Verwendung der postnatalen In-vivo-Elektroporation zur Untersuchung der Morphologie von Kleinhirngranula-Neuronen und der Synapsenentwicklung
9. Juni 2021
Hier beschreiben wir eine Methode zur Visualisierung der Synaptogenese von Körnerneuronen im Kleinhirn der Maus über den zeitlichen Verlauf der postnatalen Gehirnentwicklung, wenn diese Zellen ihre synaptischen Strukturen verfeinern und Synapsen bilden, um sich in den gesamten Gehirnkreislauf zu integrieren.
Das Protokoll untersucht Kleinhirngranula-Neuronen in verschiedenen Entwicklungsstadien, um das morphologische Wachstum von Schlüsseln zu visualisieren. Zu den Vorteilen der Technik gehören zellspezifisches Targeting, schnelle Expression von transfizierten Konstrukten und spärliche Markierung von Zellen, die die Untersuchung zellautonomer Effekte ermöglicht. Beginnen Sie mit dem Schneiden eines 11,2-Millimeter-Segments von einer Ladepipettenspitze und legen Sie das geschnittene Teil als Abstandshalter über die Spitze der Hamilton-Spritze, um die Injektionstiefe auf 1,5 Millimeter zu begrenzen.
Befestigen Sie den Abstandshalter mit Klebstoff oder Parafolie an der Spritzenspitze. Um die Morphologie einzelner elektroporierter CGNs aus sagittalen Hirnschnitten des experimentellen Welpen zu untersuchen, nehmen Sie Z-Stapel-Bilder mit 0,5 Mikrometern pro Stapel auf einem konfokalen Mikroskop auf. Bilde eine Zelle pro Bildfenster, um eine einfache Bildanalyse und 3D-Rekonstruktion zu ermöglichen.
Analysieren Sie die Neuritenlänge und die dendritische Klauenbildung verblindet mit einem einfachen Neuriten-Tracer. Laden Sie Einkanal-Z-Stack-Bilder von elektroporierten CGNs nach Fidschi hoch und klicken Sie auf Plugins"Segmentierung"und Simple Neurite Tracer"Wählen Sie Neuen 3D-Viewer erstellen"aus dem Dropdown-Menü. Scrollen Sie zur Basis eines Dendriten, der sich mit dem Zellsoma verbindet, und starten Sie einen Pfad, indem Sie auf die Kreuzung klicken.
Verfolgen Sie den Pfad manuell, indem Sie durch die Abschnitte klicken, in denen das Zellenfüllsignal am hellsten ist, und Y-Taste drücken, um die Spur beizubehalten. Verfolgen Sie bis zum Ende des Dendriten und bestätigen Sie den Pfad durch Drücken von F.Alternativ können Sie bis zur Basis der Klaue verfolgen. Als nächstes verfolgen Sie die Klaue von der Basis der Struktur bis zum Ende des längsten Neuriten.
Verfolgen Sie sekundäre und tertiäre Zweige, indem Sie die Strg-Taste unter Windows oder die ALT-Taste unter macOS gedrückt halten und auf den Pfad klicken. Bestätigen Sie den Pfad, indem Sie F drücken.Beachten Sie, dass die Messungen für die Leiterbahnen in einem separaten Fenster sichtbar sind. Addieren Sie alle Größen der Klauenzweige, um die Gesamtlänge für jede Klaue zu erhalten.
In der repräsentativen Analyse zeigten Projektionsbilder von elektroporierten CGNs von 3 bis 14 Tagen nach der Injektion eine fortschreitende Abnahme der Anzahl der Dendriten. CGNs durchliefen eine Phase des dendritischen Wachstums, gefolgt von einer Verfeinerung von 3 DPI auf 7 DPI, die dazu führte, dass mehr als 50% der überschüssigen Dendriten beschnitten wurden. Dieses Ereignis fällt mit der allmählichen Verlängerung der verbleibenden Dorne bei der Bildung klauenartiger Strukturen am Ende jedes Dendriten zusammen, was darauf hindeutet, dass diese Entwicklungsprozesse gleichzeitig ablaufen.
Bei 7 DPI wurden Krallen bei etwa 75% der Dendriten gefunden. Jedes markierte CGN wurde in NMRS rekonstruiert, um die gesamte somato-dendritische Oberfläche und das Volumen zu quantifizieren. Es wurde kein signifikanter Unterschied in der CGN-Größe über die Entwicklung hinweg beobachtet.
Obwohl CGNs bei 7 DPI einen signifikanten Rückgang des Volumens um 20 % im Vergleich zu 3, 5 und 10 DPI aufwiesen. Das Wichtigste bei dem Verfahren ist, das Kleinhirn vor der Injektion genau zu lokalisieren. Die Methode kann angepasst werden, um Gene in vivo genetisch zu manipulieren, um ihre Rolle bei der Entwicklung von Körnerneuronen durch Transfektion von shRNAs, siRNAs oder Cre-Rekombinase zu untersuchen.
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Übersicht
Dieser Artikel stellt ein Protokoll zur Untersuchung der morphologischen Entwicklung von Cerebellarkörnerneuronen (CGNs) im sich entwickelnden Maus-Cerebellum mittels In-vivo-Elektroporation vor. Die Technik ermöglicht eine spärliche Markierung und genetische Manipulation der CGNs und erlaubt eine detaillierte Analyse des dendritischen Wachstums, der Klammerbildung und der Synaptogenese während wichtiger Entwicklungsstadien. Die Methode kombiniert präzise Injektion, konfokale Bildgebung und quantitative morphometrische Analyse, um die Reifung der CGNs über die Zeit zu verfolgen.
Wesentliche Studienkomponenten
Bereich der Wissenschaft
- Neurowissenschaften
- Entwicklungsbiologie
- Zellbiologie
Hintergrund
- Neurone durchlaufen während der Gehirnentwicklung erhebliche strukturelle und funktionelle Veränderungen.
- Das Kleinhirn von Nagetieren ist ein Modellsystem zur Untersuchung der Einzelzell-Morphogenese, insbesondere von CGNs.
- CGNs bilden spezialisierte dendritische Klauen aus, die für die synaptische Eingabe entscheidend sind.
- Herkömmliche Markierungsmethoden weisen häufig einen Mangel an Zellspezifität oder zeitlicher Auflösung auf.
Zweck der Studie
- Um die morphologische Entwicklung einzelner CGNs in vivo zu visualisieren und zu quantifizieren.
- Um das dendritische Wachstum, die Rückbildung und die Krallenbildung über verschiedene Entwicklungszeitpunkte hinweg zu verfolgen.
- Um eine Plattform für die zellautonome genetische Manipulation von CGNs bereitzustellen.
Verwendete Methoden
- In-vivo-Elektroporation von Granulaneuron-Progenitoren im sich entwickelnden Kleinhirn der Maus.
- Sparse-Labeling von CGNs zur klaren morphologischen Analyse.
- Konfokale Mikroskopie mit Z-Stack-Aufnahmen zur 3D-Rekonstruktion.
- Manuelle Nachverfolgung und Quantifizierung der Neuritenlänge sowie der dendritischen Klammerstrukturen mithilfe von Fiji und Simple Neurite Tracer.
Hauptergebnisse
- Projektionsaufnahmen von 3 bis 14 Tagen nach der Injektion (DPI) zeigten eine fortschreitende Abnahme der Dendritenzahl pro CGN.
- Zwischen Tag 3 und 7 DPI durchliefen die CGNs eine dendritische Bescherung, wobei über 50 % der überschüssigen Dendriten eliminiert wurden.
- Am Ende der verbliebenen Dendriten bildeten sich klauenartige Strukturen, wobei bis zum 7. DPI an etwa 75 % der Dendriten Klauen vorhanden waren.
- Die Größe der CGNs blieb weitgehend konstant, obwohl im Vergleich zu anderen Zeitpunkten am 7. DPI ein signifikanter Rückgang des Volumens um 20 % beobachtet wurde.
Schlussfolgerungen
- Das Protokoll ermöglicht eine detaillierte, zellspezifische Analyse der morphologischen Entwicklung von CGN in vivo.
- Die dendritische Bescherung und die Klammbildung sind gleichzeitige Prozesse während der Reifung der CGN.
- Die Methode ist anpassbar für genetische Eingriffe, um die Genfunktion in der CGN-Entwicklung zu untersuchen.
Häufig gestellte Fragen
Ausführliche Bedeutung für die Industrie
Die quantitative in vivo-Analyse der Morphologie von Kleinhirn-Granulumneuronen (CGN) und der Synapsenentwicklung adressiert ein zentrales Erfordernis für eine vorhersagbare Sicherheit bei der Validierung neurodevelopmentaler Zielstrukturen. Durch spärliche Markierung und genetische Manipulationsmöglichkeiten wird eine mechanistische Entschärfung von Risiken bereits in den frühesten Phasen der ZNS-Forschung ermöglicht. Dieser Ansatz unterstützt die translationale Kontinuität, indem er die zelluläre Morphogenese mit der synaptischen Integration verknüpft und somit Entscheidungen im forschungs- und entwicklungstechnischen Portfolio im Bereich der Neurobiologie fundiert.
Strategische Anwendungen in der Biopharma-Forschung und -Entwicklung
Frühe Entdeckung und Zielvalidierung
- Ermöglicht die direkte Untersuchung der Genfunktion bei der Morphogenese und Synaptogenese von CGN.
- Unterstützt die mechanistische Entschärfung von Risiken durch die Isolierung zellautonomer Effekte in vivo.
- Liefert quantitative Messwerte für die hypothesengeleitete Target-Validierung.
- Ermöglicht die Triagierung neurodevelopmentaler Zielstrukturen basierend auf morphologischen und synaptischen Phänotypen.
Screening und Assay-Entwicklung
- Etabliert validierte, reproduzierbare Workflows für die Bildgebung und Analyse der neuronalen Morphologie.
- Liefert quantitative Metriken wie Dendritenzahl, Klammerbildung und Neuritenlänge für nachgeschaltete Screening-Verfahren.
- Ermöglicht die Standardisierung von Assays durch verblindete, softwaregestützte morphometrische Analyse.
- Bereitet robuste biologische Systeme für Wirkstoff- oder genetische Screening-Verfahren in CNS-Pipelines vor.
Translationale und präklinische Forschung
- Koppelt morphologische Phänotypen mit krankheitsrelevanten synaptischen Entwicklungsprozessen in Nagetiermodellen.
- Unterstützt die Kontinuität von der frühen Entdeckung bis zur präklinischen Validierung von Interventionen bei neurodevelopmentalen Störungen.
- Bietet eine Plattform zur Bewertung translationaler Biomarker der synaptischen Reifung.
- Reduziert Risiken bei der Weiterentwicklung, indem zelluläre Veränderungen mit funktionellen synaptischen Ergebnissen verknüpft werden.
Pipeline- und Workflow-Integration
Diese Methode integriert den Prozess von der frühen Entdeckung bis zur Identifizierung von Leitstrukturen in der CNS-Forschung und ermöglicht iteratives Hypothesentesten sowie eine quantitative Phänotypisierung genetischer oder pharmakologischer Interventionen.
- Entdeckungsbiologie: Unterstützt die Überprüfung der Nullhypothese zur Genfunktion bei der Neuritenmorphogenese und Synapsenbildung.
- Screening: Liefert reproduzierbare, quantitative Ergebnisse zur Analyse der dendritischen und synaptischen Struktur.
- Analytik: Ermöglicht verblindete, softwaregestützte Messung der Neuritenlänge, dendritischer Zellfortsätze und Zellvolumen.
- Translationale Forschung: Verbindet zelluläre Phänotypen mit krankheitsrelevanten synaptischen Entwicklungsprozessen in vivo.
- Unternehmensweite Wiederverwendung: Anpassbar für vielfältige genetische Modifikationen und Modelle des zentralen Nervensystems in verschiedenen Entdeckungsprogrammen.
Operative und unternehmerische Auswirkungen
- Wissenschaftlicher Wert: Erhöht das Vorhersagevertrauen bei der Validierung neurodevelopmentaler Zielstrukturen und der mechanistischen Entschärfung von Risiken.
- Operativer Wert: Standardisiert die In-vivo-Bildgebung und morphometrische Analyse hinsichtlich Reproduzierbarkeit und Skalierbarkeit.
- Strategischer Wert: Unterstützt Go/No-Go-Entscheidungen, indem genetische Störungen mit quantifizierbaren neuronalen Phänotypen verknüpft werden.
- Portfolio-Wirkung: Ermöglicht die risikoadjustierte Priorisierung zentralnervöser Zielstrukturen basierend auf robusten In-vivo-Daten.
Durchführungsüberlegungen
- Setzt Fachkenntnisse in der Neuroanatomie von Nagetieren und präzise stereotaktische Injektionstechniken voraus.
- Erfordert Zugang zu konfokaler Mikroskopie und fortschrittlicher Bildanalyse-Software (z. B. Fiji, Simple Neurite Tracer).
- Benötigt eine standardisierte Vorgehensweise über Teamgrenzen hinweg für die verblindete Analyse und Dateninterpretation.
- Kann an verschiedene genetische Konstrukte (shRNA, siRNA, Cre-Rekombinase) für zellautonome Studien angepasst werden.
- Die Genauigkeit der Injektion und die Effizienz der Zellmarkierung sind entscheidend für reproduzierbare Ergebnisse.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:05
Introduction
0:39
Preparing the Injection Syringe for Electroporation
2:34
Results: Analysis of Granule Neuron Morphology and Size During Cerebellar Development
3:45
Conclusion
1:00
Morphological Analyses of Cerebellar Granule Neurons (CGNs): 3D Reconstruction
