Name: Auswahl von Transporter-gezielten inhibitorischen Nanobodies durch Solid-Supported-Membrane (SSM)-basierte Elektrophysiologie (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-05-03T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 12 s
Description: Erfahren Sie die hochdurchsatzfähige SSM-Elektrophysiologie zur Identifizierung inhibitorischer Nanobodies gegen elektrogene Transporter. Diese markierungsfreie Methode ermöglicht die Bestimmung von IC50-Werten und das Screening großer Nanobody-Bibliotheken.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Wir danken Cedric A. J. Hutter und Markus A. Seeger vom Institut für Medizinische Mikrobiologie der Universität Zürich sowie Gonzalo Cebrero vom Biozentrum der Universität Basel für die Zusammenarbeit bei der Erzeugung synthetischer Nanobodies (Sybodies). Wir danken Maria Barthmes und Andre Bazzone von NANION Technologies für die technische Unterstützung. Unterstützt wurde diese Arbeit vom Schweizerischen Nationalfonds (SNF) (PP00P3_170607 und NANION Research Grant Initiative to C.P.).

<ol><li>Braden, B. C., Goldman, E. R., Mariuzza, R. A., Poljak, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Anatomy+an+antibody+molecule%3A+structure%2C+kinetics%2C+thermodynamics%2C+and+mutational+studies+of+the+antilysozyme+antibody+D1.3%5BTitle%5D)+AND+%22Immunology+Reviews%22%5BJournal%5D)">Anatomy an antibody molecule: structure, kinetics, thermodynamics, and mutational studies of the antilysozyme antibody D1.3.</a> Immunology Reviews. 163, 45-57 (1998).</li>
<li>Hamers-Casterman, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Naturally+occurring+antibodies+devoid+of+light+chains%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Naturally occurring antibodies devoid of light chains.</a> Nature. 363, 446-448 (1993).</li>
<li>Perez, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structural+basis+of+inhibition+of+lipid-linked+oligosaccharide+flippase+PglK+by+a+conformational+nanobody%5BTitle%5D)+AND+%22Science+Reports%22%5BJournal%5D)">Structural basis of inhibition of lipid-linked oligosaccharide flippase PglK by a conformational nanobody.</a> Science Reports. 7, 46641(2017).</li>
<li>Grahl, A., Abiko, L. A., Isogai, S., Sharpe, T., Grzesiek, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+high-resolution+description+of+beta1-adrenergic+receptor+functional+dynamics+and+allosteric+coupling+from+backbone+NMR%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communication%22%5BJournal%5D)">A high-resolution description of beta1-adrenergic receptor functional dynamics and allosteric coupling from backbone NMR.</a> Nature Communication. 11, 2216(2020).</li>
<li>Schenck, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+and+characterization+of+anti-VGLUT+nanobodies+acting+as+inhibitors+of+transport%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Generation and characterization of anti-VGLUT nanobodies acting as inhibitors of transport.</a> Biochemistry. 56, 3962-3971 (2017).</li>
<li>Mireku, S. A., Sauer, M. M., Glockshuber, R., Locher, K. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structural+basis+of+nanobody-mediated+blocking+of+BtuF%2C+the+cognate+substrate-binding+protein+of+the+Escherichia+coli+vitamin+B12+transporter+BtuCD%5BTitle%5D)+AND+%22Science+Reports%22%5BJournal%5D)">Structural basis of nanobody-mediated blocking of BtuF, the cognate substrate-binding protein of the Escherichia coli vitamin B12 transporter BtuCD.</a> Science Reports. 7, 14296(2017).</li>
<li>Manglik, A., Kobilka, B. K., Steyaert, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nanobodies+to+study+G+protein-coupled+receptor+structure+and+function%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Reviews+of+Pharmacology+Toxicology%22%5BJournal%5D)">Nanobodies to study G protein-coupled receptor structure and function.</a> Annual Reviews of Pharmacology Toxicology. 57, 19-37 (2017).</li>
<li>Rasmussen, S. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structure+of+a+nanobody-stabilized+active+state+of+the+beta%282%29+adrenoceptor%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Structure of a nanobody-stabilized active state of the beta(2) adrenoceptor.</a> Nature. 469 (2), 175-180 (2011).</li>
<li>Jiang, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Crystal+structure+of+a+LacY-nanobody+complex+in+a+periplasmic-open+conformation%5BTitle%5D)+AND+%22Proceeding+of+the+National+Academy+of+Science+U.+S.+A%22%5BJournal%5D)">Crystal structure of a LacY-nanobody complex in a periplasmic-open conformation.</a> Proceeding of the National Academy of Science U. S. A. 113, 12420-12425 (2016).</li>
<li>Geertsma, E. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structure+of+a+prokaryotic+fumarate+transporter+reveals+the+architecture+of+the+SLC26+family%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Structural+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Structure of a prokaryotic fumarate transporter reveals the architecture of the SLC26 family.</a> Nature Structural Molecular Biology. 22, 803-808 (2015).</li>
<li>Harmsen, M. M., De Haard, H. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Properties%2C+production%2C+and+applications+of+camelid+single-domain+antibody+fragments%5BTitle%5D)+AND+%22Applied+Microbiology+and+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Properties, production, and applications of camelid single-domain antibody fragments.</a> Applied Microbiology and Biotechnology. 77, 13-22 (2007).</li>
<li>Pardon, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+general+protocol+for+the+generation+of+nanobodies+for+structural+biology%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">A general protocol for the generation of nanobodies for structural biology.</a> Nature Protocols. 9, 674-693 (2014).</li>
<li>Nguyen, V. K., Desmyter, A., Muyldermans, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+heavy-chain+antibodies+in+Camelidae%5BTitle%5D)+AND+%22Advances+in+Immunology%22%5BJournal%5D)">Functional heavy-chain antibodies in Camelidae.</a> Advances in Immunology. 79, 261-296 (2001).</li>
<li>Zimmermann, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synthetic+single+domain+antibodies+for+the+conformational+trapping+of+membrane+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Elife%22%5BJournal%5D)">Synthetic single domain antibodies for the conformational trapping of membrane proteins.</a> Elife. 7, 34317(2018).</li>
<li>McMahon, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Yeast+surface+display+platform+for+rapid+discovery+of+conformationally+selective+nanobodies%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Structural+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Yeast surface display platform for rapid discovery of conformationally selective nanobodies.</a> Nature Structural Molecular Biology. 25, 289-296 (2018).</li>
<li>Olichon, A., de Marco, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preparation+of+a+naive+library+of+camelid+single+domain+antibodies%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Preparation of a naive library of camelid single domain antibodies.</a> Methods in Molecular Biology. 911, 65-78 (2012).</li>
<li>Moutel, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((NaLi-H1%3A+A+universal+synthetic+library+of+humanized+nanobodies+providing+highly+functional+antibodies+and+intrabodies%5BTitle%5D)+AND+%22Elife%22%5BJournal%5D)">NaLi-H1: A universal synthetic library of humanized nanobodies providing highly functional antibodies and intrabodies.</a> Elife. 5, 16228(2016).</li>
<li>Yan, J., Li, G., Hu, Y., Ou, W., Wan, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Construction+of+a+synthetic+phage-displayed+nanobody+library+with+CDR3+regions+randomized+by+trinucleotide+cassettes+for+diagnostic+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Translational+Medicine%22%5BJournal%5D)">Construction of a synthetic phage-displayed nanobody library with CDR3 regions randomized by trinucleotide cassettes for diagnostic applications.</a> Journal of Translational Medicine. 12, 343(2014).</li>
<li>Sabir, J. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Construction+of+naive+camelids+VHH+repertoire+in+phage+display-based+library%5BTitle%5D)+AND+%22Comptes+Rendus+Biologies%22%5BJournal%5D)">Construction of naive camelids VHH repertoire in phage display-based library.</a> Comptes Rendus Biologies. 337, 244-249 (2014).</li>
<li>Yau, K. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Selection+of+hapten-specific+single-domain+antibodies+from+a+non-immunized+llama+ribosome+display+library%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Immunology+Methods%22%5BJournal%5D)">Selection of hapten-specific single-domain antibodies from a non-immunized llama ribosome display library.</a> Journal of Immunology Methods. 281, 161-175 (2003).</li>
<li>vander Linden, R. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+physical+chemical+properties+of+llama+VHH+antibody+fragments+and+mouse+monoclonal+antibodies%5BTitle%5D)+AND+%22Biochimica+et+Biophysica+Acta%22%5BJournal%5D)">Comparison of physical chemical properties of llama VHH antibody fragments and mouse monoclonal antibodies.</a> Biochimica et Biophysica Acta. 1431, 37-46 (1999).</li>
<li>Dumoulin, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-domain+antibody+fragments+with+high+conformational+stability%5BTitle%5D)+AND+%22Protein+Science%22%5BJournal%5D)">Single-domain antibody fragments with high conformational stability.</a> Protein Science. 11, 500-515 (2002).</li>
<li>Iezzi, M. E., Policastro, L., Werbajh, S., Podhajcer, O., Canziani, G. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-domain+antibodies+and+the+promise+of+modular+targeting+in+cancer+imaging+and+treatment%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Immunology%22%5BJournal%5D)">Single-domain antibodies and the promise of modular targeting in cancer imaging and treatment.</a> Frontiers in Immunology. 9, 273(2018).</li>
<li>Yu, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nanobodies+derived+from+camelids+represent+versatile+biomolecules+for+biomedical+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials+Science%22%5BJournal%5D)">Nanobodies derived from camelids represent versatile biomolecules for biomedical applications.</a> Biomaterials Science. 8, 3559-3573 (2020).</li>
<li>Jahnichen, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CXCR4+nanobodies+%28VHH-based+single+variable+domains%29+potently+inhibit+chemotaxis+and+HIV-1+replication+and+mobilize+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Science+U.+S.+A%22%5BJournal%5D)">CXCR4 nanobodies (VHH-based single variable domains) potently inhibit chemotaxis and HIV-1 replication and mobilize stem cells.</a> Proceedings of the National Academy of Science U. S. A. 107, 20565-20570 (2010).</li>
<li>Nguyen, V. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inhibition+of+type+VI+secretion+by+an+anti-TssM+llama+nanobody%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Inhibition of type VI secretion by an anti-TssM llama nanobody.</a> PLoS One. 10, 0122187(2015).</li>
<li>Bazzone, A., Barthmes, M., Fendler, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SSM-Based+Electrophysiology+for+Transporter+Research%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Enzymology%22%5BJournal%5D)">SSM-Based Electrophysiology for Transporter Research.</a> Methods in Enzymology. 594, 31-83 (2017).</li>
<li>Schulz, P., Garcia-Celma, J. J., Fendler, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SSM-based+electrophysiology%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">SSM-based electrophysiology.</a> Methods. 46, 97-103 (2008).</li>
<li>Barthmes, M., Liao, J., Jiang, Y., Bruggemann, A., Wahl-Schott, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electrophysiological+characterization+of+the+archaeal+transporter+NCX_Mj+using+solid+supported+membrane+technology%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+General+Physiology%22%5BJournal%5D)">Electrophysiological characterization of the archaeal transporter NCX_Mj using solid supported membrane technology.</a> Journal of General Physiology. 147, 485-496 (2016).</li>
<li>Watzke, N., Diekert, K., Obrdlik, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electrophysiology+of+respiratory+chain+complexes+and+the+ADP-ATP+exchanger+in+native+mitochondrial+membranes%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Electrophysiology of respiratory chain complexes and the ADP-ATP exchanger in native mitochondrial membranes.</a> Biochemistry. 49, 10308-10318 (2010).</li>
<li>Zuber, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Kinetics+of+charge+translocation+in+the+passive+downhill+uptake+mode+of+the+Na%2B%2FH%2B+antiporter+NhaA+of+Escherichia+coli%5BTitle%5D)+AND+%22Biochim+Biophys+Acta%22%5BJournal%5D)">Kinetics of charge translocation in the passive downhill uptake mode of the Na+/H+ antiporter NhaA of Escherichia coli.</a> Biochim Biophys Acta. 1709, 240-250 (2005).</li>
<li>Garcia-Celma, J. J., Smirnova, I. N., Kaback, H. R., Fendler, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electrophysiological+characterization+of+LacY%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Science+U.+S.+A%22%5BJournal%5D)">Electrophysiological characterization of LacY.</a> Proceedings of the National Academy of Science U. S. A. 106, 7373-7378 (2009).</li>
<li>Bazzone, A., Madej, M. G., Kaback, H. R., Fendler, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((pH+regulation+of+electrogenic+sugar%2FH%2B+symport+in+MFS+sugar+permeases%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">pH regulation of electrogenic sugar/H+ symport in MFS sugar permeases.</a> PLoS One. 11, 0156392(2016).</li>
<li>Williamson, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+two-lane+mechanism+for+selective+biological+ammonium+transport%5BTitle%5D)+AND+%22Elife%22%5BJournal%5D)">A two-lane mechanism for selective biological ammonium transport.</a> Elife. 9, 57183(2020).</li>
<li>Mirandela, G. D., Tamburrino, G., Hoskisson, P. A., Zachariae, U., Javelle, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+lipid+environment+determines+the+activity+of+the+Escherichia+coli+ammonium+transporter+AmtB%5BTitle%5D)+AND+%22FASEB+Journal%22%5BJournal%5D)">The lipid environment determines the activity of the Escherichia coli ammonium transporter AmtB.</a> FASEB Journal. 33, 1989-1999 (2019).</li>
<li>Kaplan, R. S., Pedersen, P. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Determination+of+microgram+quantities+of+protein+in+the+presence+of+milligram+levels+of+lipid+with+amido+black+10B%5BTitle%5D)+AND+%22Annals+of+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Determination of microgram quantities of protein in the presence of milligram levels of lipid with amido black 10B.</a> Annals of Biochemistry. 150, 97-104 (1985).</li>
<li>Kermani, A. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+structural+basis+of+promiscuity+in+small+multidrug+resistance+transporters%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communication%22%5BJournal%5D)">The structural basis of promiscuity in small multidrug resistance transporters.</a> Nature Communication. 11, 6064(2020).</li>
<li>Weitz, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+and+structural+characterization+of+a+prokaryotic+peptide+transporter+with+features+similar+to+mammalian+PEPT1%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Functional and structural characterization of a prokaryotic peptide transporter with features similar to mammalian PEPT1.</a> Journal of Biological Chemistry. 282, 2832-2839 (2007).</li>
</ol>

Die Autoren erklären keine konkurrierenden finanziellen Interessen.

Die hier vorgestellte Technik klassifiziert Nanobodies mit inhibitorischen und nicht-inhibitorischen Eigenschaften, die auf elektrogene Transporter abzielen. Die Beurteilung des Substrattransports ist aufgrund der Detektion der Ladungsbewegung durch den in die Membran von Proteoliposomen eingebetteten Transporter möglich. Einige der kritischen Schritte während des Aufbaus eines Experiments sind die Rekonstitution von aktivem Protein in Liposomen, die Herstellung stabiler Monoschichten auf SSM-Chips und die Wiederherstell...

Antikörper bestehen aus zwei identischen schweren Ketten und zwei leichten Ketten, die für die Antigenbindung verantwortlich sind. Kameliden haben nur schwerkettige Antikörper, die im Vergleich zu herkömmlichen Antikörpern eine ähnliche Affinität für ihr verwandtes Antigen aufweisen1,2. Die Single Variable Domain (VHH) von nur schwerkettigen Antikörpern behält das volle Antigenbindungspotenzial bei und hat sich als sehr stabilerwiesen 1,2. Diese isolierten VHH-Moleküle oder "Nanobodies" wurden in Studien im Zusammenhang mit der Biochemie von Membranproteinen als Werkzeuge zur Stabilisierung der Konformationen3,4, als Inhibitoren5,6, als Stabilisierungsmittel7und als Gadgets zur Strukturbestimmung8,9,10 . Nanobodies können durch die Immunisierung von Kameliden zur Voranreicherung von B-Zellen, die zielspezifische Nanobodies kodieren, und anschließende Isolierung von B-Zellen erzeugt werden, gefolgt von Klonierung der Nanobody-Bibliothek und Selektion durch Phagenanzeige11,12,13. Eine alternative Möglichkeit, Nanobodies zu erzeugen, basiert auf In-vitro-Selektionsmethoden, die auf dem Aufbau von Bibliotheken und der Selektion durch Phagenanzeige, Ribosomenanzeige oder Hefeanzeigeberuhen 14,15,16,17,18,19,20. Diese In-vitro-Methoden erfordern große Bibliotheksgrößen, profitieren jedoch von der Vermeidung von Tierimmunisierungen und bevorzugen die Auswahl von Nanobodies, die auf Proteine mit relativ geringer Stabilität abzielen.
Die geringe Größe von Nanobodies, ihre hohe Stabilität und Löslichkeit, starke Antigenaffinität, geringe Immunogenität und relativ einfache Herstellung machen sie zu starken Kandidaten für die Entwicklung vonTherapeutika 21,22,23. Insbesondere Nanobodies, die die Aktivität mehrerer Membranproteine hemmen, sind potenzielle Vorteile für klinische Anwendungen5,24,25,26. Im Falle von Membrantransportern ist es notwendig, um zu beurteilen, ob ein Nanobody eine hemmende Aktivität aufweist, einen Assay zu entwickeln, der den Nachweis von transportierten Substraten und/oder Co-Substraten ermöglicht. Solche Assays beinhalten in der Regel markierte Moleküle oder das Design substratspezifischer Nachweismethoden, denen möglicherweise eine universelle Anwendung fehlt. Darüber hinaus erfordert die Identifizierung von inhibitorischen Nanobodies in der Regel das Screening einer großen Anzahl von Bindemitteln. Daher ist ein Verfahren, das in einem Hochdurchsatzmodus eingesetzt werden kann und nicht auf markierte Substrate angewiesen ist, für diese Auswahl unerlässlich.
SSM-basierte Elektrophysiologie ist eine extrem empfindliche, hochgradig zeitaufgelöste Technik, die die Detektion der Bewegung von Ladungen über Membranen (z.B. Ionenbindung/-transport) ermöglicht27,28. Diese Technik wurde angewendet, um elektrogene Transporter zu charakterisieren, die aufgrund des relativ geringen Umsatzes dieser Proteine29, 30 , 31,32,33,34,35mit anderen elektrophysiologischen Techniken schwer zu untersuchen sind. Die SSM-Elektrophysiologie erfordert keine Verwendung von markierten Substraten, sie eignet sich für das Hochdurchsatz-Screening und es können entweder Proteoliposomen oder Membranvesikel verwendet werden, die den transporter von Interesse enthalten. Hier zeigen wir, dass SSM-basierte Elektrophysiologie verwendet werden kann, um Transporter-gerichtete Nanobodies mit inhibitorischen und nicht-inhibitorischen Eigenschaften zu klassifizieren. Als Proof-of-Principle beschreiben wir die Rekonstitution eines bakteriellen Cholintransporters in Liposomen, gefolgt von detaillierten Schritten zur Immobilisierung von Proteoliposomen auf den SSM-Sensoren. Als nächstes beschreiben wir, wie SSM-basierte elektrophysiologische Messungen des Cholintransports durchzuführen sind und wie die halbmaximale effektive Konzentration (EC50)bestimmt wird. Wir zeigen dann, wie man SSM-basierte Elektrophysiologie verwendet, um mehrere Nanobodies zu screenen und Inhibitoren des Cholintransports zu identifizieren. Schließlich beschreiben wir, wie die halbmaxim maximalen Hemmkonzentrationen (IC50)ausgewählter inhibitorischer Nanokörper bestimmt werden können.

<table><tbody><tr><td>1-Octadecanthiol-Lösung</td><td>Sigma Aldrich</td><td>O1858-25ML</td><td></td></tr><tr><td>1,2-Diphytanoyl-sn-glycero-3-phosphocholin</td><td>Avanti Polare Lipide</td><td>850356C-25mg</td><td></td></tr><tr><td>Bio-Beads SM-2 Adsorptionsmittel (Polystyrol-Adsorptionskügelchen)</td><td>BioRad</td><td>#152-3920</td><td></td></tr><tr><td>PD 10 Entsalzungssäulen</td><td>GE Healthcare</td><td>GE17-0851-01</td><td></td></tr><tr><td>Filter 200 nm Membran</td><td>Whatman Nucleopore</td><td>WHA800282</td><td></td></tr><tr><td>2-Propanol</td><td>Merck</td><td>33539-1L-R</td><td></td></tr><tr><td>n-Decan</td><td>Sigma Aldrich</td><td>8034051000</td><td></td></tr><tr><td>n-Dodecyl-&szlig;-D-Maltosid (DDM)</td><td>Avanti Polare Lipide</td><td>850520P-25g</td><td></td></tr><tr><td>Natriumchlorid</td><td>AppliChem</td><td>131659.1211</td><td></td></tr> <tr><td>(SSM-Aufbau) SURFE2R N1</td><td>Nanion</td><td>----- </td><td></td></tr><tr><td>SURFE2R N1 Single Sensor Chips</td><td>Nanion</td><td># 161001</td><td></td></tr><tr><td>Trizma Base</td><td>Sigma Aldrich</td><td>T1503</td><td></td></tr><tr><td>E. coli Polar Lipid Extrakt</td><td>Avanti Polar Lipids</td><td>100600C</td><td></td></tr><tr><td>Ei PC L-&alpha;-phosphatidylcholin </td><td>Avanti Polar Lipids</td><td>840051C</td><td></td></tr></tbody></table>

auswahl von transporter-gezielten inhibitorischen nanobodies durch solid-supported-membrane (ssm)-basierte elektrophysiologie

Selection of Transporter-Targeted Inhibitory Nanobodies by Solid-Supported-Membrane (SSM)-Based Electrophysiology

Single-Domain-Antikörper (Nanobodies) wurden in großem Umfang in mechanistischen und strukturellen Studien von Proteinen eingesetzt und stellen ein enormes Potenzial als Werkzeuge für die Entwicklung klinischer Therapien dar, von denen viele von der Hemmung von Membranproteinen wie Transportern abhängen. Die meisten Methoden zur Bestimmung der Hemmung der Transportaktivität sind jedoch in Hochdurchsatzroutinen schwer durchzuführen und hängen von der Verfügbarkeit markierter Substrate ab, wodurch das Screening großer Nanobody-Bibliotheken erschwert wird. Die SSM-Elektrophysiologie (Solid-Supported Membrane) ist eine Hochdurchsatzmethode, die zur Charakterisierung elektrogener Transporter und zur Messung ihrer Transportkinetik und -hemmung verwendet wird. Hier zeigen wir die Implementierung der SSM-basierten Elektrophysiologie zur Auswahl hemmender und nicht-inhibitorischer Nanokörper, die auf einen elektrogenen Sekundärtransporter abzielen, und zur Berechnung von Nanobodies-Hemmkonstanten. Diese Technik kann besonders nützlich sein, um inhibitorische Nanobodies auszuwählen, die auf Transporter abzielen, für die keine markierten Substrate verfügbar sind.

Die SSM-basierte Elektrophysiologie wurde in großem Umfang zur Charakterisierung von elektrogenen Transportern eingesetzt. In dem hier vorgestellten Protokoll zeigen wir, wie nanobodies, die auf einen sekundären Transporter (hier ein bakterieller Cholin-Symporter) abzielen, anhand ihrer inhibitorischen und nicht-inhibitorischen Eigenschaften mit SSM-basierter Elektrophysiologie klassifiziert werden können. Eine der nützlichsten Eigenschaften dieser Technik ist, dass sie das Hochdurchsatz-Screening mehrerer Pufferbedingun...

Nanobodies sind wichtige Werkzeuge in der Strukturbiologie und stellen ein großes Potenzial für die Entwicklung von Therapien dar. Die Auswahl von Nanobodies mit hemmenden Eigenschaften kann jedoch eine Herausforderung darstellen. Hier demonstrieren wir den Einsatz von Solid-Supported-Membrane (SSM)-basierter Elektrophysiologie zur Klassifizierung von inhibitorischen und nicht-inhibitorischen Nanobodies, die auf elektrogene Membrantransporter abzielen.

Auswahl von Transporter-gezielten inhibitorischen Nanobodies durch Solid-Supported-Membrane (SSM)-basierte Elektrophysiologie

Single domain antibodies (nanobodies) have been extensively used in mechanistic and structural studies of proteins and they pose an enormous potential as ...

Das vorgestellte Protokoll wird für das Hochdurchsatz-Screening und die Identifizierung von inhibitorischen und nicht-inhibitorischen Nanobodies verwendet, die auf elektrogene Transporter abzielen, die in Proteoliposomen rekonstituiert oder in Membranvesikeln vorhanden sind. Das Entwerfen von Transferassays kann in mehreren Fällen schwierig sein, insbesondere wenn markierte Substrate nicht verfügbar sind. Wenn die gleiche Elektrophysiologie es erlaubt, die Wirkung von Nanobodies auf den Transport für praktisch jeden elektrogenen Transporter zu untersuchen, da die SSM-Elektrophysiologie keine markierten Substrate benötigt.Nanobodies wurden auf ihren Einsatz in medizinischen Anwendungen untersucht. Diese Technik kann helfen, potenzielle Inhibitoren zu screenen, die auf bestimmte elektrogene Transporter von Menschen oder menschlichen Krankheitserregern abzielen. Nehmen Sie zunächst 10 saubere Röhrchen und übertragen Sie 10 Milliliter des nicht aktiven SSM-Puffers (Solid-Supported Membrane) in jedes Rohr.Um die aktivierenden SSM-Puffer vorzubereiten, geben Sie das Substrat in die Röhrchen unter Verwendung einer Reihe von Konzentrationen um die erwartete halbe maximale Konzentration. Starten Sie die SSM-Software, und lassen Sie den Computer automatisch initialisieren. Legen Sie den Speicherpfad für Daten fest.Bestätigen Sie mit einem Klick auf die Schaltfläche OK. Wählen Sie in den Workflow-Optionen das Standardmäßige Initial Cleaning-Protokoll aus und klicken Sie auf Ausführen. Als nächstes montieren Sie den proteoliposombeschichteten Chip auf dem Sockel.Bewegen Sie den Arm, um den Chip zu verriegeln. Schließen Sie den montierten Chip mit der Kappe ein. Wählen Sie das Programm CapCom im Workflow aus und lassen Sie es laufen, um die Leitfähigkeit und Kapazität zu bestimmen.Bestätigen Sie, dass die Leitfähigkeit unter fünf Nanosiemens liegt und die Kapazität zwischen 15 und 35 Nanofarad liegt, bevor Sie sie für die Messung verwenden. Übertragen Sie die aktivierenden Lösungen in Fläschchen und positionieren Sie die Puffer im Probenehmer. Übertragen Sie den nicht aktiven Puffer in ein Reservoir und platzieren Sie ihn neben dem Chiphalter an der Reservoirposition rechts.Erstellen Sie ein Protokoll für den Workflow mit einer Sequenz von nicht aktivierenden, aktivierenden und nicht aktivierenden Lösungssequenzen oder einer BAB-Sequenz in einer Schleife, die drei Messungen durchführt und zum nächsten aktivierenden Puffer für alle 10 Puffer wechselt. Verwenden Sie die Standard-Durchflussrate von 200 Mikrolitern pro Sekunde mit einer Sekunde, einer Sekunde, einer Sekunde Durchflusszeiten für die BAB-Sequenz und klicken Sie auf Wiedergabe, um die Messung zu starten. Speichern Sie das Protokoll und lassen Sie den Workflow laufen, indem Sie auf die Wiedergabeschaltfläche klicken.Führen Sie dann das gleiche Experiment mit proteinfreien Liposomen durch. Verwenden Sie eine beliebige Software für die Datenanalyse, um den gemessenen Strom im Verhältnis zur Zeit darzustellen, und verwenden Sie die Funktion zur Peakhöhenschätzung im Bereich der Hinzufügung des aktivierenden Puffers. Zeichnen Sie den Spitzenstrom gegen die Substratkonzentration auf, um den halben maximalen Effekt der Konzentration oder EC50 des Substrats durch nichtlineare Regression zu bestimmen.50 Milliliter des nicht aktiven SSM-Puffers in ein sauberes Rohr geben. Geben Sie das Substrat Cholin auf eine Endkonzentration von fünf Millimolaren und verwenden Sie dies für eine positiv kontrollierbare Messung. Übertragen Sie 10 Milliliter des nicht aktivierenden SSM-Puffers in ein sauberes Rohr.Substratcholin zu fünf Millimolaren und Nanobody zu einer Endkonzentration von 500 Nanomolaren hinzufügen. Wiederholen Sie den Schritt für jeden Nanobody, um die aktivierenden Lösungen wie demonstriert vorzubereiten. Starten Sie die SSM-Maschine und messen Sie die Kapazität und Leitfähigkeit des proteoliposombeschichteten Chips, wie zuvor gezeigt.Übertragen Sie die aktivierende Lösung ohne Nanobody in eine Durchstechflasche und legen Sie den Puffer in den Probenehmer. Übertragen Sie den nicht aktiven Puffer ohne Nanobody in ein Reservoir und positionieren Sie ihn im Probenehmer. Wiederholen Sie diesen Vorgang dann für alle Lösungen, die Nanobodies mit aktivierender und nichtaktivierender Lösung enthalten.Erstellen Sie ein Protokoll für den Workflow Mithilfe einer BAB-Sequenz. Erstellen Sie eine Schleife, die drei Messungen der BAB-Sequenz mit Puffern ohne Nanobodies, zwei Messungen der BAB-Sequenz mit Puffern, die einen Nanobody enthalten, eine 120-Sekunden-Verzögerungszeit-Inkubation mit dem Nanobody und drei Messungen der BAB-Sequenz mit Puffern, die den Nanobody enthalten, durchführt. Speichern Sie den Workflow und lassen Sie ihn ausführen, indem Sie auf die Wiedergabeschaltfläche klicken.Als nächstes erstellen Sie ein neues Protokoll für den Workflow mit einer BAB-Sequenz und einer Schleife von fünf Messungen, um den reversibel gebundenen Nanokörper auszuwaschen. Speichern Sie den Workflow und lassen Sie ihn ausführen, indem Sie auf die Wiedergabeschaltfläche klicken. Vergleichen Sie den letzten Spitzenstrom der Messungen mit der anfänglichen Substratmessung.Erreicht der Spitzenstrom den Ausgangswert, wurde der Nanobody erfolgreich ausgewaschen und die Ausgangsbedingungen wieder hergestellt. Andernfalls wiederholen Sie den Workflow oder wechseln Sie zu einem neuen Chip. Wiederholen Sie diesen Vorgang mit einzelnen Chips für jeden Nanobody-Bildschirm oder wiederholen Sie ihn mit mehreren Nanobodies mit demselben Chip.Verwenden Sie eine beliebige Software für die Datenanalyse, um den gemessenen Strom im Vergleich zur Zeit darzustellen. Dann wählt die Software automatisch die Funktion zur Peakhöhenschätzung im Bereich des Hinzufügens des Aktivierungspuffers aus. Normalisieren Sie den Spitzenstrom und das Vorhandensein des Nanobodys basierend auf der anschließenden reinen Substratmessung.Zeichnen Sie die Spitzenströme im Histogramm auf und vergleichen Sie die Spitzenströme der reinen Substratmessungen mit den Spitzenströmen, die in Gegenwart von Nanobodies gemessen werden, um inhibitorische Nanobodies zu identifizieren. 50 Milliliter des nicht aktiven SSM-Puffers in ein sauberes Röhrchen geben und das Substratcholin auf eine Endkonzentration von fünf Millimolar geben und als aktivierende Lösung für die Positivkontrolle verwenden. Fügen Sie fünf Milliliter der nicht aktiven Lösung zu acht sauberen Röhrchen hinzu und geben Sie dann Substratcholin und inhibitorischen Nanobody in Konzentrationen im erwarteten IC50-Bereich in die Röhrchen.10 Milliliter der nicht aktiven Lösung in die acht Röhrchen geben und jedem Röhrchen, das dem Nichtaktivierungspuffer entspricht, inhibitorischen Nanobody hinzufügen. Starten Sie den SSM-Aufbau und messen Sie die Kapazität und Leitfähigkeit des proteoliposomenbeschichteten Chips. Die aktivierende Lösung ohne Nanobody in eine Durchstechflasche überführen und in den Probenehmer geben.Übertragen Sie dann den nicht aktiven Puffer ohne Nanobody in ein Reservoir und positionieren Sie ihn an der Reservoirposition neben dem Chiphalter auf der rechten Seite. Übertragen Sie die aktivierenden und nichtaktivierenden Lösungen, die Nanobodies enthalten, in Fläschchen und positionieren Sie die Puffer im Probenehmer. Erstellen Sie ein Protokoll für den Workflow mithilfe einer BAB-Sequenz.Fügen Sie eine Schleife hinzu, um jede Konzentration zweimal zu messen, 120 Sekunden lang zu inkubieren und drei weitere Male zu messen. Verwenden Sie eine beliebige Software für die Datenanalyse, um den gemessenen Strom im Verhältnis zur Zeit darzustellen, und wählen Sie die Funktion für die Peakhöhenschätzung im Bereich der Hinzufügung des Aktivierungspuffers aus. Zeichnen Sie die Spitzenströme gegen die Nanobody-Konzentration auf, um den IC50 über nichtlineare Regression zu bestimmen.Zur Bestimmung der Substratkonzentration, die bei einem Screening von Nanobodies verwendet werden soll, wurde der elektrogene Transport unter verschiedenen Substratkonzentrationen gemessen, um EC50 zu bestimmen. Eine Substratkonzentration, die den Sättigungsbedingungen entspricht, fünf Millimolar, wurde ausgewählt und in allen aktivierenden Puffern konstant gehalten. Die Wirkung von inhibitorischen Nanobodies auf den elektrogenen Transport wurde anhand der Abnahme der Amplituden der Spitzenströme visualisiert.Nach dem Ausführen des Waschprotokolls, um die Entbinderung des Nanokörpers zu ermöglichen, wurde eine Erholung von 80 bis 95% der anfänglichen Spitzenstromamplitude beobachtet. Beim Wechsel von nicht aktiven zu aktivierenden Bedingungen wurden keine signifikanten Artefaktströme durch Nanobodies in diesen Puffern eingeführt. Nach der Auswahl von Nanobodies mit hemmenden Eigenschaften wurden die IC50-Werte für einzelne Nanobodies bestimmt.Entscheidend ist, genügend Zeit für die Kalibrierung der Proteoliposomen auf dem Chip mit dem Puffer, der den Nanobody enthält, einzuplanen. Da die Bindung reversibel ist, muss der Nanobody sowohl in aktivierenden als auch in nicht aktivierenden Puffern vorhanden sein.

selection-transporter-targeted-inhibitory-nanobodies-solid-supported

Research

Forschung

JoVE Journal

Biochemistry

Biochemie

Hier präsentieren wir Ihnen eine elektrophysiologische Verfahren auf festen unterstützt Membranen mit Fokus auf ihre Anwendungen für die Charakterisierung von elektrogenen Membrantransportern basiert.

Einführung in die Festkörperphysik Unterstützte Membrane Basierend Elektrophysiologie

Viele therapeutische Anwendungen erfordern sicheren und effizienten Transport von Arzneistoffträger und ihre Ladungen über zelluläre Barrieren im Körper. Dieser Artikel beschreibt eine Anpassung der etablierten Verfahren, um die Geschwindigkeit und der Mechanismus der Medikamententransport Nanoträger (NCS) über zelluläre Barrieren, wie der gastrointestinalen (GI) Epithel auszuwerten.

Modelle und Methoden zum Transport von Drug Delivery Systems über zelluläre Barrieren Bewerten

Der erste Teil dieses Artikels zeigt, wie mutierte Zelllinien ausgewählt werden, die vesikuläre Na+/H+-Austauscher an ihrer Plasmamembran exprimieren. Der zweite Teil enthält Protokolle, die auf intrazellulären pH-Messungen und schneller Ionenaufnahme basieren und zur Bestimmung der Ionenselektivität und der kinetischen Parameter dieser Austauscher verwendet werden.

Funktionelle Charakterisierung von Na<sup&gt; +</sup&gt; / H<sup&gt; +</sup&gt; Wärmetauscher von intrazellulären Kompartimente Mit Proton-Tötung Selection man sie an der Plasmamembran Express

Das vorgestellte Protokoll beschreibt die Analyse des Membranprotein-vermittelten Transports auf Einzeltransporterebene unter Verwendung von porenübergreifenden, lösungsmittelfreien Lipiddoppelschichten. Dies wird durch die Herstellung von in großen Mengen hergestellten Nanoporen-Array-Chips in Kombination mit einer hochparallelen Datenerfassung und -analyse erreicht, die die zukünftige Etablierung von Membranprotein-Effektor-Screenings ermöglicht.

Membrantransportprozesse durch eine hochparallele Nanopore Chip-System bei Einzel Protein Resolution Analysierte

Dieses Manuskript beschreibt die Anwendungen der Proton-selektive Elektroden und Patch Methoden spannen, die Aktivität der Proton Transportsysteme zu messen. Diese Methoden überwinden einige Einschränkungen von Techniken, Proton Transportaktivität, z. B. mäßige Empfindlichkeit, Zeitauflösung und unzureichende intrazellulären Milieu Kontrolle zu studieren.

Anwendung der Elektrophysiologie Messung die Aktivität von Electro-neutralen Transporter zu studieren

Retrograder Transport von Proteinen von der Zelloberfläche an die Golgi unbedingt Membran Homöostase. Hier beschreiben wir eine Methode um biochemisch Zelle Oberfläche-Golgi Transport von rekombinanten Proteinen mit funktionalisierten Nanobodies in HeLa-Zellen zu analysieren.

Analyse der Endocytic Aufnahme und retrograder Transport mit funktionalisierten Nanobodies in kultivierten Zellen mit dem Trans-Golgi-Netzwerk

Wir beschreiben eine Methode zur Herstellung der einzelnen frisch isolierten Detrusor glatten Muskelzellen aus menschlichen Harnblasenproben mit einem zweistufigen enzymatischen Verfahren. Die erhaltenen lebensfähigen DSM-Zellen können mit verschiedenen Einzelzelltechniken untersucht werden, einschließlich der beschriebenen Amphotericin-B-Patch-Clamp-Elektrophysiologie, um physiologische und pharmakologische Eigenschaften aufzudecken.

Vorbereitung und Nutzung von frisch isolierten menschlichen Detrusor glatte Muskelzellen für die Charakterisierung von 9-Phenanthrol-Sensitive KationStröme

Wir beschreiben ein Verfahren zur Charakterisierung von protonengetriebenen Membrantransportern in Membranvesikelpräparaten, die durch heterologe Expression in E. coli und Lyse von Zellen mit einer französischen Presse hergestellt werden.

Charakterisierung von Membrantransportern durch heterologen Ausdruck in E. coli und Herstellung von Membranvesikeln

Hier wird ein Protokoll zur Bestimmung des oligomeren Zustands von Membranproteinen vorgestellt, das ein natives Zellmembran-Nanopartikelsystem in Verbindung mit der Elektronenmikroskopie nutzt.

Native Cell Membrane Nanoparticles System für Membran-Protein-Protein-Interaktionsanalyse

Der endozytäre und retrograde Transport von Proteinen von der Plasmamembran zum trans-Golgi-Netzwerk ist essentiell für die Aufrechterhaltung der Membranhomöostase und die Regulierung der Signalübertragung. In dieser Arbeit beschreiben wir eine Methode zur Abbildung und Quantifizierung des endozytären Transports von Transmembran-Frachtproteinen mittels Lebendzellmikroskopie unter Verwendung derivatisierter Anti-GFP-Nanobodies in HeLa-Zellen.

Lebendzell-Bildgebung des endozytären Transports mit funktionalisierten Nanobodies in kultivierten Zellen

Dieses Protokoll beschreibt die Single-Antibody-Markierung (SAL), um die nanoskalige räumliche Organisation von Plasmamembranproteinen zu klären. Durch die Nutzung kumulativer Antikörper-Epitope-Interaktionen auf Einzelmolekülebene kartiert Membran-SAL (mSAL) lokale Epitope-Verteilungen und erfasst gleichzeitig das Antikörperbindungsverhalten in der nativen zellulären Umgebung.

Einzelmolekül-Lokalisationsmikroskopie von Membranproteinen mittels Einzel-Antikörper-Markierung

Erfahren Sie die hochdurchsatzfähige SSM-Elektrophysiologie zur Identifizierung inhibitorischer Nanobodies gegen elektrogene Transporter. Diese markierungsfreie Methode ermöglicht die Bestimmung von IC50-Werten und das Screening großer Nanobody-Bibliotheken.

Auswahl von Transporter-gezielten inhibitorischen Nanobodies durch Solid-Supported-Membrane (SSM)-basierte Elektrophysiologie

Weitere Videos entdecken