Auswahl von Transporter-gezielten inhibitorischen Nanobodies durch Solid-Supported-Membrane (SSM)-basierte Elektrophysiologie

Das vorgestellte Protokoll wird für das Hochdurchsatz-Screening und die Identifizierung von inhibitorischen und nicht-inhibitorischen Nanobodies verwendet, die auf elektrogene Transporter abzielen, die in Proteoliposomen rekonstituiert oder in Membranvesikeln vorhanden sind. Das Entwerfen von Transferassays kann in mehreren Fällen schwierig sein, insbesondere wenn markierte Substrate nicht verfügbar sind. Wenn die gleiche Elektrophysiologie es erlaubt, die Wirkung von Nanobodies auf den Transport für praktisch jeden elektrogenen Transporter zu untersuchen, da die SSM-Elektrophysiologie keine markierten Substrate benötigt.

Nanobodies wurden auf ihren Einsatz in medizinischen Anwendungen untersucht. Diese Technik kann helfen, potenzielle Inhibitoren zu screenen, die auf bestimmte elektrogene Transporter von Menschen oder menschlichen Krankheitserregern abzielen. Nehmen Sie zunächst 10 saubere Röhrchen und übertragen Sie 10 Milliliter des nicht aktiven SSM-Puffers (Solid-Supported Membrane) in jedes Rohr.

Um die aktivierenden SSM-Puffer vorzubereiten, geben Sie das Substrat in die Röhrchen unter Verwendung einer Reihe von Konzentrationen um die erwartete halbe maximale Konzentration. Starten Sie die SSM-Software, und lassen Sie den Computer automatisch initialisieren. Legen Sie den Speicherpfad für Daten fest.

Bestätigen Sie mit einem Klick auf die Schaltfläche OK. Wählen Sie in den Workflow-Optionen das Standardmäßige Initial Cleaning-Protokoll aus und klicken Sie auf Ausführen. Als nächstes montieren Sie den proteoliposombeschichteten Chip auf dem Sockel.

Bewegen Sie den Arm, um den Chip zu verriegeln. Schließen Sie den montierten Chip mit der Kappe ein. Wählen Sie das Programm CapCom im Workflow aus und lassen Sie es laufen, um die Leitfähigkeit und Kapazität zu bestimmen.

Bestätigen Sie, dass die Leitfähigkeit unter fünf Nanosiemens liegt und die Kapazität zwischen 15 und 35 Nanofarad liegt, bevor Sie sie für die Messung verwenden. Übertragen Sie die aktivierenden Lösungen in Fläschchen und positionieren Sie die Puffer im Probenehmer. Übertragen Sie den nicht aktiven Puffer in ein Reservoir und platzieren Sie ihn neben dem Chiphalter an der Reservoirposition rechts.

Erstellen Sie ein Protokoll für den Workflow mit einer Sequenz von nicht aktivierenden, aktivierenden und nicht aktivierenden Lösungssequenzen oder einer BAB-Sequenz in einer Schleife, die drei Messungen durchführt und zum nächsten aktivierenden Puffer für alle 10 Puffer wechselt. Verwenden Sie die Standard-Durchflussrate von 200 Mikrolitern pro Sekunde mit einer Sekunde, einer Sekunde, einer Sekunde Durchflusszeiten für die BAB-Sequenz und klicken Sie auf Wiedergabe, um die Messung zu starten. Speichern Sie das Protokoll und lassen Sie den Workflow laufen, indem Sie auf die Wiedergabeschaltfläche klicken.

Führen Sie dann das gleiche Experiment mit proteinfreien Liposomen durch. Verwenden Sie eine beliebige Software für die Datenanalyse, um den gemessenen Strom im Verhältnis zur Zeit darzustellen, und verwenden Sie die Funktion zur Peakhöhenschätzung im Bereich der Hinzufügung des aktivierenden Puffers. Zeichnen Sie den Spitzenstrom gegen die Substratkonzentration auf, um den halben maximalen Effekt der Konzentration oder EC50 des Substrats durch nichtlineare Regression zu bestimmen.

50 Milliliter des nicht aktiven SSM-Puffers in ein sauberes Rohr geben. Geben Sie das Substrat Cholin auf eine Endkonzentration von fünf Millimolaren und verwenden Sie dies für eine positiv kontrollierbare Messung. Übertragen Sie 10 Milliliter des nicht aktivierenden SSM-Puffers in ein sauberes Rohr.

Substratcholin zu fünf Millimolaren und Nanobody zu einer Endkonzentration von 500 Nanomolaren hinzufügen. Wiederholen Sie den Schritt für jeden Nanobody, um die aktivierenden Lösungen wie demonstriert vorzubereiten. Starten Sie die SSM-Maschine und messen Sie die Kapazität und Leitfähigkeit des proteoliposombeschichteten Chips, wie zuvor gezeigt.

Übertragen Sie die aktivierende Lösung ohne Nanobody in eine Durchstechflasche und legen Sie den Puffer in den Probenehmer. Übertragen Sie den nicht aktiven Puffer ohne Nanobody in ein Reservoir und positionieren Sie ihn im Probenehmer. Wiederholen Sie diesen Vorgang dann für alle Lösungen, die Nanobodies mit aktivierender und nichtaktivierender Lösung enthalten.

Erstellen Sie ein Protokoll für den Workflow Mithilfe einer BAB-Sequenz. Erstellen Sie eine Schleife, die drei Messungen der BAB-Sequenz mit Puffern ohne Nanobodies, zwei Messungen der BAB-Sequenz mit Puffern, die einen Nanobody enthalten, eine 120-Sekunden-Verzögerungszeit-Inkubation mit dem Nanobody und drei Messungen der BAB-Sequenz mit Puffern, die den Nanobody enthalten, durchführt. Speichern Sie den Workflow und lassen Sie ihn ausführen, indem Sie auf die Wiedergabeschaltfläche klicken.

Als nächstes erstellen Sie ein neues Protokoll für den Workflow mit einer BAB-Sequenz und einer Schleife von fünf Messungen, um den reversibel gebundenen Nanokörper auszuwaschen. Speichern Sie den Workflow und lassen Sie ihn ausführen, indem Sie auf die Wiedergabeschaltfläche klicken. Vergleichen Sie den letzten Spitzenstrom der Messungen mit der anfänglichen Substratmessung.

Erreicht der Spitzenstrom den Ausgangswert, wurde der Nanobody erfolgreich ausgewaschen und die Ausgangsbedingungen wieder hergestellt. Andernfalls wiederholen Sie den Workflow oder wechseln Sie zu einem neuen Chip. Wiederholen Sie diesen Vorgang mit einzelnen Chips für jeden Nanobody-Bildschirm oder wiederholen Sie ihn mit mehreren Nanobodies mit demselben Chip.

Verwenden Sie eine beliebige Software für die Datenanalyse, um den gemessenen Strom im Vergleich zur Zeit darzustellen. Dann wählt die Software automatisch die Funktion zur Peakhöhenschätzung im Bereich des Hinzufügens des Aktivierungspuffers aus. Normalisieren Sie den Spitzenstrom und das Vorhandensein des Nanobodys basierend auf der anschließenden reinen Substratmessung.

Zeichnen Sie die Spitzenströme im Histogramm auf und vergleichen Sie die Spitzenströme der reinen Substratmessungen mit den Spitzenströmen, die in Gegenwart von Nanobodies gemessen werden, um inhibitorische Nanobodies zu identifizieren. 50 Milliliter des nicht aktiven SSM-Puffers in ein sauberes Röhrchen geben und das Substratcholin auf eine Endkonzentration von fünf Millimolar geben und als aktivierende Lösung für die Positivkontrolle verwenden. Fügen Sie fünf Milliliter der nicht aktiven Lösung zu acht sauberen Röhrchen hinzu und geben Sie dann Substratcholin und inhibitorischen Nanobody in Konzentrationen im erwarteten IC50-Bereich in die Röhrchen.

10 Milliliter der nicht aktiven Lösung in die acht Röhrchen geben und jedem Röhrchen, das dem Nichtaktivierungspuffer entspricht, inhibitorischen Nanobody hinzufügen. Starten Sie den SSM-Aufbau und messen Sie die Kapazität und Leitfähigkeit des proteoliposomenbeschichteten Chips. Die aktivierende Lösung ohne Nanobody in eine Durchstechflasche überführen und in den Probenehmer geben.

Übertragen Sie dann den nicht aktiven Puffer ohne Nanobody in ein Reservoir und positionieren Sie ihn an der Reservoirposition neben dem Chiphalter auf der rechten Seite. Übertragen Sie die aktivierenden und nichtaktivierenden Lösungen, die Nanobodies enthalten, in Fläschchen und positionieren Sie die Puffer im Probenehmer. Erstellen Sie ein Protokoll für den Workflow mithilfe einer BAB-Sequenz.

Fügen Sie eine Schleife hinzu, um jede Konzentration zweimal zu messen, 120 Sekunden lang zu inkubieren und drei weitere Male zu messen. Verwenden Sie eine beliebige Software für die Datenanalyse, um den gemessenen Strom im Verhältnis zur Zeit darzustellen, und wählen Sie die Funktion für die Peakhöhenschätzung im Bereich der Hinzufügung des Aktivierungspuffers aus. Zeichnen Sie die Spitzenströme gegen die Nanobody-Konzentration auf, um den IC50 über nichtlineare Regression zu bestimmen.

Zur Bestimmung der Substratkonzentration, die bei einem Screening von Nanobodies verwendet werden soll, wurde der elektrogene Transport unter verschiedenen Substratkonzentrationen gemessen, um EC50 zu bestimmen. Eine Substratkonzentration, die den Sättigungsbedingungen entspricht, fünf Millimolar, wurde ausgewählt und in allen aktivierenden Puffern konstant gehalten. Die Wirkung von inhibitorischen Nanobodies auf den elektrogenen Transport wurde anhand der Abnahme der Amplituden der Spitzenströme visualisiert.

Nach dem Ausführen des Waschprotokolls, um die Entbinderung des Nanokörpers zu ermöglichen, wurde eine Erholung von 80 bis 95% der anfänglichen Spitzenstromamplitude beobachtet. Beim Wechsel von nicht aktiven zu aktivierenden Bedingungen wurden keine signifikanten Artefaktströme durch Nanobodies in diesen Puffern eingeführt. Nach der Auswahl von Nanobodies mit hemmenden Eigenschaften wurden die IC50-Werte für einzelne Nanobodies bestimmt.

Entscheidend ist, genügend Zeit für die Kalibrierung der Proteoliposomen auf dem Chip mit dem Puffer, der den Nanobody enthält, einzuplanen. Da die Bindung reversibel ist, muss der Nanobody sowohl in aktivierenden als auch in nicht aktivierenden Puffern vorhanden sein.