Name: Chirurgie und Probenverarbeitung zur korrelativen Bildgebung der murinen Pulmonalklappe (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-08-05T14:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 34 s
Description: Erfahren Sie eine korrelative Bildgebungsmethode für die murine Pulmonalklappe mit hydrostatischer Fixierung, μCT und SBF-SEM. Dieses Protokoll ermöglicht die präzise Zuordnung ultrastruktureller Daten zu anatomischen Strukturen.

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Die Verwendung von Tieren in dieser Studie erfolgte in Übereinstimmung mit dem institutionellen Tierpflege- und Verwendungsausschuss des Nationwide Children's Hospital unter dem Protokoll AR13-00030.
1. Lungenklappenexzision
<ol><li>Autoklavieren Sie die notwendigen Werkzeuge, die für die Mausdissektion benötigt werden. Dazu gehören feine Scheren, Mikrozangen, Mikrogefäßklemmen, Klemmzangen, Mikronieren, Mikronährenhalter, Federscheren und Retraktoren.</li>
	<li>Akklimatisieren Sie alle Mäuse für mindestens 2 Wochen vor der Operation. Entfernen Sie C57BL / 6-Mäuse, etwa 1 Jahr alt, aus ihren Käfigen und wiegen Sie, dann euthanasieren Sie mit einem Ketamin / Xylazin-Cocktail (3: 1 Ketamin: Xylazin, 0,01 ml pro g) Überdosierung.</li>
	<li>Legen Sie die Maus in eine dorsale Liegeposition auf ein Tablett und sichern Sie ihre Gliedmaßen mit Klebeband. Nach der Sicherung führen Sie die Thorakotomie durch.<ol>
<li>Setzen Sie das Herz frei, indem Sie überschüssiges Fettgewebe und Faszien entfernen.</li>
		<li>Entfernen Sie den rechten Vorhof und perfundieren Sie durch den linken Ventrikel mit Kochsalzlösung bei Raumtemperatur (0,9% NaCl). Die Perfusion sollte etwa 20 ml über 30 s dauern. Dies führt zur Exsanguination der Maus.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Entfernen Sie das gesamte Herz, indem Sie die obere Hohlvene, die untere Hohlvene, die Lungenarterie und die Aorta durchtrennen. Besondere Vorsicht ist bei der Lungenarterie geboten. Schneiden Sie etwa 2 mm über der ventrikulo-arteriellen Verbindung, da diese als Leitung für die Druckbeaufschlagung dient.</li>
	<li>Entfernen Sie die linken und rechten Ventrikel, um die Kammern dem atmosphärischen Druck auszusetzen. Stellen Sie sicher, dass die Struktur des Lungenstamms durch die Entfernung der Ventrikel nicht beeinträchtigt wird.</li>
</ol>2. Druckfixierung der Pulmonalklappe
<ol><li>Anastomose-Druckbeaufschlagungsschlauch mit Lungenarterie, der etwa 1 mm Abstand zwischen der sino-tubulären Verbindung und dem Ende des Schlauches lässt, um große Bewegungen der Blättchen und des Lungenstamms aufzunehmen.</li>
	<li>Heben Sie das Reservoir auf einen analogen physiologischen Druck und füllen Sie es mit der Kochsalzlösung. Testen Sie das Durchflusssystem, um sicherzustellen, dass keine Verstopfungen oder Luftblasen vorhanden sind.</li>
	<li>Befestigen Sie einen Absperrhahn an der anastomosierten Pulmonalklappe und sorgen Sie durch Umschalten des Ausströmtraktes für einen ausreichenden Durchfluss durch den Schlauch (d. h. keine Luftblasen). Sobald der Fluss ausreichend ist, schalten Sie den Abfluss auf die anastomosierte Pulmonalklappe um und stellen Sie die Druckbeaufschlagung des Lungenstamms sicher. Dies wird durch pulmonale Rumpfdehnung identifiziert.</li>
	<li>Sobald die Druckbeauffüllung des Lungenstamms bestätigt ist, werden schrittweise primäre Fixierlösung (1,25% Glutaraldehyd, 1,0% Paraformaldehyd in 0,15 M Cacodylat) eingebaut, bis die Kochsalzlösung gereinigt ist. Dies geschieht, indem ein Teil, etwa 25% der Reservoirkapazität, der Kochsalzlösung entfernt und durch das primäre Fixiermittel ersetzt wird. ACHTUNG: Die verwendeten Fixiermittel (Paraformaldehyd und Glutaraldehyd) sind hochgiftig und es sollten geeignete persönliche Schutzausrüstungen (PSA) getragen werden, um die Sicherheit zu gewährleisten.</li>
	<li>Legen Sie eine fixiermittelgetränkte Gaze über die Gewebeprobe, um ein Austrocknen zu verhindern.</li>
	<li>Halten Sie das Fixiermittel für 3 h durch und füllen Sie das Reservoir nach Bedarf auf, um einen konstanten Druck aufrechtzuerhalten. Während der Fixierung ist es nicht ungewöhnlich, dass die Pulmonalklappe aufgrund der chemischen Fixierung schrumpft. Wenn dies der Fall ist, füllen Sie das Reservoir ständig mit primären Fixiermitteln auf, um den physiologischen Druck aufrechtzuerhalten.</li>
	<li>Lagern Sie die Herzklappe bis zum Gebrauch bei 4 °C in der Fixierlösung. Die Proben wurden bis zu 1 Woche ohne erkennbaren Unterschied gelagert.</li>
</ol>3. En-bloc Probenfärbung und Einbettung15,16
ACHTUNG: Die in diesem Abschnitt verwendeten Färbereagenzien (Kaliumferrocyanid, Osmiumtetroxid, Thiocarbohydrazid, Bleiaspartat und Uranylacetat) sind hochgiftig und sollten mit äußerster Vorsicht behandelt werden. Die Verwendung eines Abzugs und einer geeigneten PSA wird empfohlen.
<ol><li>Färbung<ol>
<li>Waschen Sie die feste Herzklappenprobe für 5 min mit kaltem 0,15 M Cacodylatpuffer. Wiederholen Sie die Wäsche noch zwei weitere Male.</li>
		<li>Die Herzklappe vollständig in eine Lösung aus 1,5% Kaliumferrocyanid, 0,15 M Cacodylat, 2 mM Calciumchlorid und 2% Osmiumtetroxid auf Eis für 1 h tauchen.</li>
		<li>Während der Inkubation der Probe Thiocarbohydrazid (TCH) -Lösung vorbereiten, indem Sie 0,1 g TCH in 10 ml ddH2O auflösen. Regelmäßig vorsichtig rühren, um sicherzustellen, dass TCH vollständig aufgelöst ist. Filtern Sie die Lösung unmittelbar vor Gebrauch durch einen 0,22 μm Spritzenfilter.</li>
		<li>Waschen Sie die Proben mit Raumtemperatur ddH2O, indem Sie sie für 5 min in ein Röhrchen ddH2O geben und durch Schütteln des Behälters leicht rühren. Wiederholen Sie diesen Vorgang dreimal.</li>
		<li>Legen Sie es für 20 Minuten bei Raumtemperatur in gefilterte TCH-Lösung. Führen Sie den Waschschritt dreimal (je 5 min) bei Raumtemperatur ddH2O durch, wie in Schritt 3.1.4 beschrieben.</li>
		<li>Sobald Sie fertig sind, legen Sie die Probe in 2% Osmiumtetroxid für 30 min bei Raumtemperatur. Anschließend insgesamt dreimal für je 5 min mit Raumtemperatur ddH2O erneut waschen.</li>
		<li>Inkubieren Sie die Probe in 1% Uranylacetat über Nacht bei 4 °C.</li>
		<li>Während dieser Zeit wird eine Lösung von 0,066 g Bleinitrat in 10 ml Asparaginsäure-Stammlösung hergestellt. Stellen Sie den pH-Wert auf 5,5 mit 1 N KOH ein. Die Lösung in einen 60 °C-Ofen geben, um Bleinitrat aufzulösen.</li>
		<li>Führen Sie nach der Inkubation über Nacht den Waschschritt wie in Schritt 3.1.4 beschrieben durch. Wiederholen Sie den Vorgang dreimal. Anschließend wird das Herzklappengewebe in Bleiaspartatlösung ab Schritt 3.1.8 in einem 60 °C-Ofen für 30 min inkubiert.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Austrocknung<ol>
<li>Waschen Sie die Taschentücher 5 min bei Raumtemperatur mit ddH2O. Dreimal wiederholen.</li>
		<li>Machen Sie frische Lösungen von 20%, 50%, 70%, 90% und 100% Ethanol in ddH2O. Bis zum Gebrauch auf Eis aufbewahren.</li>
		<li>Um das Herzklappengewebe zu dehydrieren. Führen Sie nachfolgende Behandlungen von 20%, 50%, 70% und 90% Ethanol auf Eis für jeweils 5 Minuten durch. Führen Sie dann zwei nachfolgende Behandlungen von 100% Ethanol auf Eis für 5 Minuten durch.</li>
		<li>Bewegen Sie das Gewebe für 10 Minuten zu eiskaltem Aceton. Dann für 10 min in frisches Aceton bei Raumtemperatur geben.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Einbettung<ol>
<li>Stellen Sie die Harzmischung (siehe Materialtabelle)gemäß den Herstellerangaben fest: 11,4 g Komponente A, 10 g Komponente B, 0,3 g Komponente C und 0,05-0,1 g Komponente D. Mischen Sie zunächst die Komponenten A und B, indem Sie jede der Komponenten auf 60 °C erhitzen, bevor Sie die Komponenten C und D hinzufügen. Die Mischung wird durch Zugabe der Komponenten C und D in eine bernsteinfarbene Farbe umgewandelt. Es wird einheitlich sein, wenn es richtig gemischt wird.</li>
		<li>Stellen Sie Mischungen mit Volumenverhältnissen von 25:75, 50:50 und 75:25 Harz:Aceton hergestellt. Gründlich mischen.</li>
		<li>Legen Sie Gewebe in nachfolgende Behandlungen der 25:75-, 50:50- und 75:25-Harz-Aceton-Mischung für jeweils 2 h bei Raumtemperatur.</li>
		<li>Legen Sie das Gewebe über Nacht bei Raumtemperatur in 100% Harz.</li>
		<li>Am nächsten Tag legen Sie das Gewebe für 2 h bei Raumtemperatur in frisches 100% Harz.</li>
		<li>Das Herzklappengewebe in eine Einbettkapsel geben, mit frischem 100% Harz ersetzen und für 48 h in einen 60 °C-Ofen geben, um auszuhärten.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Führen Sie eine korrelative Bildgebung wie unten gezeigt durch.</li>
</ol>4. Mikro-Computertomographie Bildgebung
<ol><li>Montieren Sie den Harzprobenblock mit einem Klebstoff auf einem μCT-Probenhalter (Klebstoff oder doppelseitiges Klebeband funktioniert gut).</li>
	<li>Setzen Sie den Halter in die μCT-Kammer und befestigen Sie ihn auf der Bühne, indem Sie die Spannzange so verschrauben, dass sich der Halter nicht bewegt. Die Probenbewegung während des Scans verringert die Bildqualität.</li>
	<li>Öffnen Sie die μCT-Benutzeroberfläche, indem Sie auf das Symbol doppelklicken. Fügen Sie ein Projekt hinzu, indem Sie das +-Zeichen neben Projekte auswählen und die erforderlichen Felder ausfüllen.</li>
	<li>Sobald dies erstellt wurde, suchen Sie das erstellte Projekt und wählen Sie es aus, indem Sie darauf klicken. Dadurch öffnet sich eine zweite Spalte Akquisitionen. Wählen Sie das + neben Akquisitionen und füllen Sie die erforderlichen Felder aus.</li>
	<li>Schließen Sie die Kammertüren und bewaffnen Sie das System, indem Sie die Scharfschalttaste auf der Vorderseite oder den μCT drücken. HINWEIS: Das System schaltet die Röntgenbilder nach einem erfolgreichen Aufwärmvorgang automatisch aus. Aktivieren Sie Röntgenbilder, indem Sie die Taste auswählen.</li>
	<li>Stellen Sie die Bühnendrehung so ein, dass der Mittelpunkt der Drehung der Probe nicht von der Mitte des Monitors abweicht (d. h. die Probe befindet sich innerhalb des Sichtfelds für den gesamten Scan). Für das system, das für dieses Experiment verwendet wird, müssen Sie die ROI-Phase (Region of Interest) unter der Dropdown-Registerkarte wie unten beschrieben anpassen.<ol>
<li>Stellen Sie die ROI-Stufeneinstellung ein, indem Sie den Drehwinkel auf 0° einstellen und den Rand der Probe markieren. Anschließend wird die Probe auf 180° gedreht und der Rand der Probe erneut markiert.</li>
		<li>Passen Sie die x-Achsenposition der ROI-Stufe so an, dass sich die Kante der Probe zwischen diesen beiden Extremen befindet. Wiederholen Sie diesen Vorgang für Drehwinkel von 90° und 270° für die Y-Position.</li>
		<li>Für den Fall, dass die Rotation der Probe dazu führt, dass sich die Kanten aus dem Sichtfeld bewegen, verringern Sie die Vergrößerung des μCT-Bedarfs, bis die Kanten der Probe in den oben eingestellten Winkeln sichtbar sind und eine grobe ROI-Stufenanpassung vorgenommen werden kann.</li>
		<li>Einmal bei der unteren Vergrößerung eingestellt, bewegen Sie die Probe oder den Detektor, um die Vergrößerung zu erhöhen, und die ROI-Positionen können fein eingestellt werden. HINWEIS: Dieser Vorgang muss möglicherweise wiederholt werden, um die Ausrichtung sicherzustellen. Die richtige Ausrichtung führt zu einer Probe, die wenig bis keine horizontale Bewegung durch alle Rotationswinkel der Probe zeigt.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Passen Sie die μCT mit der Software des Herstellers an die gewünschten Scanparameter an. Zu diesen Parametern gehören Röhrenpotential, Röhrenstrom, Detektorabstand, Probenabstand, Belichtungszeit, Flugbahn und die Anzahl der Projektionen (siehe Tabelle S1 für die in dieser Studie verwendeten μCT-Erfassungsparameter). HINWEIS: Kalibrierparameter, wie Klarfeld- und Dunkelfeldscans, sollten gemäß den Herstellerspezifikationen eingehalten werden, sofern nicht anders angegeben. Wenn beispielsweise eine Probe zu groß ist und das System die Probe nicht aus der Feldansicht verschieben kann, muss die Probe entfernt werden, um Klare-Feld-Kalibrierungsscans durchzuführen.</li>
	<li>Sobald die Parameter eingestellt sind, kann eine Annäherung an die Dauer des Scans angezeigt werden, indem Sie auf die Schaltfläche Zeitschätzung klicken. Klicken Sie auf die Schaltfläche Start, um den Scan zu starten.</li>
	<li>Stellen Sie nach Abschluss des Scans sicher, dass die Röntgenstrahlen ausgeschaltet sind, schrauben Sie die Spannzange ab und entfernen Sie die Probe vorsichtig aus der μCT-Kammer.</li>
</ol>5. Probenverarbeitung und Bildkorrelation
<ol><li>Rekonstruieren Sie μCT-Projektionen mit einem gefilterten Rückprojektionsalgorithmus mit der vom Hersteller bereitgestellten Software (siehe Materialtabelle).<ol>
<li>Wählen Sie oben auf dem Bildschirm die Registerkarte Recon aus. Wählen Sie die Registerkarte Projekt und Akquisition aus.</li>
		<li>Wählen Sie die Recon-Vorlage aus, die der gefilterten Rückprojektion zugeordnet ist. Klicken Sie auf die Schaltfläche Start Recon. </li>
	</ol>
</li>
	<li>Identifizieren und segmentieren Sie die Pulmonalklappe mithilfe von Bildverarbeitungssoftware. Dies erfordert Vorkenntnisse der Anatomie der Pulmonalklappe17. Bei erhöhten arteriellen Drücken verfärben sich die Blättchen und blockieren das Lumen der Pulmonalklappe.</li>
	<li>Identifizieren Sie die Slicing-Ausrichtung in Bezug auf die Scanrichtung und das Muster. Orientieren Sie die Probe so um, dass die Schneidrichtung auf die gewünschte Achse ausgerichtet ist.</li>
	<li>Identifizieren Sie Regionen, die für hochauflösende Bildgebung von Interesse sind. In diesem Experiment wurde der Bauch (Mitte) des Blättchens und die Arterio-Valvular-Verbindung gewählt.</li>
	<li>Entfernen Sie das überschüssige Harz und probieren Sie entweder mit der Rasierklinge oder dem Schleifen für große Materialstücke oder mit dem Mikrotom für feinere Stücke.</li>
	<li>Sobald Sie sich an einem interessanten Ort befinden, vergleichen Sie die physische Probe mit virtuellen μCT-Scheiben, um den Standort zu bestätigen. Dies geschah durch den Vergleich anatomischer Merkmale am Querschnitt.</li>
</ol>6. Serielle Blockflächen-Rasterelektronenmikroskopie18
<ol><li>Reduzieren Sie den Querschnitt der Probe, um SBF-REM aufzunehmen, ca. 2,0 x 1,5 x 1,8 mm.</li>
	<li>Montieren Sie die getrimmte Probe mit Epoxidharz auf dem SBF-SEM-Aluminiumstumpf.</li>
	<li>Beschichten Sie den Probenblock mit 35 nm Gold. Drehen Sie die Probe auf der Plattform, um eine gleichmäßige Beschichtungsschicht aufzutragen.</li>
	<li>Entlüften Sie die SBF-REM-Kammer und stellen Sie die Höhe der Messerklinge auf die euzentrische Höhe des Mikroskops ein.</li>
	<li>Fügen Sie das Beispiel ein, und nivellen Sie den Beispielstub.</li>
	<li>Bild unter Niedrigenvakuumbedingungen zur Verhinderung des Ladens und mit Rückstreudetektor (siehe Tabelle S2 für SBF-SEM-Erfassungsparameter).</li>
	<li>Bild und Stitch mehrere Bereiche von Interesse bei unterschiedlichen Vergrößerungen mit automatisierter Software (siehe Materialtabelle).</li>
</ol>

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</ol>

Die Autoren haben nichts preiszugeben.

Die Entfernung der Ventrikel dient zwei Zwecken. Erstens, die Ventrikelseite dem atmosphärischen Druck auszusetzen, wodurch nur ein transvalvulärer Druck von der arteriellen Seite der Pulmonalklappe ausgeübt werden muss, um sich zu schließen, und zweitens, eine stabile Basis bereitzustellen, um eine Verdrehung des Lungenstamms zu verhindern. Während der Druckbeaufschlägeung dehnung sich der Lungenstamm radial und minderwertig, wodurch er anfällig für Verdrehungen wird, was zum Zusammenbruch des Lungenstamms führt. Die Vo...

Die Pulmonalklappe (PV) dient dazu, eine unidirektionale Durchblutung zwischen dem rechten Ventrikel und der Lungenarterie sicherzustellen. Lungenklappenfehlbildungen sind mit verschiedenen Formen angeborener Herzerkrankungen verbunden. Die aktuelle Behandlung für angeborene Herzklappenerkrankungen (HVD) ist die Klappenreparatur oder der Klappenersatz, was mehrere invasive Operationen während des gesamten Lebens eines Patienten erfordern kann1. Es ist allgemein anerkannt, dass die Funktion der Herzklappe von ihrer Struktur abgeleitet wird, die oft als Struktur-Funktions-Korrelat bezeichnet wird. Genauer gesagt bestimmen die geometrischen und biomechanischen Eigenschaften des Herzens seine Funktion. Die mechanischen Eigenschaften wiederum werden durch die Zusammensetzung und Organisation des ECM bestimmt. Durch die Entwicklung einer Methode zur Bestimmung der biomechanischen Eigenschaften von murinen Herzklappen können transgene Tiermodelle verwendet werden, um die Rolle des ECM auf die Herzklappenfunktion und Dysfunktionabzufragen 2,3,4,5.
Das mausige Tiermodell gilt seit langem als Standard für molekulare Studien, da transgene Modelle bei Mäusen im Vergleich zu anderen Arten leichter verfügbar sind. Murine transgene Modelle bieten eine vielseitige Plattform für die Erforschung herzklappenbedingter Erkrankungen6. Das chirurgische Know-how und die Instrumentierungsanforderungen, um sowohl die Geometrie als auch die ECM-Organisation zu charakterisieren, waren jedoch eine große Hürde für den Fortschritt der HVD-Forschung. Hstologische Daten in der Literatur liefern ein Bild in den gehalt an extrazellulären Matrixen der mausinen Herzklappe, jedoch nur in Form von 2D-Bildern, und können ihre 3D-Architektur nicht beschreiben7,8. Darüber hinaus ist die Herzklappe sowohl räumlich als auch zeitlich heterogen, was es schwierig macht, über Experimente hinweg Rückschlüsse auf die ECM-Organisation zu ziehen, wenn die Probenahme und Konformation nicht festgelegt sind. Herkömmliche 3D-Charakterisierungsmethoden wie MRT oder 3D-Echokardiographie bieten nicht die Auflösung, die erforderlich ist, um ECM-Komponenten9,10aufzulösen.
Diese Arbeit beschreibt einen vollständig korrelativen Arbeitsablauf, bei dem die zeitliche Heterogenität aufgrund des Herzzyklus durch Fixierung der Konformation der murinen PV mit hydrostatischem Transvalvulardruck angesprochen wurde. Die räumliche Heterogenität wurde präzise kontrolliert, indem Bereiche von Interesse abgesonden und Datensätze aus verschiedenen Bildgebungsmodalitäten, insbesondere μCT und serielle Blockflächen-Rasterelektronenmikroskopie, über verschiedene Längenskalen registriert wurden. Diese Methode des Scoutings mit μCT zur Führung der nachgelagerten Probenahme wurde bereits vorgeschlagen, aber da die Pulmonalklappe zeitliche Variationen aufweist, war eine zusätzliche Kontrollebene auf der chirurgischen Ebene11erforderlich.
In-vivo-Studien, die die Biomechanik der murinen Herzklappe beschreiben, sind spärlich und stützen sich stattdessen bei der Beschreibung des Deformationsverhaltens auf Computermodelle. Es ist von entscheidender Bedeutung, dass lokale extrazelluläre Daten auf der Nanometerlängenskala mit der Geometrie und Lage der Herzklappe in Verbindung stehen. Dies wiederum liefert quantifizierbare, räumlich abgebildete Verteilungen von mechanisch beitragenden ECM-Proteinen, mit denen bestehende biomechanische Herzklappenmodelle verstärkt werden können12,13,14.

<table><tbody><tr><td>25 % Glutaraldehyd (aq)</td><td>EMS</td><td>16210</td><td>Primäre Fixierkomponente</td></tr><tr><td>0,9 % Natriumchlorid-Injektion</td><td>Hospira Inc.</td><td>NDC 0409-4888-10</td><td></td></tr> 1 <tr><td>mL Spritze</td><td>BD</td><td>309659</td><td></td></tr><tr><td>10 mL Spritze</td><td>BD</td><td>309604</td><td></td></tr><tr><td>200 proof Ethanol</td><td>EMS</td><td>15055</td><td></td></tr><tr><td>22G Nadel</td><td>BD</td><td>305156</td><td></td></tr><tr><td>3 mL Spritze</td><td>BD</td><td>309657</td><td></td></tr><tr><td>3-Wege-Absperrhahn</td><td>Smiths Medical ASD, Inc.</td><td></td><td></td>MX5311L</tr><tr><td>4% Osmiumtetroxid</td><td>EMS</td><td>19150</td><td>Färbekomponente</td></tr><tr><td>4% Paraformaldehyd (aq)</td><td>EMS</td><td>157-4-100</td><td>Primärfixierende Komponente</td></tr><tr><td>Resorbierbares Blutstillungsmittel</td><td>Ethicon</td><td>1961</td><td></td></tr><tr><td>Aceton</td><td>EMS</td><td>10012</td><td></td></tr><tr><td>Schwarzes Polyamid-Monofilament-Nahtmaterial, 10-0</td><td>AROSurgical instruments Corporation</td><td></td><td></td>TI38402</tr><tr><td>Schwarzes monofiles Polyamid-Nahtmaterial, 6-0</td><td>AROSurgical instruments Corporation</td><td>SN-1956</td><td></td></tr><tr><td>C57BL/6</td><td>Mäuse Jackson Laboratories</td><td>664</td><td>Ungefähr 1 Jahr</td></tr><tr><td>Calciumchlorid</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>10043-52-4</td><td></td></tr><tr><td>Klemmzange zum Anlegen</td><td>FST</td><td>00072-14</td><td></td></tr><tr><td>Wattestäbchen-Applikatoren</td><td>Fisher Scientific</td><td>23-400-118</td><td></td></tr><tr><td>DPBS</td><td>Gibco</td><td>14190-144</td><td></td></tr><tr><td>Dumont #5 Pinzette</td><td>FST</td><td>11251-20</td><td></td></tr><tr><td>Dumont #5/45 Pinzette</td><td>FST</td><td>11251-35</td><td></td></tr><tr><td>Dumont #7 Feinzange</td><td>FST</td><td>11274-20</td><td></td></tr><tr><td>Durcupan ACM Harz</td><td>EMS</td><td>14040</td><td>Zum Einbetten</td></tr><tr><td>Feine Schere</td><td>FST</td><td>14028-10</td><td></td></tr><tr><td>Heliscan microCT</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td></td><td>Micro-CT</td></tr><tr><td>Ketaminhydrochlorid Injektion</td><td>Hospira Inc.</td><td>NDC 0409-2053</td><td></td></tr><tr><td>L-Asparaginsäure</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>56-84-8</td><td>Färbekomponente</td></tr><tr><td>Bleinitrat</td><td>EMS</td><td>17900</td><td>Färbekomponente</td></tr><tr><td>Niedrigvakuum-Rückstreudetektor</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>VSDBS</td><td>REM Rückstreudetektor</td></tr><tr><td>Mikro-Adson-Pinzette</td><td>FST</td><td>11018-12</td><td></td></tr><tr><td>Millex-GP Filter, 0,22 μm, PES 33mm, unsteriles</td><td>EMD Millipore</td><td>SLGP033NS</td><td></td></tr><tr><td>Vliesstoff Songes</td><td>McKesson Corp.</td><td>94442000</td><td></td></tr><tr><td>Kaliumhexacyanoferrat(II)-trihydrat</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>14459-95-1</td><td>Färbekomponente</td></tr><tr><td>Kaliumhydroxid</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>1310-58-3</td><td></td></tr><tr><td>Drucküberwachungsleitung</td><td>Smiths Medical ASD, Inc.</td><td>MX562</td><td></td></tr><tr><td>Kochsalzlösung (steril 0,9 % Natriumchlorid)</td><td>Hospira Inc.</td><td>NDC 0409-0138-22</td><td></td></tr><tr><td>Größe 3 BEEM-Kapsel</td><td>EMS</td><td>69910-01</td><td>Einbettbehälter</td></tr><tr><td>Natriumcacodylat-Trihydrat</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>6131-99-3</td><td></td>Puffer-Solibri-Retraktoren</tr><tr><td></td><td>FST</td><td>17000-04</td><td></td></tr><tr><td>Sputter-, Carbon- und E-Beam-Coater</td><td>Leica</td><td>EM ACE600</td><td>Goldcoater</td></tr><tr><td>Operationsmikroskop</td><td>Leica</td><td>M80</td><td></td></tr><tr><td>Thiocarbohydrazid (TCH)</td><td>EMS</td><td>21900</td><td>Färbekomponente</td></tr><tr><td>Tish Nadelhalter/Pinzette</td><td>Micrins</td><td>MI1540</td><td></td></tr><tr><td>Trimmer</td><td>Wahl</td><td>9854-500</td><td></td></tr><tr><td>Uranylacetat</td><td>EMS</td><td>22400</td><td>Färbekomponente</td></tr><tr><td>Volumescope Rasterelektronenmikroskop</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>VOLUMESCOPESEM</td><td>Serielles Block-Rasterelektronenmikroskop</td></tr><tr><td>Xylazin sterile Lösung</td><td>Akorn Inc.</td><td>NADA# 139-236</td><td></td></tr></tbody></table>

chirurgie und probenverarbeitung zur korrelativen bildgebung der murinen pulmonalklappe

Surgery and Sample Processing for Correlative Imaging of the Murine Pulmonary Valve

Die zugrunde liegenden Ursachen der Herzklappenerkrankung (HVD) sind schwer fassbar. Murine Tiermodelle bieten ein hervorragendes Werkzeug für die Untersuchung von HVD, aber das chirurgische und instrumentelle Fachwissen, das erforderlich ist, um die Struktur und Organisation über mehrere Längenskalen hinweg genau zu quantifizieren, hat seinen Fortschritt behindert. Diese Arbeit bietet eine detaillierte Beschreibung der murinen Dissektion, der En-bloc-Färbung, der Probenverarbeitung und der korrelativen Bildgebungsverfahren zur Darstellung der Herzklappe auf verschiedenen Längenskalen. Hydrostatischer Transvalvulardruck wurde verwendet, um die zeitliche Heterogenität durch chemische Fixierung der Herzklappenkonformation zu kontrollieren. Die Mikro-Computertomographie (μCT) wurde verwendet, um die Geometrie der Herzklappe zu bestätigen und eine Referenz für die nachgelagerte Probenverarbeitung zu liefern, die für die serielle Blockflächen-Rasterelektronenmikroskopie (SBF-REM) erforderlich ist. Hochauflösende serielle REM-Bilder der extrazellulären Matrix (ECM) wurden aufgenommen und rekonstruiert, um eine lokale 3D-Darstellung ihrer Organisation zu erhalten. μCT- und SBF-SEM-Bildgebungsverfahren wurden dann korreliert, um die räumliche Variation über die Pulmonalklappe zu überwinden. Obwohl sich die vorgestellte Arbeit ausschließlich auf die Pulmonalklappe betrifft, könnte diese Methodik zur Beschreibung der hierarchischen Organisation in biologischen Systemen übernommen werden und ist entscheidend für die strukturelle Charakterisierung über mehrere Längenskalen hinweg.

Anastomose der Lungenarterie zum Druckschlauch ist in Abbildung 1Adargestellt. Nach der Anwendung von hydrostatischem Druck dehnung sich der Lungenstamm radial (Abbildung 1B), was darauf hinweist, dass sich die Lungenklappenblättchen in einer geschlossenen Konfiguration befinden. Die Pulmonalklappenkonformation wurde durch μCT bestätigt. In diesem Fall waren die Blättchen koapt (geschlossen) und der Ring war kreisförmig (Abbildung 2A</strong...

Hier beschreiben wir einen korrelativen Workflow für die Exzision, Druckbeaufschlagung, Fixierung und Bildgebung der murinen Pulmonalklappe, um die grobe Konformation und lokale extrazelluläre Matrixstrukturen zu bestimmen.

Chirurgie und Probenverarbeitung zur korrelativen Bildgebung der murinen Pulmonalklappe

The underlying causes of heart valve related-disease (HVD) are elusive. Murine animal models provide an excellent tool for studying HVD, however, the ...

Dieses Protokoll ist von Bedeutung, da es dazu gedacht ist, Fragen zur Strukturfunktion der murinen Pulmonalklappe zu beantworten, die aufgrund ihrer inhärenten Heterogenität im Allgemeinen schwierig ist. Die kontrollierte Fixierung und korrelative Bildgebung wurden verwendet, um die Struktur auf mehreren Längenskalen zu erfassen. Lokale hochauflösende Bilder können dann wieder auf die genaue anatomische Stelle an der Pulmonalklappe abgebildet werden.Dr. Tai Yi, Direktor der Mikrochirurgie im Zentrum für Regenerative Medizin am Nationwide Children's Hospital, wird das Verfahren demonstrieren. Beginnen Sie mit dem Autoklavieren der Werkzeuge, die für die Mausdissektion benötigt werden, einschließlich feiner Scheren, Mikrokraftmaschinen, mikrovaskulärer Klemmen, Zangenzangen, Mikronierenhalter, Federscheren und Retraktoren. Nachdem Sie eine erwachsene C57BL / 6-Maus eingeschläfert haben, legen Sie sie in eine dorsale Liegeposition auf ein Tablett, sichern Sie ihre Gliedmaßen mit Klebeband und führen Sie die Thorakotomie durch.Setzen Sie das Herz frei, indem Sie überschüssiges Fettgewebe und Faszien entfernen, entfernen Sie dann den rechten Vorhof und perfundieren Sie den linken Ventrikel mit Kochsalzlösung bei Raumtemperatur. Entfernen Sie das gesamte Herz, indem Sie die obere Hohlvene, die Untervene, die Lungenarterie und die Aorta durchtrennen und etwa zwei Millimeter über der ventrikuloatrialen Verbindung schneiden, die als Kanal für die Druckbeaufschlagung dient. Entfernen Sie die linken und rechten Ventrikel, um die Kammern dem atmosphärischen Druck auszusetzen, und stellen Sie sicher, dass die Lungenstammstruktur durch entfernen der Ventrikel nicht beeinträchtigt wird.Anastomose-Druckschlauch mit der Lungenarterie, wobei etwa ein Millimeter Abstand zwischen der sinotubulären Verbindung und dem Ende des Schlauches bleibt, um große Bewegungen der Blättchen und des Lungenstamms aufzunehmen. Heben Sie das Reservoir auf einen analogen physiologischen Druck und füllen Sie es mit der Kochsalzlösung. Testen Sie das Durchflusssystem, um sicherzustellen, dass keine Verstopfungen oder Luftblasen vorhanden sind.Befestigen Sie einen Absperrhahn an der anastomosierten Pulmonalklappe und sorgen Sie durch Umschalten des Ausflusstraktes für einen ausreichenden Durchfluss durch den Schlauch. Sobald der Fluss ausreichend ist, schalten Sie den Abfluss auf die anastomosierte Pulmonalklappe um und stellen Sie die Druckbeaufschlagung des Lungenstamms sicher, der durch Rumpfdehnung identifiziert wird. Nach Bestätigung der Druckbeaufregung des Lungenstamms schrittweise primäre Fixierlösung einbauen, bis 25% der Reservoirkapazität der Kochsalzlösung gereinigt sind.Legen Sie eine fixiermittelgetränkte Gaze über die Gewebeprobe, um ein Austrocknen zu verhindern. Halten Sie das Fixiermittel drei Stunden lang durch und füllen Sie das Reservoir auf, um einen konstanten Druck aufrechtzuerhalten. Nach der Perfusion die Herzklappe in der Fixierlösung bei vier Grad Celsius bis zu einer Woche lagern.Zur Färbung die feste Herzklappenprobe dreimal mit kaltem 0,15 molarem Cacodylatpuffer für fünf Minuten waschen und die Herzklappe eine Stunde lang vollständig in eine Lösung aus 1,5 Kaliumferrocyanid, 0,15 Molarkacodylat, zwei millimolarem Calciumchlorid und 2% Osmiumtetroxid auf Eis tauchen. Waschen Sie die Proben mit doppelt destilliertem Wasser bei Raumtemperatur, indem Sie sie fünf Minuten lang unter leichtem Rühren in ein Röhrchen geben. Nach drei weiteren Wäschen wird die Probe in gefilterte Thiocarbohydrazidlösung bei Raumtemperatur geben.Nach 20 Minuten waschen Sie die Probe dreimal mit Wasser, wie zuvor gezeigt. Als nächstes legen Sie die Probe in 2% Osmiumtetroxid bei Raumtemperatur. Nach 30 Minuten dreimal fünf Minuten lang mit Wasser waschen und die Probe über Nacht bei vier Grad Celsius in 1% Uranylacetat inkubieren.Bereiten Sie in der Zwischenzeit eine Lösung von Bleinitrat vor. Führen Sie am nächsten Tag den Waschschritt dreimal durch, wie zuvor gezeigt, und inkubieren Sie dann das Herzklappengewebe in Bleiaspartatlösung bei 60 Grad Celsius für 30 Minuten. Waschen Sie die Proben noch drei weitere Male und führen Sie dann eine serielle Dehydratisierungsbehandlung an den Herzklappengeweben mit frisch zubereitetem 20, 50, 70 und 90% Ethanol auf Eis für jeweils fünf Minuten durch, gefolgt von zwei nachfolgenden Behandlungen mit 100% Ethanol.Nach der Austrocknung das Gewebe zu eiskaltem Aceton bewegen und dann für 10 Minuten in frisches Aceton bei Raumtemperatur legen. Zum Einbetten die Harzmischung nach herstellerfüllendem Vorgabe herstellen. Legen Sie gewebe in nachfolgende Behandlungen von 25 bis 75, 50 bis 50 und 75 bis 25 Harz zu Acetonmischung für jeweils zwei Stunden.Zum Schluss legen Sie das Gewebe über Nacht in 100% Harz. Am nächsten Tag legen Sie das Gewebe in frisches 100% Harz. Nach zwei Stunden das Gewebe in eine Einbettungskapsel geben, frisches 100% Harz hinzufügen und für 48 Stunden in einen 60 Grad Celsius ofen geben, um es auszuhärten.Die herausgeschnittene anastomosierte Lungenarterie vor und nach der Anwendung von hydrostatischem Druck ist hier dargestellt. Der Lungenstamm dehnung sich radial, was darauf hinweist, dass sich die Lungenklappenblättchen in einer geschlossenen Konfiguration befinden. Die mikroberechnete Tomographie bestätigte die Bestätigung der Pulmonalklappe.Die Blättchen waren geschlossen und der Ring war kreisförmig, während unterschiedliche Grade einer unzureichenden Druckbeaufschlagung der Pulmonalklappe durch Fixation oder arteriellen Kollaps beobachtet wurden. Das Mikro-CT-Volumen, das virtuelle Querschnitte rendert, wurde mit optischen Bildern korreliert, um die Schnittrichtung und -position zu bestätigen. Hochauflösende SBF-SEM-Bilder wurden in einer lokalen Region innerhalb eines Prospekts aufgenommen, wenn sich der Probenblock an der gewünschten Stelle und Ausrichtung befand.Hier werden korrelierte Bilder zwischen dem Mikro-CT-Volumen, das virtuelle Slice-Bilder rendert, hochauflösenden und hochauflösenden SBF-SEM-Bildern gezeigt. In der 3D-Darstellung einer segmentierten Region der Pulmonalklappe können extrazelluläre Komponenten wie Endothelzellen, valvuläre interstitielle Zellen und extrazelluläre Fasern identifiziert werden. Wenn Sie dieses Protokoll versuchen, beachten Sie bitte, dass die Durchführung der Druckbeaufschlagung kritisch ist und sicherstellt, dass die Ausbeute so hoch wie möglich ist.

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Research

Forschung

JoVE Journal

Engineering

Ingenieurwesen

Hochfrequenz-Doppler-Ultraschall ist eine neue Technologie für die Beurteilung der regionalen Myokardfunktion. Diese Arbeit präsentiert erste Nachweis einer Anwendbarkeit dieses vielseitige Imaging-Plattform für die wiederholte Messung der myokardialen Belastung, dp / dt und Mitralinsuffizienz in der Ischämie-Reperfusion (IR) murine Herzen.

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Transplantation von Pulmonalklappe Mit einem Maus-Modell der heterotopen Herztransplantation

Dieses Protokoll bietet eine detaillierte Beschreibung des echokardiographischen Ansatzes für eine umfassende Phänotypisierung der Herz- und Herzklappenfunktion bei Mäusen.

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Hier bieten wir einen nützlichen Ansatz für die Untersuchung des Mechanismus des rechtsventrikulären Versagens. Ein bequemerer und effizienterer Ansatz zur Verengung der Lungenarterie wird mit chirurgischen Instrumenten aus dem eigenen Haus etabliert. Darüber hinaus werden Methoden zur Bewertung der Qualität dieses Ansatzes durch Echokardiographie und Katheterisierung bereitgestellt.

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Ein Bild geführte transapical Mitral Valve Leaflet Puncture Modell der kontrollierten Volumenüberlastung von Mitral Regurgitation in der Ratte

Hier wird ein Protokoll zur Erhaltung der vaskulären Kontraktilität von PCLS-murinem Lungengewebe vorgestellt, was zu einem anspruchsvollen dreidimensionalen Bild des Lungengefäßsystems und der Atemwege führt, das bis zu 10 Tage konserviert werden kann und für zahlreiche Verfahren anfällig ist.

Präzisionsschnitt-Lungenschnitte als effizientes Werkzeug für Ex-vivo-Studien zur Struktur und Kontraktilität von Lungengefäßen

Dieses Protokoll demonstriert die mikroskopiegesteuerte Isolierung und Immunfluoreszenzfärbung von murinen Pulmonalvenen. Wir bereiten Gewebeproben vor, die den linken Vorhof, die Lungenvenen und die entsprechende Lunge enthalten, und färben sie für kardiales Troponin T und Connexin 43.

Mikrodissektion und Immunfluoreszenzfärbung von Myokardhülsen in murinen Pulmonalvenen

Wir beschreiben ein Mausmodell der rechtsventrikulären Drucküberlastung, die durch pulmonales Rumpfbanding induziert wird. Detaillierte Protokolle für Intubation, Operation und Phänotypisierung durch Echokardiographie sind in der Arbeit enthalten. Für die Intubation und Chirurgie werden maßgefertigte Instrumente verwendet, die eine schnelle und kostengünstige Reproduktion des Modells ermöglichen.

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