Identifizierung antibakterieller Immunitätsproteine in Escherichia coli mittels MALDI-TOF-TOF-MS/MS und Top-Down-Proteomanalyse

Das Protokoll demonstriert eine schnelle Methode zur Identifizierung bakterieller Proteine mittels Antibiotika-Induktion und Massenspektrometrie. Der Hauptvorteil der Technik ist ihre Geschwindigkeit und Einfachheit. Die Probenvorbereitung ist unkompliziert.

Die Technik kann auf die Charakterisierung von pathogenen Bakterien wie Virulenzfaktoren oder Antibiotikaresistenz ausgeweitet werden, um eine geeignete Behandlung für eine bakterielle Infektion besser zu informieren. Verwenden Sie zunächst eine sterile Ein-Mikroliter-Schleife, um Bakterien aus einzelnen Kolonien zu ernten, die auf LB-Agarplatte angebaut werden. Und übertragen Sie auf ein zwei Milliliter großes O-Ring-Ring-Schraubverschluss-Mikrozentrifugenröhrchen mit 300 Mikrolitern HPLC-Wasser.

Dann das Rohr kurz wirbeln und die Zellen durch Zentrifugation mit einem 0,75 Mikroliter langen Reliktwasser des Probenüberstands auf dem Edelstahl-MALDI-Target entwirren und trocknen lassen. Überlagern Sie den getrockneten Probenfleck mit 0,75 Mikrolitern einer gesättigten Lösung von Sinapinsäure, die in 33% Acetonitril, 67% Wasser und 0,2% Trifluoressigsäure hergestellt wurde, und lassen Sie den Spot trocknen. Sobald der Spot getrocknet ist, laden Sie das Ziel in das Massenspektrometer.

Öffnen Sie die Erfassungssoftware und klicken Sie auf MS Linear Mode Acquisition oder Masse-zu-Ladungsbereich und Masse-zu-Ladung der unteren und oberen Grenzen in ihren jeweiligen Feldern. Klicken Sie auf den zu analysierenden Probenspot in der MALDI-Zielvorlage. Drücken Sie dann die linke Maustaste und ziehen Sie den Cursor über den Probenspot, um den rechteckigen Bereich anzugeben, der für eine Laserablation oder Ionisation abgetastet werden soll.

Lassen Sie die Maustaste los, um die Erfassung zu starten, und sammeln Sie 1000 Laserschüsse für jeden Probenpunkt. Wenn Ionen nicht detektiert werden, erhöhen Sie die Laserintensität, indem Sie den gleitenden Skalenbalken unter Laserintensität einstellen, bis das Proteinionensignal erkannt wird. Klicken Sie nach Abschluss der MS Linear Mode Acquisition auf MS/MS Reflectron Mode Acquisition.

Geben Sie die zu analysierende Vorläufermasse in das Feld Vorläufermasse ein. Geben Sie als Nächstes eine Isolationsbreite in Dalton in das Fenster Vorläufermasse für die Seite mit niedriger und hoher Masse der Vorläufermasse ein. Klicken Sie auf die Schaltfläche CID Aus.

Klicken Sie dann auf die Schaltfläche Metastable Suppressor On. Stellen Sie die Laserintensität auf mindestens 90 % ihres Maximalwerts ein, indem Sie die gleitende Skalierungsleiste wie gezeigt anpassen. Klicken Sie auf den zu analysierenden Probenspot in der MALDI-Zielvorlage, drücken Sie dann die linke Maustaste und ziehen Sie den Cursor über den Probenspot, um den rechteckigen Bereich anzugeben, der für die Laserablation oder Ionisation abgetastet werden soll, lassen Sie die Maustaste los, um die Erfassung zu initiieren, und sammeln Sie 10.000 Laserschüsse für jeden Probenspot wie gezeigt.

Doppelklicken Sie auf die ausführbare Datei Protein Biomarker Seeker und das Fenster mit der grafischen Benutzeroberfläche wird angezeigt. Geben Sie die Masse des Protein-Biomarkers in das Feld Reife Proteinmasse und den Massenmessfehler in das Feld Massentoleranz ein. Klicken Sie optional auf die Schaltfläche Komplementärer b/y-Ionen-Proteinmassenrechner, um die Proteinmasse aus einem vermeintlichen komplementären Fragmentionenpaar zu berechnen, und das Popup-Fenster des Proteinmassenrechner-Tools wird angezeigt.

Geben Sie das Masse-Zuladungs-Verhältnis des vermeintlichen komplementären Fragment-Ionenpaares ein, klicken Sie auf die Schaltfläche Paar hinzufügen, und die Rechnerproteinmasse wird angezeigt. Kopieren Sie diesen Wert, fügen Sie diesen Wert in das Feld Mature Protein Mass ein, und schließen Sie das Werkzeugfenster Proteinmassenrechner. Klicken Sie auf das Feld Rückstandsbeschränkung festlegen.

Wählen Sie die Endklemmensignal-Peptidlänge, und das Pop-up mit einer gleitenden Skala und einem Cursor erscheint und bewegt den Cursor auf die gewünschte Signalpeptidlänge. Wenn die Signalpeptidlänge nicht ausgewählt ist, wird von der Software eine uneingeschränkte Sequenzkürzung durchgeführt. Wählen Sie unter Fragmentionbedingung die Residues For Polypeptide Backbone Cleavage aus, indem Sie auf die Kästchen eines oder mehrerer Reste, D-E-N und/oder P, klicken Und dann auf die Schaltfläche Enter Fragment Ions Plus One to be search, und die Popup-Fragmentseite wird angezeigt.

Klicken Sie anschließend auf die Schaltfläche Fragmention hinzufügen, und für jedes ein einzugebende Fragmention erscheint ein Dropdown-Feld. Geben Sie die Masse-durch-Ladungs-Verhältnisse der Fragmentionen und die zugehörige Masse nach Ladungstoleranz ein. Klicken Sie dann auf die Schaltfläche Speichern und schließen.

Scrollen Sie im rechten Seitenfeld von How Many Fragment Ions Need To Be Matched (Wie viele Fragmentionen müssen abgeglichen werden), um die Mindestanzahl von Fragmentionen auszuwählen, die zur Identifizierung abgeglichen werden müssen, und wählen Sie die Cysteinreste in ihrem oxidierten Zustand aus. Wenn die Proteine nach der Suche nicht identifiziert werden, wiederholen Sie die Suche mit Cysteinen in ihrem reduzierten Zustand. Klicken Sie unter Dem Datei-Setup auf das Symbol FASTA-Datei auswählen, um die FASTA-Datei mit den In-silico-Proteinsequenzen des zuvor konstruierten Bakterienstamms zu durchsuchen und auszuwählen.

Wählen Sie dann einen Ausgabeordner aus und erstellen Sie einen Ausgabedateinamen. Klicken Sie auf das Symbol Suche nach Dateieinträgen ausführen. Ein Popup-Fenster mit dem Titel Suchparameter bestätigen wird angezeigt, in dem die Suchparameter angezeigt werden, bevor die Suche initiiert wird.

Wenn die Suchparameter korrekt sind, klicken Sie auf Suche starten. Wenn die Parameter falsch sind, klicken Sie auf Abbrechen, und geben Sie die richtigen Parameter erneut ein. Sobald die Suche initiiert wurde, wird das Parameterfenster geschlossen und ein neues Popup-Fenster mit einem Fortschrittsbalken wird angezeigt, der den Fortschritt der Suche und eine laufende Zählung der Anzahl der gefundenen Identifikationen anzeigt.

Nach Abschluss der Suche wird der Fortschrittsbalken automatisch geschlossen und eine Zusammenfassung der Suche wird im Protokollfeld der grafischen Benutzeroberfläche zusammen mit einem neuen Popup-Fenster angezeigt, in dem die gefundenen Proteinidentifikationen angezeigt werden. In der aktuellen Studie wurden Bakterienkulturen in LB mit zwei verschiedenen Konzentrationen von Mytomycin-C gezüchtet. Das Massenspektrum der Bakterienkultur ist mit einer Mytomycin-C-Konzentration gewachsen.

Es wurden Kälteschockprotein C, Kälteschockprotein E und ein durch Plasmid übertragenes Protein unbekannter Funktion identifiziert. Das unbekannte Proteinion bei 9780 wurde von MS / MS analysiert, und das Vorläuferion wurde mit einem Zeitionenselektorfenster von ungefähr 100 Dalton isoliert. Das Fragmention in der Masse, um 9675,9 aufzuladen, ist ein Spillover von der Dissoziation des metastabilen Proteinions bei 9655.

Die Sequenz des Immunitätsproteins für Colicin E3 enthält basische Reste möglicher Ionisationsstellen. Die Fragmentionen, die aus der Spaltung des Polypeptid-Rückgrats nachgewiesen wurden, als die reduzierte Form von Cystein während der Suche verwendet wurde. Das N-terminale Methionin wird als Post-Translation-Modifikation entfernt.

Wenn die Bakterienkultur bei einer hohen Mytomycin-C-Konzentration gezüchtet wurde, wurde das Immunitätsprotein von Bakteriacin identifiziert. Der unbekannte Peak bei 9651 wurde mittels MS/MS analysiert, und das Vorläuferion wurde mit einem engeren und asymmetrischeren TIS-Fenster von minus 75 plus 60 Dalton isoliert. Die Sequenz des Immunitätsproteins von Bakteriacin enthält basische Rückstände möglicher Ionisationsstellen.

Die Fragmentionen, die aus der Spaltung des Polypeptid-Rückgrats nachgewiesen wurden, als die reduzierte Form von Cystein während der Suche verwendet wurde. Mit den unterschiedlichen Konzentrationen von Antibiotika kann die relative Proteinhäufigkeit variieren. Und diese wurden mittels Massenspektrometrie analysiert.

Beobachten Sie bei der Ernte von Bakterienzellen die Koloniemorphologie und das Bakterienwachstum in Bezug auf Antibiotika und Konzentration. Eine Ein-Mikroliter-Schleife von Zellen ist notwendig, um Proteine nachzuweisen.