatur für 1 h.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Primäre Antikörper-Inkubation<ol>
<li>Bereiten Sie die primäre Antikörperlösung in frischem Blockierungspuffer vor: BrdU RPN202 1:1000 und Proliferating Cell Nuclear Antigen (PCNA) 1:500, 100 μL pro Deckglas. HINWEIS: Um den Antikörper zu erhalten, kann ein kleineres Volumen verwendet werden, 75-100 μL für einen 22 x 22 mm Deckglas, 50-75 μL für einen 18 x 18 mm Deckglas.</li>
		<li>Auf jedem Deckglas werden 100 μL primäre Antikörperlösung zugegeben. Decken Sie die Deckgläser mit einem Quadrat Parafilm mit einer Pinzette ab und positionieren Sie den Parafilm vorsichtig, um keine Blasen zu erzeugen.</li>
		<li>Decken Sie die Platte mit Aluminiumfolie ab und inkubieren Sie den primären Antikörper über Nacht bei 4 °C in einer befeuchteten Kammer.</li>
		<li>Entfernen Sie die Parafilmquadrate und waschen Sie die Deckgläser dreimal mit 2 ml sterilem 1x PBS.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Sekundäre Antikörper-Inkubation<ol>
<li>Bereiten Sie genügend sekundäre Antikörperlösung in frischem Blockierungspuffer vor: Anti-Maus 488 fluoreszierende sekundäre A11011 (für BrdU) Verdünnung 1:800 und Anti-Kaninchen 568 fluoreszierende sekundäre A11011 (für PCNA) Verdünnung 1:800. HINWEIS: Die verwendeten Farben können an die experimentellen Bedürfnisse angepasst werden. Die verwendete Marke finden Sie in der Materialtabelle.</li>
		<li>Fügen Sie auf jedem Deckglas 100 μL sekundäre Antikörperlösung hinzu, bedecken Sie die Deckgläser mit einem Quadrat Parafilm mit einer Pinzette und positionieren Sie den Parafilm vorsichtig ohne Blasen.</li>
		<li>Inkubieren Sie den sekundären Antikörper bei Raumtemperatur für 1 h mit der Platte, die mit Aluminiumfolie bedeckt ist.</li>
		<li>Waschen Sie die Deckgläser dreimal mit 2 ml 1x PBS.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Nukleare Färbung<ol>
<li>Bereiten Sie ein Volumen von 2 ml pro Deckglas von 1x PBS mit 4',6-Diamidino-2-phenylindol (DAPI) in einer Endkonzentration von 1 μg/ml (1:1000) vor.</li>
		<li>Fügen Sie auf jedem Deckglas 2 ml der DAPI-Lösung hinzu. Die Deckgläser bei Raumtemperatur für 10 min mit der platte mit Alufolie bedecken. Waschen Sie die Deckgläser zweimal mit 1x PBS.</li>
		<li>Decken Sie die Deckgläser mit 1x PBS ab und verwenden Sie entweder eine Nadel oder eine feine Pinzette, um den Deckglas von der Unterseite des Brunnens zu heben. Tupfen Sie die überschüssige Flüssigkeit vorsichtig ab, indem Sie eine Kante vorsichtig auf ein Papiertuch klopfen. HINWEIS: Achten Sie darauf, den Objektträger nicht fallen zu lassen oder die flache Oberfläche mit den anhaftenden Zellen das Papier berühren zu lassen.</li>
		<li>Montieren Sie die Deckgläser auf Dias mit 10-20 μL ZF-spezifischen Montagemedien.</li>
	</ol>
</li>
</ol>5. Bildaufnahme und -analyse
HINWEIS: Die Bildaufnahme kann auf verschiedenen Arten von Fluoreszenzmikroskopen erfolgen. Ein Epifluoreszenzmikroskop mit einem 63-fachen Ölobjektiv wurde verwendet; siehe die Materialtabelle für die Marke und das Modell. Z-Stacks sind nicht erforderlich, obwohl sie je nach Zelllinie und Grad der mitochondrialen Färbung von Nutzen sein können.
<ol><li>Bildanalyse<ol>
<li>Erstellen Sie für jedes Bild mehrere TIFF-Dateien. Verschmelzen Sie alle Ebenen, aber halten Sie die Farbkanäle getrennt. Importieren Sie diese Dateien in Cell Profiler (The Broad Institute https://cellprofiler.org/home) und analysieren Sie sie mithilfe der Speckle Counting-Pipeline (Supplemental Video 1).</li>
		<li>Laden Sie die Bilder hoch (ergänzende Abbildung S1A).<ol>
<li>Um mit der Erstellung des Projekts zu beginnen, laden Sie die Speckle-Zählpipeline in das Programm und die zu analysierenden Bilder im bereitgestellten Bereich.</li>
			<li>Verwenden Sie das NamesAndTypes-Modul , um jedem Bild einen aussagekräftigen Namen zuzuweisen, mit dem andere Module auf it-C01: Darstellung des BRDU-Kanals verweisen. C02: Darstellung des PCNA-Kanals; C03: Darstellung des DAPI-Kanals. HINWEIS: Diese Identifikatoren hängen vom Mikroskop ab. Der Dateiname sollte einen Bezeichner enthalten, um zwischen den Kanälen zu unterscheiden.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Identifizieren Sie, welche Datei verwendet werden soll, um die Kerne zu identifizieren, und benennen Sie sie (ändern Sie diesen Namen nach Bedarf) (siehe Ergänzende Abbildung S1B und Ergänzende Abbildung S1C).<ol>
<li>Wählen Sie den Durchmesser des Objekts zwischen 50 und 300 Pixeleinheiten aus, was der akzeptable Größenbereich für Kerne ist, aber ändern Sie den Wert so, dass er zu den Kernen im Bild passt. HINWEIS: Es kann sein, dass 50 ein zu großer Wert ist und verhindert, dass kleinere Kerne identifiziert werden; Ebenso kann 300 es ermöglichen, große Gruppierungen von Kernen als 1 zu zählen.</li>
			<li>Verwerfen Sie Objekte außerhalb des Durchmesserbereichs, um sicherzustellen, dass nur Objekte gezählt werden, die den Kriterien entsprechen.</li>
			<li>Verwerfen Sie Objekte, die Rahmen berühren, um Zellen zu entfernen, die sich möglicherweise nur teilweise im Feld befinden.</li>
			<li>Wenden Sie den Schwellenwert an, um ihn an die spezifischen Bilder anzupassen. Beachten Sie die folgenden Einstellungen als Beispiel. Ändern Sie den Schwellenwertkorrekturfaktor basierend darauf, wie streng die Schwellenwertstrategie sein wird. Zu den weiteren Einstellungen gehören die Schwellenwertstrategie: Global; Schwellenwertmethode: Otsu; Schwellenwerte für zwei Klassen oder drei Klassen: Zwei Klassen; Schwellenwert-Glättungsskala: 1; Schwellenwert-Glättungsfaktor: 1; untere und obere Grenzen des Schwellenwerts: 0,0 und 1,0; Methode zur Unterscheidung verklumpter Objekte: Shape; und Methode zum Zeichnen von Trennlinien zwischen verklumpten Objekten: Propagate. HINWEIS: Für jeden Parameter bietet der Zellenprofiler ergänzende Definitionen und verfügbare Möglichkeiten für die Variableneinstellung.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Identifizieren Sie das primäre Objekt, um die Herde zu identifizieren (ergänzende Abbildung S2A).<ol>
<li>Verwenden Sie die folgenden Einstellungen: Wählen Sie das Eingabebild aus: Maskedgreen; benannte das primäre Objekt, das identifiziert werden soll: BrdUFoci; typischer Durchmesser des Objekts: 1-15; Verwerfen Sie das Objekt außerhalb des Durchmesserbereichs: Ja; Verwerfen Sie das Objekt, das den Rand des Bildes berührt: Nein; Schwellenwertstrategie: Adaptiv; Schwellenwertmethode: Otsu; Schwellenwerte für zwei Klassen oder drei Klassen: Drei Klassen; Schwellenwert-Glättungsskala: 1; Schwellenwert-Glättungsfaktor: 3; und Größe des Glättungsfilters: 4.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Messen Sie die Intensität (ergänzende Abbildung S2B).<ol>
<li>Wählen Sie das zu messende Bild aus: OrigGreen.</li>
			<li>Klicken Sie auf Weiteres Bild hinzufügen. Wählen Sie das zu messende Bild aus: PCNA. Wählen Sie die zu messenden Objekte aus: Kerne. HINWEIS: Dies wird verwendet, um die BrdU- und PCNA-Intensität zu messen - die endgültigen Daten, die grafisch dargestellt werden.</li>
		</ol>
</li>
	</ol>
</li>
</ol>

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<li>Huertas, P., Cruz-García, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single+molecule+analysis+of+resection+tracks%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Single molecule analysis of resection tracks.</a> Methods in Molecular Biology. 1672, 147-154 (2018).</li>
<li>Soniat, M. M., Myler, L. R., Kuo, H. -C., Paull, T. T., Finkelstein, I. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RPA+phosphorylation+inhibits+DNA+resection%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Cell%22%5BJournal%5D)">RPA phosphorylation inhibits DNA resection.</a> Molecular Cell. 75 (1), 145-153 (2019).</li>
</ol>

Die Autoren haben nichts preiszugeben.

Dieser Artikel beschreibt eine Methode, die die IF-Färbung nutzt, um Variationen in der DNA-Resektion in Cellulo zu messen. Der aktuelle Standard für die Beobachtung eines Effekts auf die DNA-Resektion ist die RPA-Färbung; Dies ist jedoch eine indirekte Methode, die durch DNA-Replikation beeinflusst werden kann. Zuvor wurde eine weitere BrdU-Inkorporations-basierte DNA-Resektions-IF-Technik zur Klassifizierung der resultierenden Intensitäten in BrdU-positiven und BrdU-negativen Zellen beschrieben. Diese Methode ...

Die Modulation von DNA-Reparaturfaktoren ist eine sich ständig weiterentwickelnde Methode für die Krebstherapie, insbesondere in DNA-DSB-Reparatur-defizienten Tumorumgebungen. Die Hemmung spezifischer Reparaturfaktoren ist eine der genialen Strategien, um Krebszellen für DNA-schädigende Wirkstoffe zu sensibilisieren. Jahrzehntelange Forschung führte zur Identifizierung verschiedener Mutationen von DNA-Reparaturgenen als Biomarker für therapeutische Strategieentscheidungen1. Infolgedessen ist das DNA-Reparaturfeld zu einem Zentrum für die Arzneimittelentwicklung geworden, um eine breite Palette von Behandlungen zu gewährleisten und das Konzept der personalisierten Medizin zu stärken. 
DSBs werden durch zwei Hauptwege repariert: NHEJ und HR2. Der NHEJ-Signalweg ist fehleranfällig, indem er die beiden DNA-Enden mit wenig bis gar keiner DNA-Endverarbeitung schnell ligariert und die Proteinkinase (DNA-PKcs), den Ku70/80-Komplex, 53BP1 und RIF1-Proteine3 umfasst. Im Gegensatz dazu ist HR ein treuer Mechanismus, der von BRCA14 initiiert wurde. Ein wesentlicher Schritt bei der HR-Reparatur ist der DNA-Endresektionsprozess, bei dem es sich um den Abbau der gebrochenen Enden handelt, der zu einzelsträngiger (ss) DNA mit 3'-OH-Enden führt. BRCA1 erleichtert die Rekrutierung der nachgeschalteten Proteine, die das Resektosom MRN/RPA/BLM/DNA2/EXO1 bilden, die an der 5' bis 3' DNA-Resektion beteiligt sind5.
Die anfängliche Endresektion wird durch die Endonukleaseaktivität von MRE11 erreicht, was eine weitere Verarbeitung durch die DNA2- und EXO1-Nukleasen ermöglicht. Die erzeugten ssDNA-Überhänge werden schnell mit Replikationsprotein A (RPA) beschichtet, um sie vor einer weiteren Verarbeitung zu schützen. Anschließend setzen BRCA2, PALB2 und BRCA1 ein, um die Verschiebung von RPA und die Montage des RAD51-Nukleofilaments zu vermitteln, das für den homologiegesteuerten Reparaturmechanismus erforderlich ist. Eine feine Balance zwischen der Verwendung von NHEJ und HR ist für die optimale Aufrechterhaltung der genomischen Integrität notwendig. Die Wahl des Weges hängt von der Zellzyklusphase ab. HR wird bevorzugt während der S- bis G2-Phasen verwendet, in denen die DNA-Resektion auf höchstem Niveau ist und die Schwesterchromatiden zur Verfügung stehen, um eine ordnungsgemäße Reparatur zu gewährleisten.
Poly (ADP-ribose) Polymerase 1 (PARP-1) ist eines der frühesten Proteine, die für das DSB rekrutiert wurden. Es regelt sowohl die Resektionsaktivität als auch die Montage von nachgeschalteten Effektoren, die am NHEJ5,6 beteiligt sind. PARP-1 wird auch für die Reparatur von DNA-Einzelsträngelbrüchen während der Replikation benötigt7,8. Aufgrund seiner wichtigen Rolle bei der DNA-Reparatur werden PARP-Inhibitoren (PARPi) als Krebstherapien eingesetzt. Bei mehreren HR-defizienten Krebsarten führt die PARPi-Behandlung zu einer synthetischen tödlichen Reaktion aufgrund der Unfähigkeit von HR-defizienten Zellen, den akkumulierten Schaden über einen alternativen Weg zu reparieren9,10. Derzeit gibt es vier von der FDA zugelassene PARPi: Olaparib, Rucaparib, Niriparib und Talazoparib (auch BMN 673 genannt), die für verschiedene Brust- und Eierstockkrebsbehandlungen eingesetzt werden11. PARPi-Resistenzen sind jedoch häufig, und eine mögliche Ursache entsteht durch den Erneuterwerb von HR-Kenntnissen12. Der Verlust oder die Hemmung von PARP-1 in Gegenwart von Bestrahlung dysreguliert die Resektosom-Maschinerie, was zur Anhäufung längerer ssDNA-Trakte führt13. Daher ist eine eingehende Untersuchung der DNA-Resektion in vivo entscheidend für ein klareres Verständnis der DNA-Reparaturwege und die anschließende Entwicklung neuer Strategien zur Behandlung von Krebs und zur Überwindung der PARPi-Resistenz.
Es wurden mehrere Methoden verwendet, um DNA-Resektionsereignisse nachzuweisen5. Eine solche Methode ist die klassische IF-basierte Technik, die eine indirekte Färbung und Visualisierung der resezierten DNA nach stressinduziertem DSB unter Verwendung eines Anti-RPA-Antikörpers ermöglicht. Die Markierung genomischer DNA mit 5-Brom-2′-Desoxyuridin (BrdU) und der Nachweis von nur ssDNA ist eine direkte Messung von DNA-Resektionsereignissen. Es umgeht die Überwachung von RPA, die an mehreren zellulären Prozessen wie der DNA-Replikation beteiligt ist. Bei der hier beschriebenen Methode ermöglichen zellen, die mit BrdU für einen einzelnen Zellzyklus inkubiert wurden, dass BrdU in einen Strang der replizierenden zellulären DNA eingebaut wird. Nach der Resektion wird die IF-Färbung unter Bedingungen durchgeführt, die einen BrdU-Nachweis nur in der ssDNA-Form unter Verwendung eines Anti-BrdU-Antikörpers ermöglichen. Dieser Antikörper kann nur auf exponierte BrdU-Nukleotide zugreifen und erkennt keine in doppelsträngige DNA integrierten Nukleotide. Mittels Fluoreszenzmikroskopie kann die resezierte DNA in Form von punktförmigen BrdU/ssDNA-Herden sichtbar gemacht werden. Die Kernintensität dieser Herde kann als Auslesung verwendet werden, um die Resektion nach DNA-Schäden zu quantifizieren. Diese Arbeit beschreibt Schritt für Schritt die Prozesse dieser Methode, die auf die meisten Säugetierzelllinien angewendet werden kann. Diese Methode sollte als einfache Möglichkeit zur Überwachung der DNA-Endresektion in Cellulo als Proof of Concept von großem Nutzen sein.

<table><tbody><tr><td>Alexa 568 Anti-Kaninchen Anti-Kaninchen</td><td>Molekulare Sonden</td><td>A11011</td><td>1:800</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 488 Ziege Anti-Maus</td><td>Molekulare Sonden</td><td>A11001</td><td>1:800</td></tr><tr><td>Anti PARP1 (F1-23)</td><td>Hausgemachte</td><td></td><td>1:2500</td></tr><tr><td>Anti PCNA (SY12-07)</td><td>Novus</td><td>NBP2-67390</td><td>1:500</td></tr><tr><td>Anti-Alpha Tubulin (DM1A)</td><td>Abcam</td><td>Ab7291</td><td>1:100000</td></tr><tr><td>anti-BrdU</td><td>GE Healthcare</td><td>RPN202</td><td>1:1000</td></tr><tr><td>Tischgerät Röntgenstrahler</td><td>Zelle Rad</td><td></td><td></td></tr><tr><td>BMN673</td><td>MedChem Express</td><td>HY-16106</td><td></td></tr><tr><td>Bromodeoxyuridin (BrdU)</td><td>Sigma</td><td>B5002</td><td></td></tr><tr><td>BSA</td><td>Sigma</td><td>A7906</td><td></td></tr><tr><td>Zellprofiler</td><td>Broad Institute</td><td>V 3.19</td><td>https://cellprofiler.org/</td></tr> <tr><td>Curwood Parafilm M Laboratory Wrapping Film 4in / 250 ft</td><td>Fisher scientific</td><td>13-374-12</td><td></td></tr><tr><td>DAPI (4',6-Diamidino-2-phenylindole, Dihydrochlorid)</td><td>Invitrogen Life Technology</td><td>D1306</td><td></td></tr><tr><td>DMEM hoher Glukosegehalt</td><td>Fisher scientific</td><td>10063542</td><td></td></tr><tr><td>EGTA</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E3889</td><td></td></tr><tr><td>Fetal Rinderserum</td><td>Gibco</td><td>12483-020</td><td></td></tr><tr><td>Fisherbrand Deckgläser: Quadrate 22 x 22</td><td>Fisher scientific</td><td>12 541B</td><td></td></tr><tr><td>Fluoreszenzmikroskop</td><td>Leica</td><td>DMI6000B</td><td>63x Immersionsobjektiv</td></tr><tr><td>HeLa</td><td>ATCC</td><td>CCL-2</td><td></td></tr><tr><td>HERACELL 160I CO2 INKUBATOR CU 1-21 TC 120V</td><td>VWR</td><td>51030408</td><td>37% CO2</td></tr><tr><td>MgCl2</td><td>BioShop Kanada</td><td>MAG520.500</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>BioShop Kanada</td><td>SOD002.10</td><td></td></tr><tr><td>Nadel</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>PBS 1x</td><td>Wisent Bio Products</td><td>311-010-CS</td><td></td></tr><tr><td>PFA 16%</td><td>Cedarlane Labs</td><td>15710-S(EM)</td><td></td></tr><tr><td>PIPES</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P6757-100G</td><td></td></tr><tr><td>ProLong Gold Antifade Eindeckmittel</td><td>Invitrogen Life Technology</td><td>P-36930</td><td></td></tr><tr><td>RNAiMAX</td><td>Invitrogen</td><td>13778-075</td><td></td></tr><tr><td>siPARPi</td><td>Dharmacon</td><td></td><td>AAG AUA GAG CGU GAA GGC GAA dTdT</td></tr><tr><td>siRNA Kontrolle</td><td>Dharmacon</td><td></td><td>UUCGAACGUGUCACGUCAA</td></tr><tr><td>Natriumdesoxycholcat</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D6750-100G</td><td></td></tr><tr><td>Saccharose</td><td>BioShop Canada</td><td>SUC507.5</td><td></td></tr><tr><td>Tris-base</td><td>BioShop Canada</td><td>TRS001.5</td><td></td></tr><tr><td>Trition X-100</td><td>Millipore Sigma</td><td>T8787-250ML</td><td></td></tr><tr><td>Tween20</td><td>Fisher wissenschaftliche</td><td>Pinzette BP337500</td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

bewertung der globalen dna-doppelstrang-endsektion mittels brdu-dna-markierung in verbindung mit cell cycle discrimination imaging

Assessment of Global DNA Double-Strand End Resection using BrdU-DNA Labeling coupled with Cell Cycle Discrimination Imaging

Die Untersuchung der DNA-Schadensantwort (DDR) ist ein komplexes und essentielles Feld, das durch den Einsatz von DDR-targeting-Medikamenten zur Krebsbehandlung nur noch wichtiger geworden ist. Diese Ziele sind Poly(ADP-Ribose)-Polymerasen (PARPs), die verschiedene Formen der DNA-Reparatur initiieren. Die Hemmung dieser Enzyme mit PARP-Inhibitoren (PARPi) erreicht eine synthetische Letalität, indem eine therapeutische Verwundbarkeit in homologen Rekombinations- (HR)-defizienten Zellen aufgrund von Mutationen bei Brustkrebs Typ 1 (BRCA1), BRCA2 oder Partner und Lokalisierer von BRCA2 (PALB2) verliehen wird. 
Zellen, die mit PARPi behandelt werden, akkumulieren DNA-Doppelstrangbrüche (DSBs). Diese Brüche werden von der DNA-Endresektionsmaschinerie verarbeitet, was zur Bildung von einzelsträngiger (ss) DNA und anschließender DNA-Reparatur führt. In einem BRCA1-defizienten Kontext verursacht die Wiederbelebung der DNA-Resektion durch Mutationen in DNA-Resektionsinhibitoren wie 53BP1 und DYNLL1 eine PARPi-Resistenz. Daher ist die Möglichkeit, die DNA-Resektion in Cellulo zu überwachen, entscheidend für ein klareres Verständnis der DNA-Reparaturwege und die Entwicklung neuer Strategien zur Überwindung der PARPi-Resistenz. Immunfluoreszenz (IF)-basierte Techniken ermöglichen die Überwachung der globalen DNA-Resektion nach DNA-Schäden. Diese Strategie erfordert eine langpulsige genomische DNA-Markierung mit 5-Brom-2′-Desoxyuridin (BrdU). Nach DNA-Schäden und DNA-Endresektion wird die resultierende einzelsträngige DNA von einem Anti-BrdU-Antikörper unter nativen Bedingungen spezifisch nachgewiesen. Darüber hinaus kann die DNA-Resektion auch mit Hilfe von Zellzyklusmarkern untersucht werden, um zwischen verschiedenen Phasen des Zellzyklus zu unterscheiden. Zellen in der S /G2-Phase ermöglichen die Untersuchung der Endresektion innerhalb der HR, während G1-Zellen zur Untersuchung des nicht-homologen Endzusammenfügens (NHEJ) verwendet werden können. Ein detailliertes Protokoll für diese IF-Methode, gekoppelt an die Zellzyklusunterscheidung, wird in diesem Artikel beschrieben.

In diesem Protokoll wurde der Bromodeoxyuridin (BrdU)-basierte Assay verwendet, um die Resektionsreaktion von HeLa-Zellen auf bestrahlungsinduzierte Schäden quantitativ zu messen. Die erzeugten ssDNA-Spuren werden nach der Immunfluoreszenzfärbung als unterschiedliche Herde visualisiert (Abbildung 1A). Die identifizierten Herde wurden dann quantifiziert und als integrierte Gesamtintensität der BrdU-Färbung in den Kernen ausgedrückt (Abbildung 1B, Ergänzen...

Im vorliegenden Protokoll demonstrieren wir, wie die DNA-Doppelstrang-Endsektion während der S/G2-Phase des Zellzyklus mit einer immunfluoreszenzbasierten Methode visualisiert werden kann.

Bewertung der globalen DNA-Doppelstrang-Endsektion mittels BrdU-DNA-Markierung in Verbindung mit Cell Cycle Discrimination Imaging

The study of the DNA damage response (DDR) is a complex and essential field, which has only become more important due to the use of DDR-targeting drugs ...

Dieses Protokoll ermöglicht die Cellulo-Quantifizierung von DNA und die Resektion nach DNA-Schäden. Der Hauptvorteil dieser Technik ist die Zellzyklusmarkierung, die die Zellen auf die S- und G2-Phase beschränkt und sicherstellt, dass das Bromodeoxyuridin-Signal aus DNA und Resektion resultiert. Das Verfahren wird von Jean-Yves Masson, einem leitenden Forscher, und Sofiane Y.Mersaoui, einem Postdoktoranden, demonstriert.Arbeiten Sie unter einer sterilen Kulturhaube und legen Sie einen einzelnen Deckglas in jede Vertiefung einer Sechs-Well-Platte für so viele Bedingungen wie nötig. Platte etwa 150.000 HeLa-Zellen zur Transfektion oder medikamentösen Behandlung. Am dritten Tag, nach der nächtlichen Inkubation mit BrdU in einer Endkonzentration von 10 Mikromol, bestrahlen Sie die Platten mit einer Gesamtdosis von fünf Grau der Röntgenbestrahlung.Nach der Bestrahlung geben Sie die Platten zur Inkubation bei 37 Grad Celsius in einem 5% Kohlenoxid befeuchteten Inkubator für drei Stunden zurück. Zur Vorextraktion das Medium absaugen und die Zellen zweimal vorsichtig mit PBS waschen. Nachdem Sie PBS entfernt haben, fügen Sie zwei Milliliter Vorextraktionspuffer A hinzu und inkubieren Sie die Zellen bei vier Grad Celsius für 10 Minuten auf Eis.Nach 10 Minuten Puffer A aspirieren, zwei Milliliter Zytoskelett-Stripping-Puffer B hinzufügen und die Inkubation wiederholen. Dann vorsichtig Puffer B absaugen und die Zellen mit PBS waschen. Nach dem Absaugen von PBS fixieren Sie die Zellen, indem Sie zwei Milliliter von 4% Paraformaldehyd unter die chemische Haube geben.Nach dem Entfernen des Paraformaldehyds und dem Waschen mit PBS die Deckgläser mit 100% kaltem Methanol für die Inkubation bei minus 20 Grad Celsius für fünf Minuten abdecken und die Deckgläser zweimal mit PBS waschen. Zur Permeabilisierung inkubieren Sie die Zellen mit zwei Millilitern PBS, die 0,5% Tritan X-100 bei Raumtemperatur enthalten. Nach 15 Minuten waschen Sie die Deckgläser dreimal mit zwei Millilitern PBS.Für die Immunfärbung fügen Sie jedem Bohrloch zwei Milliliter Blockierungspuffer hinzu. Nach einer Stunde Inkubation 100 Mikroliter primäre Antikörperlösung zu jedem Deckglas geben. Verwenden Sie eine Pinzette, um die Deckgläser mit quadratischem Parafilm abzudecken, und positionieren Sie den Parafilm sorgfältig, um keine Blasen zu erzeugen.Dann die Platte mit Aluminiumfolie abdecken und den primären Antikörper über Nacht bei vier Grad Celsius in einer befeuchteten Kammer inkubieren. Entfernen Sie am nächsten Tag die Parafilmquadrate und waschen Sie die Deckgläser dreimal mit zwei Millilitern PBS. Nach dem Waschen werden 100 Mikroliter sekundäre Antikörperlösung auf jeden Deckglas gegeben und die Deckgläser wie gezeigt mit einem Quadrat Parafilm bedeckt.Inkubieren Sie den Sekundärantikörper bei Raumtemperatur für eine Stunde und schützen Sie die Platte mit Folie vor Licht. Anschließend waschen Sie die Deckgläser dreimal mit zwei Millilitern 1X PBS. Für die Kernfärbung fügen Sie zwei Milliliter DAPI-Lösung zu jedem Deckglas hinzu und waschen Sie die Deckgläser mit PBS.Fügen Sie 10 bis 20 Mikroliter ZF-spezifisches Montagemedium auf Objektträger hinzu. Verwenden Sie die Nadel oder eine feine Pinzette, um den Deckglas vom Boden des Brunnens zu heben. Tupfen Sie überschüssige Flüssigkeit vorsichtig ab, indem Sie eine Kante vorsichtig auf ein Papiertuch klopfen und die Deckgläser auf Objektträger montieren.Importieren Sie diese Dateien zur Bilderfassung und -analyse in CellProfiler und analysieren Sie sie mithilfe der Speckle-Zählpipeline. Identifizieren Sie das primäre Objekt, um die Herde anhand der im Textmanuskript beschriebenen Einstellungen zu identifizieren und die Intensität zu messen. Repräsentative Bilder der Bildung von 5-Brom-2-prime-Desoxyuridin-Herden und der proliferierenden Zellkernantigenfärbung nach Bestrahlung sind hier gezeigt.Die erzeugten einzelsträngigen DNA-Spuren wurden als unterschiedliche Herde visualisiert. Die identifizierten Herde wurden dann quantifiziert und als integrierte Gesamtintensität der Bromodeoxyuridin-Färbung in den Kernen exprimiert. Die Co-Färbung zeigte eine Differenzierung zwischen der Kurzstreckenresektion aufgrund einer nicht-homologen Endverbindung und der Langstreckenresektion der homologen Rekombination unter Verwendung eines Anti-PCNA-Antikörpers zur Identifizierung von Zellen, die die S-Phase durchlaufen.PCNA ist im Zellkern prominent und erreicht die maximale Expression während der S-Phase des Zellzyklus mit einer ziemlich intensiven Färbung. Das Ergebnis in Werten wird dann als Streudiagramm dargestellt, um zwischen PCNA-positiven und PCNA-negativen Kernen zu unterscheiden. Die PCNA-negativen Ergebnisse werden aus dem Datensatz entfernt, um eine brdU-intensitätsbasierte Analyse aufgrund des niedrigen BRDU-Signals unabhängig von der Bedingung zu ermöglichen.Die PCNA-negativen Kerne beherbergen eine basal integrierte Intensität von BrdU-Herden von 900 beliebigen Einheiten und dieser Wert erreicht 1.800 AE in PCNA-positiven Kernen. Unter der siRNA-Kontrollbedingung beträgt die integrierte Intensität der BrdU-Herde pro Zellkern etwa 1.500 AE in den PCNA-positiven Kernen. Nach einem effizienten Knockdown von PARP-1 unter Verwendung einer siRNA wurde ein signifikanter Anstieg der Intensität der BrdU-Herde auf etwa 1.900 AE beobachtet.Diese Technik kann wichtige Einblicke in die erste Stufe der homologen Rekombination liefern und so helfen zu erkennen, ob ein Protein am ersten Schritt des Reparaturweges beteiligt ist. Die Inkubationszeit für die Vorextraktionspuffer muss strikt eingehalten werden. Eine übermäßige Exposition gegenüber diesen Puffern führt zu einer übermäßigen Zellablösung und einem erhöhten Hintergrundsignal.

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Biology

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Dieser Artikel beschreibt, GFP-basierte...

Die Analyse der DNA-Doppelstrang Break (DSB) Reparatur in Säugerzellen

Die Bestimmung der Zellzyklus-Position eine Population von Zellen, oder zu verstehen, wie Signale Verbreitung beeinflussen, kann leicht durch Durchflusszytometrie mit diesem Protokoll gemessen werden. Wir berichten über einen einfachen experimentellen Ansatz zur Färbung von Zellen und die Quantifizierung ihrer Position in den Zellzyklus.

Analyse des Zellzyklus Position in Säugerzellen

Tracking-feine Veränderungen in der Progression und die Kinetik der Zellzyklusstadien kann durch Verwendung einer Kombination von metabolische Markierung von Nukleinsäuren mit BrdU und genomischer Gesamt-DNA-Färbung über Propidiumiodid durchgeführt werden. Dieses Verfahren vermeidet die Notwendigkeit von chemischen Synchronisation der Rad-Zellen, wodurch die Einführung von nicht-spezifischen DNA-Schäden, die sich wiederum auf den Ablauf des Zellzyklus.

Mess-Zellzyklus-Progression Kinetics mit Metabolische Markierung und Durchflusszytometrie

Verwaltung der beiden Analoga von Thymidin, EDU und BrdU, bei schwangeren Mäusen ermöglicht die Analyse des Zellzyklus in neuronalen und Vorläuferzellen im embryonalen Gehirn der Maus. Dieses Verfahren ist nützlich, um die Auswirkungen der genotoxischen Stress, einschließlich ionisierender Strahlung, während der Gehirnentwicklung zu bestimmen.

Beurteilung der Zellzyklus-Progression of Neural Stem-und Vorläuferzellen im sich entwickelnden Gehirn Maus nach genotoxischen Stress

Reparatur von Doppel-Strang DNA-Brüchen ist ein dynamischer Prozess, erfordern nicht nur Bildung von Reparatur-komplexen in den Pausen, sondern auch deren Auflösung nach die Läsion gerichtet ist. Hier verwenden wir Immunfluoreszenz-Mikroskopie für vorübergehende und dauerhafte Doppelstrang-Brüche als Werkzeug dieses Genom-Wartung-Mechanismus zu sezieren.

Charakterisierung von DNA-Reparaturprozesse bei Transienten und langlebige Doppel-Strang DNA-Brüchen durch Immunfluoreszenz-Mikroskopie

Die vorgestellte Methode kombiniert die quantitative Analyse von DNA-Doppelstrangbrüchen (DSBs), Zellzyklusverteilung und Apoptose, um eine zellzyklusspezifische Auswertung der DSB-Induktion und -Reparatur sowie die Folgen eines Reparaturfehlers zu ermöglichen.

Zellzyklusspezifische Messung von H2AX und Apoptose nach genotoxischem Stress durch Durchflusszytometrie

Die Zellzyklusanalyse mit 5-Ethynyl-2'-desoxyuridin (EdU) und Phospho-Histon H3 (pH3) Markierung ist ein mehrstufiges Verfahren, das eine umfangreiche Optimierung erfordern kann. Hier stellen wir ein detailliertes Protokoll vor, das alle Schritte für dieses Verfahren einschließlich Bildanalyse und Quantifizierung beschreibt, um Zellen in verschiedenen Zellzyklusphasen zu unterscheiden.

5-Ethynyl-2'-Desoxyuridin/Phospho-Histon H3 Dual-Labeling Protocol for Cell Cycle Progression Analysis in Drosophila Neural Stem Cells

Hier stellen wir eine auf Durchflusszytometrie basierende Methode zur Visualisierung und Quantifizierung mehrerer seneszenzassoziierter Marker in einzelnen Zellen vor.

Simultane Bildgebung und Durchflusszytometrie-basierte Detektion mehrerer fluoreszierender Seneszenzmarker in therapieinduzierten seneszenten Krebszellen

Das folgende Protokoll zeigt den Nachweis einzelsträngiger DNA-Foci in der G1-Phase des Zellzyklus unter Verwendung von Zellzyklussynchronisation, gefolgt von RPA2-Immunfluoreszenzfärbung.

Visualisierung einzelsträngiger DNA-Herde in der G1-Phase des Zellzyklus

Wir präsentieren Protokolle zur Bewertung der Kompetenz des Doppelstrangbruch-Reparaturwegs in Zellen unter Verwendung einer Reihe von lumineszenzbasierten extrachromosomalen Reportersubstraten.

Bewertung der Reparaturaktivität von DNA-Doppelstrangbrüchen mit Hilfe von Hochdurchsatz- und quantitativen Lumineszenz-basierten Reporter-Assays

Erfahren Sie die Quantifizierung von DNA-Endresektion in kultivierten Zellen mittels BrdU-Markierung und Zellzyklus-Diskriminierung. Diese Methode ermöglicht die Unterscheidung zwischen homologer Rekombination und nicht-homologer Endverknüpfung.

Bewertung der globalen DNA-Doppelstrang-Endsektion mittels BrdU-DNA-Markierung in Verbindung mit Cell Cycle Discrimination Imaging (Video) | JoVE Journal

Bewertung der globalen DNA-Doppelstrang-Endsektion mittels BrdU-DNA-Markierung in Verbindung mit Cell Cycle Discrimination Imaging

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