Name: Identifizierung antibakterieller Immunitätsproteine in Escherichia coli mittels MALDI-TOF-TOF-MS/MS und Top-Down-Proteomanalyse (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-05-23T15:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 26 s
Description: Lernen Sie die schnelle Identifizierung antibakterieller Immunitätsproteine in Escherichia coli mittels MALDI-TOF-TOF-MS/MS und Top-Down-Proteomanalyse. Diese Methode ermöglicht effiziente Proteinanalysen.

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Protein Biomarker Seeker Software ist frei verfügbar (kostenlos) durch Kontaktaufnahme mit Clifton K. Fagerquist unter clifton.fagerquist@usda.gov. Wir möchten die Unterstützung dieser Forschung durch ARS, USDA, CRIS Grant: 2030-42000-051-00-D anerkennen.

1. Mikrobiologische Probenvorbereitung
<ol><li>Impfen Sie 25 ml Luria-Brühe (LB) in einem 50 mL konischen Röhrchen mit E. coli O113:H21-Stamm RM7788 (oder einem anderen Bakterienstamm) aus einem Glycerinvorrat unter Verwendung einer sterilen 1 μL-Schleife. Röhre verschließen und bei 37 °C mit Schütteln (200 U/min) für 4 h vorkultivieren.</li>
	<li>Aliquot 100 μL vorkultivierte Brühe und auf einer LB-Agarplatte verteilt, ergänzt mit 400 oder 800 ng / ml Mitomycin-C. Agarplatten statisch über Nacht in einem Inkubator bei 37 °C kultivieren. VORSICHT: STEC-Stämme sind pathogene Mikroorganismen. Führen Sie alle mikrobiologischen Manipulationen, über die Kultivierung hinaus, in einer BSL-2-Biosicherheitswerkbank durch.</li>
	<li>Ernten Sie Bakterienzellen aus einzelnen sichtbaren Kolonien mit einer sterilen 1-μL-Schleife und übertragen Sie sie in ein 2,0 mL O-Ring-ausgekleidetes Mikrozentrifugenröhrchen mit 300 μL HPLC-Wasser. Kappen Sie das Rohr, wirbeln Sie es kurz und zentrifugieren Sie es bei 11.337 x g für 2 min, um die Zellen zu pelletieren.</li>
</ol>2. Massenspektrometrie
<ol><li>Markieren Sie 0,75 μL Aliquot des Probenüberstandes auf das EDELSTAHL-MALDI-Target und lassen Sie es trocknen. Überlagern Sie den getrockneten Probenfleck mit a0,75 μL Aliquot einer gesättigten Lösung von Sinapinsäure in 33% Acetonitril, 67% Wasser und 0,2% Trifluoressigsäure. Lassen Sie die Stelle trocknen.</li>
	<li>Analysieren Sie die getrockneten Probenspots mit einem MALDI-TOF-TOF-Massenspektrometer.<ol>
<li>Nachdem Sie das MALDI-Ziel in das Massenspektrometer geladen haben, klicken Sie in der Erfassungssoftware auf die Schaltfläche für die Erfassung im ms linearen Modus. Geben Sie den zu analysierenden m/z-Bereich ein, indem Sie die m/z der unteren und oberen Grenze (z. B. 2 kDa bis 20 kDa) in die entsprechenden Felder in der Erfassungsmethode-Software eingeben.</li>
		<li>Klicken Sie auf den zu analysierenden Probenspot auf der MALDI-Zielvorlage in der Software. Drücken Sie dann die linke Maustaste und ziehen Sie den Mauszeiger über den Probenspot, um den rechteckigen Bereich anzugeben, der für die Laserablation/ Ionisation abgetastet werden soll. Lassen Sie die Maustaste los und die Erfassung wird eingeleitet. Sammeln Sie 1.000 Laserschüsse für jeden Probenspot. HINWEIS: Die Datenerfassung wird in Echtzeit im Softwareerfassungsfenster angezeigt.</li>
		<li>Wenn keine Ionen detektiert werden, erhöhen Sie die Laserintensität, indem Sie die Gleitskalaleiste unter Laserintensität in der Software anpassen, bis das Proteinionensignal erkannt wird. Dies wird als Schwellenwert bezeichnet. HINWEIS: Kalibrieren Sie das Gerät vor der Probenspotanalyse extern im linearen MS-Modus mit Proteinkalibranten, deren m/z den zu analysierenden Bereich abdecken, z. B. die Ladezustände +1 und +2 von Proteinkalibranten: Cytochrom-C, Lysozym und Myoglobin decken einen Massenbereich von 2 kDa bis 20 kDa ab. Als Fokusmasse wird eine Zwischenmasse innerhalb des vorgegebenen Massenbereichs verwendet, z.B. 9 kDa. Die Fokusmasse ist das Ion, dessen m/z für die Detektion durch den linearen Modendetektor optimal fokussiert ist.</li>
		<li>Wenn die Erfassung im linearen MS-Modus abgeschlossen ist, klicken Sie in der Erfassungssoftware auf die Schaltfläche für die Erfassung des MS/MS-Reflektormodus. Geben Sie die zu analysierende Vorläufermasse in das Feld Vorläufermasse ein. Als nächstes geben Sie eine Isolationsbreite (in Da) in das Precursor-Massenfenster für die Low- und High-Mass-Seite der Precursor-Masse ein, z. B. ±100 Da.</li>
		<li>Klicken Sie auf die Schaltfläche CID Aus. Klicken Sie auf die Schaltfläche Metastable Suppressor ON. Stellen Sie die Laserintensität auf mindestens 90% ihres Maximalwerts ein, indem Sie die gleitende Skala unter der Laserintensität in der Software einstellen.</li>
		<li>Klicken Sie auf den zu analysierenden Probenspot auf der MALDI-Zielvorlage in der Software. Drücken Sie dann die linke Maustaste und ziehen Sie den Mauszeiger über den Probenspot, um den rechteckigen Bereich anzugeben, der für die Laserablation/Ionisation abgetastet werden soll. Lassen Sie die Maustaste los, und die Erfassung wird initiiert. Sammeln Sie 10.000 Laserschüsse für jeden Probenspot. ANMERKUNG: Vor der Stichprobenpunktanalyse sollte das Gerät extern im MS/MS-Reflektormodus kalibriert werden, wobei die Fragmentionen aus dem Post-Source-Zerfall (PSD) des +1-Ladungszustands von alkyliertem Thioredoxin35 verwendetwerden sollten.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Verarbeiten Sie keine MS-Rohdaten. Verarbeiten Sie MS/MS-PSD-Rohdaten mit der folgenden Schrittfolge in der angegebenen Reihenfolge: erweiterte Baseline-Korrektur (32, 0,5, 0,0), gefolgt von Rauschunterdrückung (zwei Standardabweichungen), gefolgt von Gaußscher Glättung (31 Punkte).</li>
	<li>Überprüfen Sie ms/MS-PSD-Daten manuell auf das Vorhandensein prominenter Fragmentionen, die von PBC19,20 erzeugtwurden.</li>
	<li>Auswertung von MS/MS-Daten in Bezug auf die absolute und relative Häufigkeit von Fragmentionen und deren Signal-Rausch-Rauschen (S/N). Verwenden Sie nur die am häufigsten vorkommenden Fragmentionen für die Proteinidentifizierung, insbesondere wenn die MS/MS-PSD-Daten verrauscht sind.</li>
</ol>3. Aufbau der In-silico-Proteindatenbank
<ol><li>Generieren Sie eine Textdatei mit In-silico-Proteinsequenzen des Bakterienstamms, die von der Protein Biomarker Seeker-Software zur Proteinidentifizierung gescannt wird. Proteinsequenzen werden aus der Gesamtgenomsequenzierung (WGS) des zu analysierenden Stammes (oder eines eng verwandten Stammes) abgeleitet.</li>
	<li>Auf der NCBI/PubMed-Website (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/protein/) können Sie etwa 5.000 Proteinsequenzen des spezifischen Bakterienstamms (z. B. Escherichia coli O113:H21-Stamm RM7788) herunterladen, der analysiert wird. Die maximale Downloadgröße beträgt 200 Sequenzen.<ol>
<li>Kopieren Sie daher die 25 Downloads und fügen Sie sie in eine einzige Textdatei ein. Wählen Sie das FASTA-Format (Text) für jeden Download aus.</li>
	</ol>
</li>
</ol>4. Betrieb der Protein Biomarker Seeker Software
<ol><li>Doppelklicken Sie auf die ausführbare Datei Protein Biomarker Seeker. Ein Fenster mit grafischer Benutzeroberfläche (GUI) wird angezeigt(Abbildung 1,oberes Bedienfeld).</li>
	<li>Geben Sie die Masse des Protein-Biomarkers (gemessen im MS-linearen Modus) in das Feld Mature Protein Mass ein. Geben Sie als Nächstes den Massenmessfehler in das Feld Massentoleranz ein. Der Standard-Massenmessfehler ist ±10 Da für ein 10.000 Da Protein.</li>
	<li>Klicken Sie optional auf die Schaltfläche Complementary b/y ion Protein Mass Calculator, um die Proteinmasse aus einem vermeintlich komplementären Fragmentionenpaar (CFIP oder b/y) zu berechnen. Ein Popup-Fenster, Protein Mass Calculator Tool, wird angezeigt(Abbildung 1,unterer Bereich).<ol>
<li>Geben Sie die m/z des vermeintlichen CFIP ein und klicken Sie auf die Schaltfläche Add Pair. Die berechnete Proteinmasse wird angezeigt.</li>
		<li>Kopieren Sie diese Zahl, fügen Sie sie in das Feld Mature Protein Mass ein, und schließen Sie das Fenster Protein Mass Calculator Tool.</li>
	</ol></li>
	<li>Wählen Sie eine N-terminale Signalpeptidlänge aus, indem Sie auf das Feld Rückstandsrestriktion einstellen klicken. Ein Pop-up mit einer gleitenden Skala und einem Cursor wird angezeigt. Bewegen Sie den Cursor auf die gewünschte Signalpeptidlänge (maximal 50). Wenn keine Signalpeptidlänge ausgewählt ist, wird eine uneingeschränkte Sequenzkürzung durch die Software durchgeführt.</li>
	<li>Wählen Sie unter Fragmention Condition in der GUI Reste für die Polypeptid-Backbone-Spaltung (PBC) aus. Klicken Sie auf die Kästchen mit einem oder mehreren Rückständen: D, E, N und/oder P.<ol>
<li>Klicken Sie auf die Schaltfläche Zu durchsuchendes Fragmentionen (+1) eingeben. Eine Popup-Fragmentseite wird angezeigt. Klicken Sie anschließend auf die Schaltfläche Fragmention hinzufügen, die der Anzahl der einzugebenden Fragmentionen entspricht, d.h. einem Klick für jedes Fragmention. Für jedes einzugebende Fragmention erscheint ein Dropdown-Feld.</li>
		<li>Geben Sie die m/z der Fragmentionen und die zugehörige m/z-Toleranz ein. Wenn Sie fertig sind, klicken Sie auf die Schaltfläche Speichern und Schließen. HINWEIS: Eine vernünftige m/z-Toleranz beträgt ±1,5.</li>
		<li>Wählen Sie die Mindestanzahl von Fragmentionen aus, die für eine Identifizierung abgeglichen werden müssen, indem Sie zu der gewünschten Zahl im Feld rechts neben Wie viele Fragmentionen müssen abgeglichen werden. HINWEIS: Drei Übereinstimmungen sollten ausreichend sein.</li>
		<li>Wählen Sie Cysteinreste so aus, dass sie sich in ihrem oxidierten Zustand befinden, indem Sie auf den entsprechenden Kreis klicken. Wenn nach der Suche keine Proteinidentifikationen gefunden werden, wiederholen Sie die Suche mit Cysteinen in ihrem reduzierten Zustand. Wenn nach der Suche keine Identifikationen gefunden werden, erweitern Sie die Fragmentionentoleranz auf ±3 und wiederholen Sie die Suche.</li>
	</ol></li>
	<li>Klicken Sie unter Datei-Setupauf die Schaltfläche FASTA-Datei auswählen, um die FASTA-Datei (Textdatei) mit den In-silico-Proteinsequenzen des zuvor in den Protokollschritten 3.1 bis 3.2 konstruierten Bakterienstamms zu durchsuchen und auszuwählen. Wählen Sie dann einen Ausgabeordner aus und erstellen Sie einen Ausgabedateinamen.</li>
	<li>Klicken Sie auf die Schaltfläche Suche nach Dateieinträgen ausführen. Ein Popup-Fenster mit dem Titel Suchparameter bestätigen (Abbildung 1, unterer Bereich) wird angezeigt, in dem die Suchparameter angezeigt werden, bevor die Suche initiiert wird.</li>
	<li>Wenn die Suchparameter korrekt sind, klicken Sie auf die Schaltfläche Suche starten. Wenn die Suchparameter nicht korrekt sind, klicken Sie auf die Schaltfläche Abbrechen und geben Sie die richtigen Parameter erneut ein. Sobald die Suche initiiert wurde, wird das Parameterfenster geschlossen, und ein neues Popup-Fenster mit einem Fortschrittsbalken wird angezeigt(Abbildung 1,unterer Bereich), das den Fortschritt der Suche und eine laufende Zählung der Anzahl der gefundenen Identifikationen anzeigt.</li>
	<li>Nach Abschluss der Suche (einige Sekunden) wird der Fortschrittsbalken automatisch geschlossen, und eine Zusammenfassung der Suche wird im Feld Protokoll der GUI angezeigt(Abbildung 2,oberes Bedienfeld). Darüber hinaus wird ein neues Popup-Fenster angezeigt, in dem die Proteinidentifikation(en) angezeigt werden, falls vorhanden(Abbildung 2,unterer Bereich). HINWEIS: In-silico-Proteinsequenzen mit nicht erkannten Resten, z. B. U oder X, werden automatisch aus der Analyse übersprungen und diese Sequenzen werden anschließend mit einem separaten Popup-Fenster gemeldet, um den Bediener darüber zu informieren, welche (falls vorhanden) Sequenzen nach Abschluss der Suche übersprungen wurden.</li>
</ol>5. Bestätigung der Proteinsequenz nach der Suche
<ol><li>Bestätigen Sie die Richtigkeit einer Kandidatensequenz durch manuelle Analyse. HINWEIS: Der Zweck der Protein Biomarker Seeker-Software besteht darin, eine Proteinsequenz mit hoher Genauigkeit zu identifizieren, indem viele offensichtlich falsche Proteinsequenzen aus der Betrachtung eliminiert und die Sequenzkürzung als mögliches PTM in das reife Protein aufgenommen wird. Da die Anzahl der möglichen zurückgegebenen Kandidatensequenzen gering ist, ist die manuelle Bestätigung überschaubar.</li>
	<li>Generieren Sie eine Tabelle der durchschnittlichen m/z von b- und y-Typ-Fragmentionen der Kandidatensequenz unter Verwendung einer Massenspektrometrie- oder Proteom-Software mit einer solchen Funktionalität. Vergleichen Sie die durchschnittliche m/z von In-silico-Fragmentionen auf der C-terminalen Seite von D-, E- und N-Resten (und auf der N-terminalen Seite von P-Resten) mit dem m/z prominenter Fragmentionen aus den MS/MS-PSD-Daten. HINWEIS: Die prominentesten MS/MS-PSD-Fragmentionen sollten leicht mit D-, E- und N-assoziierten In-silico-Fragmentionen abgeglichen werden können. Der Fragmentierungsmechanismus des Asparaginsäureeffekts ist jedoch in der Nähe der N- oder C-Termini einer Proteinsequenz weniger effizient36.</li>
</ol>

Die Autoren haben keine Interessenkonflikte.

Überlegungen zum Protokoll Die Hauptstärken des aktuellen Protokolls sind seine Geschwindigkeit, die Einfachheit der Probenvorbereitung und die Verwendung eines Instruments, das relativ einfach zu bedienen, zu trainieren und zu warten ist. Obwohl bottom-up- und top-down-Proteomanalyse mittels Flüssigkeitschromatographie-ESI-HR-MS allgegenwärtig und in vielerlei Hinsicht der Top-down-Analyse durch MALDI-TOF-TOF weit überlegen sind, erfordern sie mehr Zeit, Arbeit und Fachwissen. Die Komplexität von Ins...

Die Analyse und Identifizierung unverdauter Proteine mittels Massenspektrometrie wird als Top-down-Proteomanalyse1,2,3,4bezeichnet. Es ist jetzt eine etablierte Technik, die Elektrospray-Ionisation (ESI)5 und hochauflösende Massenanalysatoren6und ausgeklügelte Dissoziationstechniken verwendet, z. B. Elektronentransferdissoziation (ETD), Elektroneneinfangdissoziation (ECD)7,ultraviolette Photodissoziation (UV-PD)8usw.
Die andere weiche Ionisationstechnik ist die matrixgestützte Laserdesorption / Ionisation (MALDI)9,10,11 ,die für die Top-Down-Analyse weniger umfassend verwendet wurde, zum Teil, weil sie in erster Linie an Time-of-Flight (TOF) Massenanalysatoren gekoppelt ist, die im Vergleich zu anderen Massenanalysatoren eine begrenzte Auflösung haben. Trotz dieser Einschränkungen wurden die Instrumente MALDI-TOF und MALDI-TOF-TOF für die schnelle Top-Down-Analyse von reinen Proteinen und fraktionierten und unfraktionierten Proteinmischungen eingesetzt. Für die Identifizierung reiner Proteine ist der In-Source-Zerfall (ISD) eine besonders nützliche Technik, da sie die massenspektrometrische (MS) Analyse von ISD-Fragmentionen sowie die Tandem-Massenspektrometrie (MS/MS) von Proteinionenfragmenten ermöglicht, die sequenzspezifische Fragmente liefern, oft aus den N- und C-Termini des Zielproteins, analog zur Edman-Sequenzierung12,13 . Ein Nachteil des ISD-Ansatzes besteht darin, dass die Probe wie bei der Edman-Sequenzierung nur ein Protein enthalten darf. Die eine Proteinanforderung ist auf die Notwendigkeit einer eindeutigen Zuordnung von Fragmentionen zu einem Vorläuferion zurückzuführen. Wenn zwei oder mehr Proteine in einer Probe vorhanden sind, kann es schwierig sein, zuzuordnen, welche Fragmentionen zu welchen Vorläuferionen gehören.
Fragmention/Vorläufer-Ionen-Attribution kann mit MALDI-TOF-TOF-MS/MS adressiert werden. Wie bei jedem klassischen MS/MS-Experiment werden Vorläuferionen vor der Fragmentierung massenselektiert/isoliert, und die nachgewiesenen Fragmentionen können einem bestimmten Vorläuferion zugeschrieben werden. Die für diesen Ansatz verfügbaren Dissoziationstechniken beschränken sich jedoch auf primär hochenergetische kollisionsinduzierte Dissoziation (HE-CID)14 oder Post-Source-Zerfall (PSD)15,16. HE-CID und PSD sind am effektivsten bei der Fragmentierung von Peptiden und kleinen Proteinen, und die Sequenzabdeckung kann in einigen Fällen begrenzt sein. Darüber hinaus führt PSD zu einer Polypeptid-Rückgratspaltung (PBC) vor allem auf der C-terminalen Seite von Asparagin- und Glutaminsäureresten durch ein Phänomen, das als Asparaginsäureeffekt bezeichnet wird17,18,19,20.
MALDI-TOF-MS hat auch eine Nischenanwendung bei der taxonomischen Identifizierung von Mikroorganismen gefunden: Bakterien21, Pilze22und Viren23. Zum Beispiel werden MS-Spektren verwendet, um unbekannte Bakterien durch Vergleich mit einer Referenzbibliothek von MS-Spektren bekannter Bakterien unter Verwendung von Mustererkennungsalgorithmen zum Vergleich zu identifizieren. Dieser Ansatz hat sich aufgrund seiner Geschwindigkeit und Einfachheit als sehr erfolgreich erwiesen, obwohl er eine Übernacht-Kultivierung des Isolats erfordert. Die mit diesem Ansatz nachgewiesenen Proteinionen (in der Regel unter 20 kDa) umfassen einen MS-Fingerabdruck, der eine taxonomische Auflösung auf Gattungs- und Artebene und in einigen Fällen auf der Unterart24 und Stammebene25,26ermöglicht. Es besteht jedoch nach wie vor die Notwendigkeit, nicht nur potenziell pathogene Mikroorganismen taxonomisch zu klassifizieren, sondern auch spezifische Virulenzfaktoren, Toxine und Antimikrobielle Resistenzfaktoren (AMR) zu identifizieren. Um dies zu erreichen, wird die Masse von Peptiden, Proteinen oder kleinen Molekülen mittels MS gemessen und anschließend von MS/MS isoliert und fragmentiert.
Pathogene Bakterien tragen oft kreisförmige DNA-Stücke, die Plasmide genannt werden. Plasmide sind zusammen mit Prophagen ein Hauptvektor des horizontalen Gentransfers zwischen Bakterien und sind für die schnelle Ausbreitung von antibiotikaresistenzen und anderen Virulenzfaktoren über Bakterien verantwortlich. Plasmide können auch antibakterielle (AB) Gene tragen, z. B. Colicin und Bakteriacin. Wenn diese Gene exprimiert und die Proteine sezerniert werden, deaktivieren sie die Proteintranslationsmaschinerie benachbarter Bakterien, die die gleiche Umweltnische besetzen27. Diese bakteriziden Enzyme können jedoch auch ein Risiko für den Wirt darstellen, der sie produziert hat. Folglich wird ein Gen vom Wirt mitexprimiert, das spezifisch die Funktion eines AB-Enzyms hemmt und als sein Immunitätsprotein (Im) bezeichnet wird.
DNA-schädigende Antibiotika wie Mitomycin-C und Ciprofloxacin werden häufig verwendet, um die SOS-Reaktion in Shiga-Toxin-produzierenden E. coli (STEC) zu induzieren, deren Shiga-Toxin-Gen(stx) sich in einem im bakteriellen Genom vorhandenen Prophagengenom befindet28. Wir haben zuvor Antibiotika-Induktion, MALDI-TOF-TOF-MS/ MS und Top-Down-Proteomanalyse verwendet, um Stx-Typen und Subtypen zu erkennen und zu identifizieren, die von den STEC-Stämmen29,30,31,32produziert werden. In der vorherigen Arbeit wurde der STEC O113:H21-Stamm RM7788 über Nacht auf Agarmedien kultiviert, die mit Mitomycin-C ergänzt wurden. Anstatt jedoch die erwartete B-Untereinheit von Stx2a bei m/z ~7816 nachzuweisen, wurde bei m/z ~7839 ein anderes Proteinion nachgewiesen und als plasmidkodiertes hypothetisches Protein unbekannter Funktion33identifiziert. In der aktuellen Arbeit identifizierten wir zwei plasmidkodierte AB-Im-Proteine, die von diesem Stamm mittels Antibiotika-Induktion, MALDI-TOF-TOF-MS/MS, und Top-Down-Proteomanalyse mit eigenständiger Software hergestellt wurden, die entwickelt wurde, um in silico Proteinsequenzen zu verarbeiten und zu scannen, die aus der Gesamtgenomsequenzierung (WGS) abgeleitet wurden. Darüber hinaus wurde die Möglichkeit von Post-Translation-Modifikationen (PTM) mit Sequenzkürzung in die Software integriert. Die Immunitätsproteine wurden mit dieser Software aus der gemessenen Masse des reifen Proteinions und sequenzspezifischen Fragmentionen aus PBC, die durch den Asparaginsäureeffekt verursacht und durch MS/MS-PSD nachgewiesen wurden, identifiziert. Schließlich wurde ein Promotor vor den AB/Im-Genen in einem Plasmidgenom identifiziert, der die Expression dieser Gene erklären könnte, wenn dieser Stamm einem DNA-schädigenden Antibiotikum ausgesetzt ist. Teile dieser Arbeit wurden auf dem National American Chemical Society Fall 2020 Virtual Meeting & Expo (August 17-20, 2020)34vorgestellt.

<table><tbody><tr><td>4000 Series Explorer Software</td><td>AB Sciex</td><td>Version 3.5.3</td><td></td></tr><tr><td>4800 Plus MALDI TOF/TOF Analyzer</td><td>AB Sciex</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Acetonitril Optima LC/MS grade</td><td>Fisher Chemical</td><td>A996-1</td><td></td></tr><tr><td>BSL-2 Biohazard Cabinet</td><td>The Baker Company</td><td>SG403A-HE</td><td></td></tr><tr><td>Cytochrom-C</td><td>Sigma</td><td>C2867-10MG</td><td></td></tr><tr><td>Data Explorer Software</td><td>AB Sciex</td><td>Version 4.9</td><td></td></tr><tr><td>Focus Protein Reduction-Alkylation Kit</td><td>G-Biosciences</td><td>786-231</td><td></td></tr><tr><td>GPMAW Software</td><td>Lighthouse Data</td><td>Version 10.0</td><td></td></tr><tr><td>Inkubator</td><td>VWR</td><td>9120973</td><td></td></tr><tr><td>LB Agar</td><td>Invitrogen</td><td>22700-025</td><td></td></tr><tr><td>Luria Bouillon</td><td>Invitrogen</td><td>12795-027</td><td></td></tr><tr><td>Lysozyme</td><td>Sigma</td><td>L4919-1G</td><td></td></tr><tr><td>Mikrozentrifugenröhrchen, 2 mL, Schraubverschluss, O-Ring</td><td>Fisher Scientific</td><td>02-681-343</td><td></td></tr><tr><td>MiniSpin Plus Zentrifuge</td><td>Eppendorf</td><td>22620207</td><td></td></tr><tr><td>Mitomycin-C (aus Streptomyces)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M0440-5MG</td><td></td></tr><tr><td>Myoglobin</td><td>Sigma</td><td>M5696-100MG</td><td></td></tr><tr><td>Schüttler MaxQ 420HP Modell 420</td><td>Thermo Scientific</td><td>Modell 420</td><td></td></tr><tr><td>Sinapinsäure</td><td>Thermo Scientific</td><td>1861580</td><td></td></tr><tr><td>Steril 1 μl Schlaufen</td><td>Fisher Scientific</td><td>22-363-595</td><td></td></tr><tr><td>Thioredoxin (E. coli, rekombinant)</td><td>Sigma</td><td>T0910-1MG</td><td></td></tr><tr><td>Trifluoressigsäure</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>299537-100G</td><td></td></tr><tr><td>Wasser Optima LC/MS-Qualität</td><td>Fisher Chemical</td><td>W6-4</td><td></td></tr></tbody></table>

identifizierung antibakterieller immunitätsproteine in escherichia coli mittels maldi-tof-tof-ms/ms und top-down-proteomanalyse

Identification of Antibacterial Immunity Proteins in Escherichia coli using MALDI-TOF-TOF-MS/MS and Top-Down Proteomic Analysis

Dieses Protokoll identifiziert die Immunitätsproteine der bakteriziden Enzyme: Colicin E3 und Bakteriacin, die von einem pathogenen Escherichia coli-Stamm mittels Antibiotika-Induktion produziert und durch MALDI-TOF-TOF-Tandem-Massenspektrometrie und Top-Down-Proteomanalyse mit selbst entwickelter Software identifiziert wurden. Das Immunitätsprotein von Colicin E3 (Im3) und das Immunitätsprotein von Bakteriacin (Im-Bac) wurden aus prominenten b- und/oder y-Typ-Fragmentionen identifiziert, die durch die Polypeptid-Rückgratspaltung (PBC) auf der C-terminalen Seite von Asparaginsäure, Glutaminsäure und Asparaginresten durch den Asparaginsäure-Effektfragmentierungsmechanismus erzeugt wurden. Die Software scannt schnell in silico Proteinsequenzen, die aus der gesamten Genomsequenzierung des Bakterienstamms stammen. Die Software entfernt auch iterativ Aminosäurereste einer Proteinsequenz für den Fall, dass die reife Proteinsequenz abgeschnitten wird. Eine einzelne Proteinsequenz besaß Massen- und Fragmentionen, die mit denen übereinstimmten, die für jedes Immunitätsprotein nachgewiesen wurden. Die Kandidatensequenz wurde dann manuell inspiziert, um zu bestätigen, dass alle erkannten Fragmentionen zugeordnet werden konnten. Das N-terminale Methionin von Im3 wurde posttranslational entfernt, während Im-Bac die komplette Sequenz hatte. Darüber hinaus fanden wir heraus, dass nur zwei oder drei nicht-komplementäre Fragmentionen, die durch PBC gebildet werden, notwendig sind, um die richtige Proteinsequenz zu identifizieren. Schließlich wurde ein Promotor (SOS-Box) vor den antibakteriellen und Immunitätsgenen in einem Plasmidgenom des Bakterienstamms identifiziert.

Abbildung 3 (oberes Bild) zeigt die MS des STEC O113:H21-Stammes RM7788, der über Nacht auf LBA mit 400 ng/ml Mitomycin-C kultiviert wurde. Peaks bei m/z 7276, 7337 und 7841 wurden zuvor als Kälteschockprotein C (CspC), Kälteschockprotein E (CspE) und ein plasmidgetragenes Protein unbekannter Funktion identifiziert33. Das Proteinion bei m/z 9780 [M+H]+ wurde mittels MS/MS-PSD analysiert, wie in Abbildung 3 (unteres Bild) darges...

Hier stellen wir ein Protokoll zur schnellen Identifizierung von Proteinen vor, die von genomisch sequenzierten pathogenen Bakterien mittels MALDI-TOF-TOF-Tandem-Massenspektrometrie und Top-Down-Proteomanalyse mit eigens entwickelter Software produziert werden. Metastabile Proteinionen fragmentieren aufgrund der Asparaginsäurewirkung und diese Spezifität wird für die Proteinidentifizierung ausgenutzt.

Identifizierung antibakterieller Immunitätsproteine in Escherichia coli mittels MALDI-TOF-TOF-MS/MS und Top-Down-Proteomanalyse

This protocol identifies the immunity proteins of the bactericidal enzymes: colicin E3 and bacteriocin, produced by a pathogenic Escherichia coli strain ...

Das Protokoll demonstriert eine schnelle Methode zur Identifizierung bakterieller Proteine mittels Antibiotika-Induktion und Massenspektrometrie. Der Hauptvorteil der Technik ist ihre Geschwindigkeit und Einfachheit. Die Probenvorbereitung ist unkompliziert.Die Technik kann auf die Charakterisierung von pathogenen Bakterien wie Virulenzfaktoren oder Antibiotikaresistenz ausgeweitet werden, um eine geeignete Behandlung für eine bakterielle Infektion besser zu informieren. Verwenden Sie zunächst eine sterile Ein-Mikroliter-Schleife, um Bakterien aus einzelnen Kolonien zu ernten, die auf LB-Agarplatte angebaut werden. Und übertragen Sie auf ein zwei Milliliter großes O-Ring-Ring-Schraubverschluss-Mikrozentrifugenröhrchen mit 300 Mikrolitern HPLC-Wasser.Dann das Rohr kurz wirbeln und die Zellen durch Zentrifugation mit einem 0,75 Mikroliter langen Reliktwasser des Probenüberstands auf dem Edelstahl-MALDI-Target entwirren und trocknen lassen. Überlagern Sie den getrockneten Probenfleck mit 0,75 Mikrolitern einer gesättigten Lösung von Sinapinsäure, die in 33% Acetonitril, 67% Wasser und 0,2% Trifluoressigsäure hergestellt wurde, und lassen Sie den Spot trocknen. Sobald der Spot getrockn

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Forschung

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Dieses Protokoll ermöglicht eine schnelle und kostengünstige Bewertung der mikrobiellen Zusammensetzung in Milchprodukten durch die Kombination von Kulturwissenschaften mit MALDI-TOF MS. Es liefert Taxonomieergebnisse, die mit der 16S-rRNA-Sequenzierung vergleichbar sind, mit einer kürzeren Durchlaufzeit als herkömmliche Kulturmethoden.

Bewertung der mikrobiellen Sicherheit von Molkereien mittels Bacterial Proteomic Profiling mittels MALDI-Ansatz

Lernen Sie die schnelle Identifizierung antibakterieller Immunitätsproteine in Escherichia coli mittels MALDI-TOF-TOF-MS/MS und Top-Down-Proteomanalyse. Diese Methode ermöglicht effiziente Proteinanalysen.

Identifizierung antibakterieller Immunitätsproteine in Escherichia coli mittels MALDI-TOF-TOF-MS/MS und Top-Down-Proteomanalyse

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