Name: Optische Pinzette untersucht RNA-Protein-Interaktionen in der Translationsregulation (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-02-12T13:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 26 s
Description: Lernen Sie optische Pinzetten zur Untersuchung von RNA-Protein-Interaktionen in der Translationsregulation. Diese Methode ermöglicht präzise Kraftmessungen bei der RNA-Entfaltung und Bindungsereignissen in Echtzeit.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Wir danken Anuja Kibe und Jun. Prof. Redmond Smyth für die kritische Begutachtung des Manuskripts. Wir danken Tatyana Koch für die fachkundige technische Unterstützung. Wir danken Kristyna Pekarkova für die Hilfe bei der Aufnahme experimenteller Videos. Die Arbeit in unserem Labor wird von der Helmholtz-Gemeinschaft unterstützt und vom Europäischen Forschungsrat (ERC) Grant Nr. 948636 (bis NC) gefördert.

1. Probenvorbereitung
<ol><li>Klonen Sie die interessierende Sequenz in den Vektor, der die Lambda-DNA-Fragmente enthält, die als Griffsequenzen dienen (Abbildung 2)43,50.</li>
	<li>Generieren Sie zunächst eine DNA-Vorlage für die anschließende In-vitro-Transkription mittels PCR (Abbildung 2B; Reaktion 1). Bei diesem PCR-Schritt wird der T7-Promotor am 5'-Ende des Sinnes-DNA-Moleküls 32,33,43,50 hinzugefügt. Stellen Sie die PCR-Reaktion gemäß Tabelle 1 ein. Führen Sie die PCR in 50 μL Aliquots mit entsprechenden Zyklen im Thermocycler durch.</li>
	<li>Die Griffe werden durch zwei getrennte PCR-Reaktionen vorbereitet (Tabelle 1, Abbildung 2B; Reaktion 2 und 3). Generieren Sie zuerst den 5'-Griff per PCR. Erzeugen Sie dann den 3'-Griff und markieren Sie ihn gleichzeitig mit Digoxigenin, indem Sie einen 5'-Digoxigenin-markierten Primer verwenden32,33,43,50.</li>
	<li>Nach der PCR reinigen Sie die DNA mit Quarzspinsäulen.</li>
	<li>Durchführung der In-vitro-Transkriptionsreaktion unter Verwendung der T7-RNA-Polymerase (Tabelle 2)32,33,43,50. Inkubieren Sie die Reaktion bei 37 °C für 2-4 h in Abhängigkeit von der Länge der RNA. Als nächstes DNase I in die Reaktion geben und bei 37 °C für 30 min inkubieren, um die DNA-Vorlage zu verdauen. Reinigen Sie die RNA mit Silica-Spin-Säulen.</li>
	<li>Während der Markierungsreaktion des 5'-Griffs (Tabelle 3) Wird Biotin-16-dUTP am 3'-Ende des Griffs durch T4-DNA-Polymerase38,50 zugegeben. Führen Sie die Reaktion bei Raumtemperatur für 1-2 h durch. Anschließend reinigen Sie die DNA mit Silica-Spin-Säulen. HINWEIS: Da der 5'-Griff an seinem 3'-Ende gekennzeichnet werden muss (Abbildung 2B), kann die Beschriftung während der PCR nicht durchgeführt werden.</li>
	<li>Mischen Sie die oben genannten Komponenten - 5' Griff (3' markiert mit Biotin), 3' Griff (5' markiert mit Digoxigenin) und RNA - in einem molaren Verhältnis von 1:1:1 im Glühpuffer (80% Formamid, 400 mM NaCl, 40 mM HEPES, pH 7,5, 0,5 mM EDTA, pH 8), um den gewünschten RNA/DNA-Hybrid zu erhalten (Tabelle 4). Das Glühgemisch 10 min auf 85 °C erhitzen und dann langsam auf 4 °C abkühlen lassen.</li>
	<li>Mischen Sie die geglühte Probe mit 1/10 Volumen von 3 M Natriumacetat (pH 5), 3 Volumen eiskaltem Ethanol und inkubieren Sie bei -80 °C für mindestens 1 h oder bei -20 °C über Nacht.</li>
	<li>Zentrifugieren Sie die Proben bei 15.000 × g für 30 min bei 4 °C. Entsorgen Sie den Überstand und trocknen Sie das Pellet (normalerweise nicht sichtbar) unter Vakuum.</li>
	<li>Zum Schluss resuspend, das Pellet in 50 μL RNase-freiem Wasser resuspend und Aliquots herstellen. Die Aliquots bis zum Gebrauch bei -80 °C lagern. Zur Kurzzeitlagerung können die Proben auch bei -20 °C gelagert werden.</li>
</ol>2. Geräteeinrichtung
HINWEIS: Das folgende Protokoll ist für das kommerzielle optische Pinzetteninstrument C-Trap der Firma LUMICKS optimiert. Daher können Anpassungen an den vorgestellten Schritten bei der Verwendung anderer optischer Pinzetteninstrumente erforderlich sein. Wenn es nicht verwendet wird, wird das Mikrofluidiksystem der Maschine in Bleichmittel (Natriumhypochloritlösung) aufbewahrt und muss vor Gebrauch gewaschen werden.
<ol><li>Entsorgen Sie das Bleichmittel und füllen Sie die Spritzen mit 1 ml RNase-freiem Wasser.</li>
	<li>Fügen Sie 50 μL 0,5 M Natriumthiosulfat zu mindestens 1 mL des RNase-freien Wassers hinzu und waschen Sie das System gründlich (1 bar, mindestens 0,5 ml), um das verbleibende Bleichmittel im System zu entfernen.</li>
	<li>Verwerfen Sie die Natriumthiosulfatlösung aus den Spritzen. Ersetzen Sie die Spritzen durch frische und waschen Sie das System mit mindestens 0,5 ml RNase-freiem Wasser. HINWEIS: Achten Sie darauf, dass das Mikrofluidiksystem niemals trocken läuft, um Luftblasen im System zu vermeiden.</li>
	<li>Geben Sie 2 Tropfen Tauchöl (Brechungsindex von 1,33) oder ca. 70 μL Wasser auf das Objektiv.</li>
	<li>Platzieren Sie die Durchflusszelle in ihrer Position im Halterahmen.</li>
	<li>Geben Sie 2 Tropfen Tauchöl (Brechungsindex von 1,51) auf die Durchflusszelle.</li>
	<li>Schalten Sie das Lasergerät in der Pinzette ein. Sobald es ausgeführt wird, schalten Sie den Überfanglaser in der Softwareoberfläche zu 100% ein.</li>
	<li>Stellen Sie mit Diagnosekameras (Z-Finder) die Z-Achse durch Drehen der Mikroschraube in die Mitte der Kammer zwischen der zweiten und der dritten Reflexion (Grenzflächen) ein, wo die Brechungsringe am größten sind. HINWEIS: Jedes Mal, wenn das Objektiv näher an die Messkammer herangeführt wird und die Fokusebene des Objektivs die Grenzfläche zwischen zwei Phasen kreuzt, kann im Z-Finder-Modus eine Reflexion erkannt werden. Es sind 4 Schnittstellen möglich: (i) Wasser / Tauchöl und unteres Glas (ii) unteres Glas und Puffer in der Kammer (iii) Puffer in der Kammer und oberes Glas (iv) oberes Glas und Tauchöl für Kondensator.</li>
	<li>Stellen Sie die Kondensatorposition ein (Stellen Sie den Fanglaser auf ca. 50%), so dass der Kondensator das Tauchöl oben auf der Messkammer berührt.</li>
	<li>Stellen Sie den Fokus ein, indem Sie sich mit dem Kondensator langsam nach unten/oben bewegen, so dass im Mondmodus ca. 10 Lichtbänder angezeigt werden (Diagnosekameras).</li>
</ol>3. Probenmessung
<ol><li>Inkubieren Sie Anti-Digoxigenin-beschichtete Kügelchen (AD) mit den Probenkonstrukten (3 μL 0,1% (w/v) AD-Perlensuspension + 4 μL Probe) und mit 1 μL RNase-Inhibitoren und 8 μL des Assay-Puffers (300 mM KCl, 5 mM MgCl2, 20 mM HEPES, pH 7,6, 0,05% Tween 20, 5 mM DTT) bei RT für 10-20 min. Nach der Inkubation verdünnen Sie die Probe in 500 μL Assay-Puffer. HINWEIS: Es wird empfohlen, Sauerstofffänger, insbesondere während Fluoreszenzmessungen, in den Puffer zu geben, um oxidative Schäden zu vermeiden. Hier wurde ein Sauerstofffängersystem verwendet, das Glukose (8,3 mg/ml), Glucoseoxidase (40 U/ml) und Katalase (185 U/ml) enthielt.</li>
	<li>Mischen Sie 0,8 μL 1% (w/v) Streptavidin-beschichtete (SA) Perlen mit 1 ml Assay-Puffer.</li>
	<li>Entsorgen Sie Wasser aus den Spritzen und füllen Sie die Spritzen mit entsprechenden Suspensionen/Lösungen. Mindestens 2 Minuten bei ca. 1 bar waschen und dann mit dem Fangen von Perlen beginnen. HINWEIS: Je nach Versuchsaufbau können unterschiedliche Kanalanordnungen verwendet werden (Abbildung 3). Typischerweise ist ein Strömungskanal mit Anti-Digoxigenin-Kügelchen gefüllt, die das RNA-Molekül tragen. Ein zweiter Kanal ist mit den mit Streptavidin beschichteten Perlen gefüllt. Pufferkanal wird verwendet, um die Tethers zu bilden. Ein vierter Kanal kann verwendet werden, um das RNA-bindende Protein zu laden (Abbildung 3C), oder alternativ kann RBP direkt im Pufferkanal hinzugefügt werden (Abbildung 3B).</li>
	<li>Um die Perlen zu erfassen, bewegen Sie die optischen Fallen voneinander getrennt. Bewegen Sie sich zuerst zum AD-Kanal und fangen Sie eine AD-Perle in Falle 1. Als nächstes bewegen Sie die Stufe zum SA-Kanal und fangen eine einzelne SA-Perle durch Falle 2. HINWEIS: Versuchen Sie, an der Schnittstelle der Puffer- und Perlenkanäle zu bleiben, um zu vermeiden, dass die bereits gefangene Perle verloren geht, oder um zu verhindern, dass mehrere Perlen durch dieselbe Falle gefangen werden.</li>
	<li>Sobald die Perlen der richtigen Größe erfasst sind, bewegen Sie sich zum Pufferkanal und stoppen Sie den laminaren Fluss. Führen Sie als Nächstes eine Kraftkalibrierung durch, um die Fallensteifigkeit zu überprüfen. Die jeweiligen Steifigkeitswerte sollten sich in der x/y-Achse nicht um mehr als 10-15% unterscheiden. HINWEIS: Passen Sie die Laserleistung oder den Lasersplit zwischen den Fallen entsprechend der Perlengröße an. Die Kraftkalibrierung muss nicht für jedes Perlenpaar durchgeführt werden, solange die Perlenschablonen übereinstimmen (Ähnlichkeitswert &gt; 0,9). Es sollte jedoch regelmäßig oder zumindest jedes Mal durchgeführt werden, wenn die Assay-Bedingungen geändert werden.</li>
	<li>Fangen Sie an, nach einem Seil zu fischen, indem Sie die Perlen nahe beieinander bewegen, einige Sekunden warten und sie dann wieder auseinander bewegen, wiederholen, bis ein Seil gebildet ist. Eine Tetherbildung führt zu einer Erhöhung der gemessenen Kraft, wenn die beiden Perlen voneinander weggezogen werden. HINWEIS: Um die Bildung mehrerer Haltegurte zu vermeiden, sollten die Perlen nicht zu nahe bewegt werden. Nach dem Fangen eines Seils zwischen den beiden Perlen kann die Tetherqualität überprüft werden, indem das überdehnte Plateau gefunden wird. Das Plateau sollte zwischen 50 und 60 pN für ein einzelnes Seil liegen.</li>
	<li>Nachdem Sie ein Halteband erhalten haben, starten Sie die Messung. Je nach untersuchtem Phänomen sollten unterschiedliche Messaufbauten gewählt werden (Abbildung 1B-D). HINWEIS: Normalerweise wird zu Beginn des Experiments ein Force-Ramp-Experiment durchgeführt, um die Tether-Qualität zu überprüfen und das Verhalten zu untersuchen. Danach kann man auch die Experimente mit konstanter Kraft oder konstanter Position starten, um die Zustandsübergänge weiter zu untersuchen. Sobald eine ausreichende Anzahl von Messungen an einer RNA-Probe durchgeführt wurde, um ihr Verhalten zu bestimmen, können markierte Faktoren zum System hinzugefügt werden, um konfokale Messungen durchzuführen.</li>
	<li>Um Fluoreszenzmessungen durchzuführen, schalten Sie die konfokalen Laser und die Photonenzähleinheit im optischen Pinzetteninstrument ein.</li>
	<li>Schalten Sie den Anregungslaser der gewünschten Wellenlänge in der Softwareschnittstelle ein und stellen Sie die Leistung des Lasers je nach Fluorophor auf 5% oder höher ein. HINWEIS: Senken Sie während der Nichtmessung die Leistungseinstellung des Anregungslasers auf 0%, um eine übermäßige Photoschädigung der Probe zu vermeiden.</li>
	<li>Beginnen Sie mit der Bildgebung des Beispiels mithilfe der Bildfunktionen der Software. HINWEIS: Um gut fokussierte Bilder zu erhalten, müssen die Brennebene des konfokalen Mikroskops und der optischen Fallen ausgerichtet werden. Zu diesem Zweck kann die Autofluoreszenz der Polystyrolperlen im blauen Laserkanal eingesetzt werden. Die Brennebene optischer Fallen wird in der z-Achse nach oben oder unten bewegt, bis das Bild der Perlen seinen höchsten Durchmesser erreicht. An dieser Stelle kann das Fluoreszenzsignal des zwischen den Kügelchen gebundenen Moleküls gemessen werden.</li>
	<li>Um die Kymographenfunktion zu verwenden, geben Sie die x-y-Position der Kymographenachse an, damit sie die Erkennung des Seils zwischen den Kügelchen ermöglicht.</li>
	<li>Während der gesamten Messung kann die Pufferzusammensetzung leicht geändert werden, indem entweder die Kügelchen in verschiedene Kanäle bewegt oder der im Mikrofluidiksystem zugeführte Puffer geändert wird.</li>
</ol>4. Datenanalyse
<ol><li>Rohdaten-Vorverarbeitung<ol>
<li>Mithilfe eines einfachen Skripts können Sie die Rohdaten so weit herunterrechnen, dass (i) eine schnellere nachfolgende Datenverarbeitung möglich ist, aber (ii) dennoch alle kritischen Informationen enthalten sind (Abbildung 4A). Normalerweise sind 100-5000 Hz für diesen Zweck geeignet. HINWEIS: Die Datenerfassungsfrequenz in optischen Pinzettenexperimenten ist oft höher als für die Analyse erforderlich - in den vorgestellten Experimenten ist die Datenerfassungsfrequenz standardmäßig auf 78 125 Hz eingestellt. Da der Speicherplatz begrenzt ist, ist es praktisch und zeitsparend, die Abtastrate der Daten zu reduzieren. Hier wurden die Rohdaten um den Faktor 30 heruntergerechnet.</li>
		<li>Verwenden Sie als Nächstes einen Signalfilter, um das hochfrequente Messrauschen des Signals zu reduzieren (Abbildung 4A). Passen Sie den Filtergrad und die Parameter der Grenzfrequenz entsprechend an, um die Datenausgabe verschiedener Experimente zu optimieren (Abbildung 5). HINWEIS: Unter den Signalfiltern ist Butterworth filter51 einer der am weitesten verbreiteten. Ein benutzerdefiniertes Python-Skript, das die Vorverarbeitung von Rohdaten ermöglicht, wird in den ergänzenden Daten bereitgestellt. Downsampling- und Signalfilterungsparameter (Grenzfrequenz, Filtergrad) müssen für verschiedene Experimente optimiert werden.</li>
	</ol></li>
	<li>Führen Sie für die Force-Ramp-Datenanalyse die folgenden Schritte aus.<ol>
<li>Markieren Sie die Schritte entweder manuell, indem Sie die entsprechenden Punkte im Kraftleitkurvendiagramm suchen oder benutzerdefinierte Skripts verwenden. Entfaltungsschritte zeichnen sich durch einen plötzlichen Kraftabfall in Kombination mit einer Erhöhung des Abstands in der Kraft-Weg-Kurve (FD) aus.</li>
		<li>Sobald sich entfaltende Ereignisse markiert sind, passen Sie verschiedene Bereiche der FD-Kurve mit geeigneten Modellen an (Abbildung 4D). HINWEIS: Für den Bereich vor dem ersten Entfaltungsschritt kann das Seil als "doppelsträngig" betrachtet werden und wird üblicherweise mit einem erweiterbaren Wurm-ähnlichen Kettenmodell (WLC) 47,52,53 angepasst. Die Teile nach dem ersten sich entfaltenden Ereignis gelten als eine Kombination aus doppelsträngigen Nukleotiden (Griffen) und einzelsträngigen Nukleotiden (entfaltetes RNA-Molekül). Daher ist die Datenanpassung komplexer - in der Regel wird eine Kombination aus 2 WLC-Modellen oder WLC- und freigelenkten Kettenmodellen (FJC) verwendet36,39,52. Das erweiterbare WLC-Modell hat zwei Hauptpassungsparameter, die Konturlänge (LC) und die Persistenzlänge (LP). Die Konturlänge entspricht der Länge des vollständig gedehnten Moleküls und die Persistenzlänge definiert die Biegeeigenschaften des interessierenden Moleküls. Das Modell kann mit der folgenden Gleichung (1) beschrieben werden. WLC kann verwendet werden, um das Verhalten sowohl von gefalteten als auch von entfalteten Regionen zu modellieren, obwohl für jeden dieser Bereiche ein separates Modell mit unterschiedlichen Parametern verwendet werden muss. (1) <img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/62589/62589eq01.jpg"> wobei x die Erweiterung, LC die Konturlänge, F die Kraft, LP die Persistenzlänge, kB die Boltzmann-Konstante, T die thermodynamische Temperatur und S der Dehnungsmodul ist. Das zweite Modell namens Freigelenkte Kette (FJC) wird häufig verwendet, um das Verhalten von entfalteten einzelsträngigen Regionen zu beschreiben. Es verwendet ähnliche Parameter der Polymere, behandelt aber jede Einheit der "Kette" als starren Stab, der hier den Nukleotiden der entfalteten einzelsträngigen Region entspricht. Die folgende Gleichung (2) beschreibt dieses Modell: (2) <img alt="Equation 2" src="/files/ftp_upload/62589/62589eq02.jpg"> HINWEIS: Unser Labor hat kürzlich einen Algorithmus entwickelt, der die Stapelverarbeitung der rohen Kraftrampendaten mit dem Namen "Practical Optical Tweezers Analysis TOol (POTATO)54" ermöglicht. Der Algorithmus führt die Daten herunter und filtert sie, identifiziert dann mögliche Entfaltungsschritte und führt schließlich die Datenanpassung durch. Der POTATO ist in einer benutzerfreundlichen grafischen Benutzeroberfläche (GUI) (https://github.com/REMI-HIRI/POTATO) eingebaut.</li>
	</ol></li>
	<li>Verarbeiten Sie Konstantkraftdaten wie folgt: HINWEIS: Die folgenden Anweisungen können analog auf Konstantlagedaten angewendet werden.<ol>
<li>Zeichnen Sie für die Konstantkraftdaten die Entfernung im Zeitverlauf auf (Abbildung 5). Ein Histogramm, das die Häufigkeit (Zählungen) verschiedener Konformationen über die relative Positionsänderung zeigt, ist eine nützliche Möglichkeit, verschiedene dominante und kleine Zustände zu charakterisieren (Abbildung 7).</li>
		<li>Passen Sie das Histogramm mit (mehreren) Gaußschen Funktionen an, um den Gesamtprozentsatz einzelner Konformer bei einer bestimmten Kraft zu schätzen (Abbildung 7C). Die Gaußschen Anpassungen, die mittlere Position und die Standardabweichung umreißen die kraftbezogene Beziehung zwischen verschiedenen Populationen. HINWEIS: Ein benutzerdefiniertes Python-Skript, das die Vorverarbeitung und grundlegende bimodale Gaußsche Anpassung von Konstantkraftdaten ermöglicht, wird in den ergänzenden Daten bereitgestellt. Parameter (Grenzfrequenz, Filtergrad, erwartete Mittelwerte, Standardabweichungswerte und Amplituden) müssen für verschiedene Experimente optimiert werden.</li>
		<li>Als nächstes verwenden Sie das Hidden Markov-Modell, um die Zustände weiter zu analysieren, die zusätzliche faltende Zwischenprodukte (Konformer) aufdecken können55. Für weitere Informationen über das Konstantkraft- und Hidden-Markov-Modell kann man sich auf 55,56,57,58 beziehen.</li>
	</ol></li>
</ol>

Die Autoren haben nichts preiszugeben.

Hier demonstrieren wir die Verwendung von fluoreszenzgekoppelten optischen Pinzetten, um Wechselwirkungen und dynamisches Verhalten von RNA-Molekülen mit verschiedenen Liganden zu untersuchen. Im Folgenden werden kritische Schritte und Einschränkungen der vorliegenden Technik diskutiert.
Kritische Schritte im Protokoll Wie bei vielen anderen Methoden ist die Qualität der Probe entscheidend, um zuverlässige Daten zu erhalten. Um Proben von höchstmöglicher Qualität zu erhalte...

Die Übertragung genetischer Information von DNA auf Proteine durch mRNAs ist ein komplexer biochemischer Prozess, der auf allen Ebenen durch makromolekulare Interaktionen innerhalb von Zellen präzise reguliert wird. Für die translationale Regulation spielen RNA-Protein-Interaktionen eine entscheidende Rolle, um schnell auf verschiedene Reize und Signale zu reagieren1,2. Einige RNA-Protein-Interaktionen beeinflussen die mRNA-Stabilität und verändern dadurch die Zeit, in der eine RNA translational aktiv ist. Andere RNA-Protein-Interaktionen sind mit Rekodierungsmechanismen wie Stop-Codon-Readthrough, Bypassing oder Programmed Ribosomal Frameshifting (PRF)3,4,5,6,7 assoziiert. Kürzlich wurde gezeigt, dass eine Reihe von RNA-bindenden Proteinen (RBPs) mit stimulierenden mRNA-Elementen und der Translationsmaschinerie interagieren, um zu bestimmen, wann und wie viel Rekodierung in der Zelle stattfinden wird7,8,9,10,11. Um die Rolle von RNA-bindenden Proteinen bei der Translation und deren Modulation der RNA-Struktur und -Stabilität zu analysieren, ist es daher von entscheidender Bedeutung, die Interaktionsprinzipien und mechanischen Eigenschaften dieser RNA-Proteinkomplexe im Detail zu untersuchen.
Jahrzehntelange Arbeit hat den Grundstein für die Untersuchung des mehrstufigen und mehrkomponentigen Prozesses der Translation gelegt, der auf einer komplizierten Kommunikation zwischen den RNA- und Proteinkomponenten der Translationsmaschinerie beruht, um Geschwindigkeit und Genauigkeit zu erreichen12,13,14. Ein entscheidender nächster Schritt zum Verständnis komplexer regulatorischer Ereignisse ist die Bestimmung der Kräfte, Zeitskalen und strukturellen Determinanten während der Translation mit hoher Genauigkeit12,15,16,17. Die Untersuchung der RNA-Konformationsdynamik und insbesondere wie trans-wirkende Hilfsfaktoren während der Translation auf die RNA-Struktur wirken, wurde durch das Aufkommen von Einzelmolekülwerkzeugen, einschließlich optischer Pinzetten oder Nullmodus-Wellenleiter, weiter beleuchtet16,17,18,19,20,21,22,23,24 ,25,26.
Optische Pinzetten (OT) stellen eine hochpräzise Einzelmolekültechnik dar, die angewendet wurde, um viele Arten von RNA-abhängigen dynamischen Prozessen einschließlich Transkription und Translation zu untersuchen26,27,28,29,30,31,32. Die Verwendung einer optischen Pinzette hat es ermöglicht, molekulare Wechselwirkungen, Nukleinsäurestrukturen und thermodynamische Eigenschaften, Kinetik und Energetik dieser Prozesse im Detail zu untersuchen16,17,22,33,34,35,36,37,38,39 . Der optische Pinzetten-Assay basiert auf dem Einklemmen mikroskopischer Objekte mit einem fokussierten Laserstrahl. In einem typischen OT-Experiment wird das interessierende Molekül zwischen zwei transparenten (normalerweise Polystyrol-) Kügelchen gebunden (Abbildung 1A)27. Diese Perlen werden dann von optischen Fallen aufgefangen, die sich wie Federn verhalten. So kann die auf das Molekül ausgeübte Kraft basierend auf der Verschiebung der Perle aus dem Zentrum des fokussierten Laserstrahls (Fallenzentrum) berechnet werden. Kürzlich wurden optische Pinzetten mit konfokaler Mikroskopie kombiniert (Abbildung 1B), was Fluoreszenz- oder Förster-Resonanzenergietransfermessungen (FRET) ermöglicht40,41,42. Dies eröffnet ein völlig neues Feld möglicher Experimente, die eine gleichzeitige Messung und damit eine präzise Korrelation von Kraftspektroskopie und Fluoreszenzdaten ermöglichen.
Hier demonstrieren wir Experimente mit der optischen Pinzette in Kombination mit konfokaler Mikroskopie, um Protein-RNA-Interaktionen zu untersuchen, die die translationale Frameshifting regulieren. Zwischen objektiv und Kondensator ermöglicht eine Durchflusszelle mit fünf Kanälen eine kontinuierliche Probenapplikation mit laminarer Strömung. Durch die mikrofluidischen Kanäle können verschiedene Komponenten direkt injiziert werden, was die Hands-on-Zeit verkürzt und während des gesamten Experiments einen sehr geringen Probenverbrauch ermöglicht.
Zunächst wird eine grundlegende Richtlinie zur Unterstützung des Designs von OT-Experimenten vorgeschlagen und Vorteile sowie Fallstricke verschiedener Setups diskutiert. Als nächstes werden die Aufbereitung von Proben und experimentelle Workflows beschrieben und ein Protokoll für die Datenanalyse bereitgestellt. Um ein Beispiel darzustellen, skizzieren wir die Ergebnisse von RNA-Dehnungsexperimenten zur Untersuchung des SARS-CoV-2 frameshifting RNA-Elements (Abbildung 2A) mit dem trans-agierenden Faktor, der kurzen Isoform des antiviralen Zinkfingerproteins (ZAP), das die Translation der viralen RNA aus einem alternativen Leserahmen verändert43. Darüber hinaus wird gezeigt, dass fluoreszenzmarkierte Ribosomen in diesem OT-konfokalen Assay verwendet werden können, was nützlich wäre, um die Prozessivität und Geschwindigkeit der Translationsmaschinerie zu überwachen. Die hier vorgestellte Methode kann verwendet werden, um die Wirkung verschiedener Puffer, Liganden oder anderer zellulärer Komponenten schnell zu testen, um verschiedene Aspekte der Translation zu untersuchen. Schließlich werden häufige experimentelle Fallstricke und deren Behebung diskutiert. Im Folgenden werden einige entscheidende Punkte im experimentellen Design skizziert.
Konstruktionsdesign Prinzipiell gibt es zwei gängige Ansätze, um ein OT-kompatibles RNA-Konstrukt zu erstellen. Der erste Ansatz verwendet ein langes RNA-Molekül, das mit komplementären DNA-Handles hybridisiert wird, wodurch ein Konstrukt aus zwei RNA/DNA-Hybridregionen entsteht, die eine einzelsträngige RNA-Sequenz in der Mitte flankieren (Abbildung 2B). Dieser Ansatz wird in den meisten OT-RNA-Experimenten verwendet33,44,45.
Der zweite Ansatz nutzt dsDNA-Griffe mit kurzen (ca. 20 nt) Überhängen15,17. Diese Überhänge werden dann mit dem RNA-Molekül hybridisiert. Obwohl komplizierter im Design, überwindet die Verwendung von dsDNA-Handles einige Einschränkungen des DNA / RNA-Hybridsystems. Prinzipiell können auch sehr lange Griffe (>10kb) realisiert werden, was für konfokale Messungen komfortabler ist. Darüber hinaus kann das RNA-Molekül an DNA-Handles ligiert werden, um die Tether-Stabilität zu erhöhen.
End-Labeling-Strategie Das Konstrukt muss über eine starke molekulare Wechselwirkung an Perlen gebunden werden. Während es Ansätze für die kovalente Bindung von Griffen an Perlen46 gibt, werden starke, aber nicht-kovalente Wechselwirkungen wie Streptavidin-Biotin und Digoxigenin-Antikörper häufig in OT-Experimenten verwendet15,33,35,45. Im beschriebenen Protokoll wird das Konstrukt mit Biotin oder Digoxigenin markiert, und die Kügelchen sind mit Streptavidin bzw. Antikörpern gegen Digoxigenin beschichtet (Abbildung 1A). Dieser Ansatz wäre für die Anwendung von Kräften bis zu etwa 60 pN (per Tether)47 geeignet. Darüber hinaus ermöglicht die Verwendung unterschiedlicher 5'- und 3'-Markierungsstrategien die Bestimmung der Ausrichtung des zwischen den Kügelchen gebildeten Seils17.
Proteinmarkierung für Fluoreszenzmessungen Für die konfokale Bildgebung gibt es mehrere häufig verwendete Ansätze zur Fluoreszenzmarkierung. Zum Beispiel können Fluorophore kovalent an Aminosäurereste gebunden sein, die nativ in Proteinen vorkommen oder durch ortsgerichtete Mutagenese durch eine reaktive organische Gruppe eingeführt werden. Thiol- oder Amin-reaktive Farbstoffe können zur Markierung von Cystein- bzw. Lysinresten verwendet werden. Es gibt mehrere reversible Schutzmethoden, um die Spezifität der Markierung zu erhöhen48,49, jedoch würden native Proteine typischerweise an mehreren Rückständen markiert. Obwohl die geringe Größe des Fluorophors einen Vorteil bieten kann, kann eine unspezifische Markierung die Proteinaktivität beeinträchtigen und somit die Signalintensität variieren49. Abhängig von der Markierungseffizienz kann die Signalintensität zwischen verschiedenen Experimenten variieren. Daher sollte vor dem Experiment eine Aktivitätsprüfung durchgeführt werden.
Falls das Protein von Interesse ein N- oder C-terminales Tag enthält, wie z. B. ein His-Tag oder ein Streptokokken-Tag, stellt die spezifische Kennzeichnung dieser Tags einen weiteren beliebten Ansatz dar. Darüber hinaus verringert die markierungsorientierte Markierung die Wahrscheinlichkeit, dass das Fluorophor die Proteinaktivität stört, und kann die Löslichkeit verbessern49. Die Tag-spezifische Markierung führt jedoch in der Regel zu monofluorophor markierten Proteinen, die schwer nachzuweisen sein können. Eine andere Möglichkeit der spezifischen Markierung kann durch den Einsatz von Antikörpern erreicht werden.
Aufbau der Mikrofluidik Die Kombination von OT mit einem Mikrofluidik-System ermöglicht einen schnellen Übergang zwischen verschiedenen experimentellen Bedingungen. Darüber hinaus nutzen Stromsysteme die Aufrechterhaltung der laminaren Strömung in der Durchflusszelle, was das Mischen von Flüssigkeiten aus anderen Kanälen in senkrechter Richtung relativ zur Strömungsrichtung verhindert. Daher ist die laminare Strömung besonders vorteilhaft für das experimentelle Design. Derzeit werden häufig Flusszellen mit bis zu 5 Kanälen eingesetzt (Abbildung 3).

<table><tbody><tr><td>Bacterial Stämme</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>E. coli HB101</td><td>Laborsammlung</td><td>N/A</td><td>Klonierung der Vektoren</td></tr><tr><td>Chemikalien und Enzyme</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Natriumchlorid</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>31424</td><td>Puffer</td></tr><tr><td>Biotin-16-dUTP</td><td>Roche</td><td>11093070910</td><td>Biotinylierung</td></tr><tr><td>BSA</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A4737</td><td>Puffer</td></tr><tr><td>Katalase</td><td>Lumicks</td><td>N/A</td><td>Sauerstofffängersystem</td></tr><tr><td>Dithiothreitol (DTT)</td><td>Melford Labs</td><td>D11000</td><td>Puffer</td></tr><tr><td>DNAse I aus der bovinen Bauchspeicheldrüse</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D4527</td><td>in vitro Transkription</td></tr><tr><td>dNTPs</td><td>Th.Geyer</td><td>11786181</td><td>PCR</td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E9884</td><td>Puffer</td></tr><tr><td>Formamid</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>11814320001</td><td>Puffer</td></tr><tr><td>Glukose</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G8270-1KG</td><td>Sauerstofffängersystem</td></tr><tr><td>Glukose-Oxidase</td><td>Lumicks</td><td>N/A</td><td>Sauerstofffängersystem</td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Carl Roth</td><td>HN78.3</td><td>Puffer</td></tr><tr><td>Magnesiumchlorid</td><td>Carl Roth</td><td>2189.1</td><td>Puffer</td></tr><tr><td>Phusion DNA-Polymerase</td><td>NEB</td><td>M0530L</td><td>Gibson-Assemblierung, Klonierung</td></tr><tr><td>Kaliumchlorid</td><td>Merck</td><td>529552-1KG</td><td>Puffer</td></tr><tr><td>PrimeSTAR GXL DNA-Polymerase</td><td>Takara Bio Clontech</td><td>R050A</td><td>PCR</td></tr><tr><td>Pyrophosphotase, thermostabil, anorganisch</td><td>NEB</td><td>M0296L</td><td>in vitro Transkription</td></tr><tr><td>RNase Inhibitor</td><td>Molox</td><td>1000379515</td><td>Puffer</td></tr><tr><td>rNTPS</td><td>life technologies</td><td>R0481</td><td>in vitro Transkription</td></tr><tr><td>Natriumthiosulophat</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S6672-500G</td><td>Bleichmitteldeaktivierung</td></tr><tr><td>Sytox Green</td><td>Lumicks</td><td>N/A</td><td>konfokale Messungen</td></tr><tr><td>T4 DNA Polymerase</td><td>NEB</td><td>M0203S</td><td>Biotinylierung</td></tr><tr><td>T5 Exonuklease</td><td>NEB</td><td>M0363S</td><td>Gibson-Assemblierung, Klonierung</td></tr><tr><td>T7-RNA-Polymerase</td><td>Eigenhergestellte</td><td>N/</td><td>A-In-vitro-Transkription</td></tr><tr><td>Taq-DNA-Polymerase</td><td>NEB</td><td>M0267S</td><td>PCR</td></tr><tr><td>Taq-Ligase</td><td>Biozym</td><td>L6060L</td><td>Gibson-Assemblierung, Klonierung</td></tr><tr><td>TWEEN 20 BioXtra</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P7949</td><td>Puffer</td></tr><tr><td>Kits</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Monolithisches Proteinmarkierungskit RED-NHS 2. Generation (aminreaktiv)</td><td>Nanotemper</td><td>MO-L011</td><td>Wird für die Ribosomenmarkierung</td></tr> verwendet <tr><td>Purefrex 2.0</td><td>GeneFrontier</td><td>PF201-0.25-EX</td><td>Ribosomen werden für die Markierung</td></tr> <tr><td>verwendetOligonukleotide</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>5' Griff T7 forward</td><td>Microsynth</td><td>Sonderanfertigung</td><td>5' - CTTAATACGACTCACTATAGGTC CTTTCTGTGGACGCC - 3', zur Generierung einer OT in vitro Transkriptionsvorlage in der PCR 1</td></tr><tr><td>3' Griff reverse</td><td>Microsynth</td><td>Custom Order</td><td>5' -&nbsp; GTCAAAGTGCGCCCCGTTATCC - 3', zur Generierung eines OT in vitro Transkriptions-Templates in der PCR 1</td></tr><tr><td>5' Handle Forward</td><td>Microsynth</td><td>Custom Order</td><td>5' - TCCTTTCTCTGTGGACGCCGC - 3' , zur Generierung von 5' Handle in PCR 2</td></tr><tr><td>5' Handle Reverse</td><td>Microsynth</td><td>Custom Order</td><td>5' - CATAAATACCTCTTTACTAATATA TATACCTTCGTAAGCTAGCGT - 3', zur Generierung von 5' Handle in PCR 2</td></tr><tr><td>3' Griff vorn</td><td>Microsynth</td><td>Custom Order</td><td>5' - ATCCTGCAACCTGCTCTTCGCC AG - 3', zur Generierung von 3' Griff in PCR 3</td></tr><tr><td>3' Griff umgekehrt 5' markiert mit Digoxigenin</td><td>Microsynth</td><td>custom order</td><td>5' -[Dig]-GTCAAAGTGCCCCCGTTATCC - 3', verwendet zur Generierung von 3'-Handle in der PCR 3</td></tr><tr><td>DNA-Vektoren</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>pMZ_OT</td><td>hergestellt im eigenen Haus</td><td>N/A</td><td>weitere Beschreibung in "Structural studies of Cardiovirus 2A protein reveal the molecular basis for RNA recognition and translational control" Chris H. Hill, Sawsan Napthine, Lukas Pekarek, Anuja Kibe, Andrew E. Firth, Stephen C. Graham, Neva Caliskan, Ian Brierley bioRxiv 2020.08.11.245035; doi: https://doi.org/10.1101/2020.08.11.245035</td></tr><tr><td>Software and Algorithms</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Atom</td><td>https://atom.io/packages/ide-python</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Bluelake</td><td>Lumicks</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Graphpad</td><td>https://www.graphpad.com/</td> <td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>InkScape 0.92.3</td><td>https://inkscape.org/</td> <td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Matlab</td><td>https://www.mathworks.com/products/matlab.html</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>POTATO</td><td></td> https://github.com/lpekarek/POTATO.git <td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>RNAstructure</td><td>https://rna.urmc.rochester.edu/RNAstructure.html</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Spyder</td><td>https://www.spyder-ide.org/</td> <td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Other</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Streptavidin-beschichtete Polystyrolpartikel, 1,5-1,9 & Mikro; m, 5 ml, 1,0 % w/v</td><td>Spherotech</td><td>SVP-15-5</td><td></td></tr><tr><td>Anti-Digoxigenin-beschichtete Polystyrolpartikel, 2,0-2,4 & Mikro; m, 2 ml, 0,1% w/v</td><td>Spherotech</td><td>DIGP-20-2</td><td></td></tr><tr><td>Spritzen</td><td>VWR</td><td>TERUMO SS+03L1</td><td></td></tr><tr><td>Devices</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>C-Trap</td><td>Lumicks</td><td>N/A</td><td>&nbsp; Optische Pinzette gekoppelt mit konfokaler Mikroskopie</td></tr></tbody></table>

optische pinzette untersucht rna-protein-interaktionen in der translationsregulation

Optical Tweezers to Study RNA-Protein Interactions in Translation Regulation

RNA nimmt verschiedene strukturelle Falten an, die für ihre Funktionen essentiell sind und dadurch verschiedene Prozesse in der Zelle beeinflussen können. Darüber hinaus kann die Struktur und Funktion einer RNA durch verschiedene transaktive Faktoren wie Proteine, Metaboliten oder andere RNAs moduliert werden. Frameshifting-RNA-Moleküle zum Beispiel sind regulatorische RNAs in kodierenden Regionen, die Ribosomen direkt in einen alternativen offenen Leserahmen übersetzen und dadurch als Genschalter fungieren. Sie können auch verschiedene Falten annehmen, nachdem sie an Proteine oder andere Transfaktoren gebunden sind. Um die Rolle von RNA-bindenden Proteinen bei der Translation zu analysieren und wie sie die RNA-Struktur und -Stabilität modulieren, ist es wichtig, das Zusammenspiel und die mechanischen Eigenschaften dieser RNA-Protein-Komplexe gleichzeitig zu untersuchen. Diese Arbeit zeigt, wie man mit einer einzelnen Molekül-Fluoreszenz-gekoppelten optischen Pinzette die Konformations- und thermodynamische Landschaft von RNA-Protein-Komplexen mit hoher Auflösung erforscht. Als Beispiel wird die Interaktion des SARS-CoV-2 programmierten ribosomalen Frameshifting-Elements mit der trans-wirkenden Faktor-Kurzisoform des antiviralen Zinkfingerproteins herausgearbeitet. Darüber hinaus wurden fluoreszenzmarkierte Ribosomen mit der konfokalen Einheit überwacht, was letztendlich die Untersuchung der Translationsdehnung ermöglichen würde. Der fluoreszenzgekoppelte OT-Assay kann weit verbreitet eingesetzt werden, um verschiedene RNA-Proteinkomplexe oder trans-wirkende Faktoren zu erforschen, die die Translation regulieren, und könnte Studien zur RNA-basierten Genregulation erleichtern.

In diesem Abschnitt liegt der Schwerpunkt hauptsächlich auf Messungen von RNA-Protein/Liganden-Wechselwirkungen durch die fluoreszenzoptischen Pinzetten. Für eine Beschreibung allgemeiner Experimente mit optischen RNA-Pinzetten und entsprechenden repräsentativen Ergebnissen siehe 32. Für eine detailliertere Erörterung der RNA/DNA-Protein-Interaktionen siehe auch 1,2,26,59,60</...

Dieses Protokoll stellt einen vollständigen experimentellen Workflow für die Untersuchung von RNA-Protein-Interaktionen mit optischen Pinzetten dar. Mehrere mögliche Versuchsanordnungen werden skizziert, einschließlich der Kombination von optischen Pinzetten mit konfokaler Mikroskopie.

Optische Pinzette untersucht RNA-Protein-Interaktionen in der Translationsregulation

RNA adopts diverse structural folds, which are essential for its functions and thereby can impact diverse processes in the cell. In addition, the ...

Das übergeordnete Ziel des folgenden Methodenartikels ist es, ein Protokoll zu demonstrieren, das nützlich ist, um RNA-Wechselwirkungen mit Proteinen oder anderen Faktoren unter Verwendung einer optischen Pinzette in Verbindung mit konfokaler Mikroskopie zu untersuchen. In den letzten zehn Jahren wurden mehrere ausgeklügelte Techniken entwickelt, um die Eigenschaften einzelner Makromoleküle zu untersuchen. Eine dieser Techniken ist eine optische Pinzette mit einem Molekül.Mit der neuen fluoreszenzgestützten optischen Pinzette können nicht nur kräfte, die für die Entfaltung von RNA-Molekülen benötigt werden, sondern auch Bindungsereignisse während der Translation detailliert überwacht werden. Hier konzentrieren wir uns auf Messungen, bei denen RNA-Moleküle mit und ohne Transaktionsfaktoren gedehnt werden, die die Translation regulieren. Wir veranschaulichen auch, wie die Technik angewendet werden kann, um die Translation mit markierten Ribosomen zu überwachen.Das Protokoll wird von zwei Doktoranden meiner Gruppe, Lukas Pekarek und Stefan Park, demonstriert. In diesem Video führen wir Sie durch die Einrichtung und Durchführung eines optischen Pinzettenexperiments. Wir skizzieren auch den einfachen Datenanalyse-Workflow.Der Vorteil dieser Technik ist, dass sie unkompliziert und robust ist. Ein Molekül wird zwischen zwei Kügelchen gebunden, im Fokus von Laserstrahlen festgeschnallt, und in sogenannten Force-Ramp-Experimenten können Änderung und Kraft bei Verschiebung präzise gemessen werden. Sekundärstrukturen innerhalb eines Seils entfalten sich bei einer bestimmten Kraft, abhängig von der inneren Energie des Moleküls.Dieser dynamische Übergang zwischen mehreren Strukturen kann mit konstanten Kraftmessungen weiter untersucht werden. Darüber hinaus kann der parallele Einsatz der Fluoreszenzbildgebung genutzt werden, um Bindungsereignisse in Echtzeit sichtbar zu machen. Ein ausgeprägtes Kraft-Weg-Profil eines Seils kann nach der Bindung potenzieller Transaktionsfaktoren, die seine Stabilität beeinflussen, variieren.Zunächst muss die interessierende RNA in einen DNA-Vektor kloniert werden. Vor und nach dieser Sequenz werden zusätzliche Teile, die Griffe benötigt, um das endgültige DNA-RNA-Konstrukt zwischen den Kügelchen zu binden. Nach erfolgreichem Klonen und Amplifikation des Plasmids werden drei verschiedene PCR-Reaktionen durchgeführt.Mischen Sie für jede PCR-Reaktion die Reagenzien gemäß Tabelle eins im Protokoll. Führen Sie die PCR in 50 Mikroliter-Aliquots in einem geeigneten thermischen Cycler durch. Die erste führt zu einer doppelsträngigen DNA des gesamten Konstrukts mit dem T7-Promotor für die anschließende In-vitro-Transkription.Die zweite PCR erzeugt die fünf Prime-Griffe. Während die letzte Reaktion zu den drei Prime-Griffen führt. Sowohl 5 Prime- als auch 3 Prime-Griffe müssen entsprechend den verwendeten Perlen gekennzeichnet werden.Die drei Prime-Griffe werden während der PCR mit einem Digoxigenin-markierten Reverse-Primer markiert, und die fünf Prime-Griffe müssen in einem zusätzlichen Schritt durch Biotinylierung markiert werden. Die drei Prime-Biotinylierung der fünf Prime-Griffe erfolgt unter Verwendung von T40 und einer Polymerase. Die Reaktion wird für ein bis zwei Stunden bei Raumtemperatur durchgeführt.Als nächstes führen Sie die In-vitro-Transkription mit T7-Polymerase durch. Inkubieren Sie die Reaktion bei 37 Grad für zwei bis vier Stunden, abhängig von der Länge der RNA. In einem letzten Schritt werden die Handles mit der RNA aus der in-vitro-Transkription geglüht, um das endgültige DNA-RNA-Konstrukt mit der einzelsträngigen Region von Interesse zwischen den doppelsträngigen Handles zu erhalten.Um den gewünschten RNA-DNA-Hybrid zu glühen, mischen Sie die Griffe und die RNA in Glühpuffer. Die Glühmischung 10 Minuten lang auf 85 Grad erhitzen und dann die Probe langsam auf vier Grad abkühlen lassen. Mischen Sie die geglühte Probe mit 1/10 Volumen von drei molaren Natriumacetat und drei Volumen eiskaltem Ethanol und inkubieren Sie minus 80 Grad für mindestens eine Stunde.Zentrifugieren Sie die Proben bei 15.000 xg für 30 Minuten bei vier Grad. Entsorgen Sie den Überstand und trocknen Sie das Pellet unter Vakuum. Kleine Aliquots des resuspendierten Pellets werden in flüssigem Stickstoff eingefroren und bis zu ihrer Verwendung bei minus 80 Grad gehalten.Entfernen Sie zuerst das Bleichmittel aus den Spritzen und füllen Sie einen ml RNase-freies Wasser ein. Fügen Sie 50 Mikroliter 0,5 molares Natriumthiosulfat hinzu und waschen Sie das System mit einem Riegel. Achten Sie darauf, dass das mikrofluidische System niemals trocken läuft, um Luftblasen im System zu vermeiden.Als nächstes verwerfen Sie die verbleibende Natriumthiosulfatlösung und ersetzen Sie die Spritzen durch neue. Anschließend erneut mit mindestens 0,5 ml RNase-freiem Wasser waschen. Um das optische System der Maschine einzurichten, geben Sie zwei Tropfen Tauchöl auf das Objektiv.Setzen Sie die Flusszelle ein und heben Sie das Ziel an, bis die Flüssigkeit die Flusszelle berührt. Dann geben Sie zwei Tropfen Tauchöl auf die Durchflusszelle. Schalten Sie nun die Trap-Steuereinheit und den Trapping-Laser ein.Das Objektiv wird mit dem Z-Finder-Tool der Diagnosekameras der Maschine eingestellt. Durch Drehen der Mikroschraube wird die Z-Achse auf die Mitte der Kammer zwischen der zweiten und der dritten Reflexion eingestellt. Wo die Brechungsringe am größten sind.Schalten Sie die Diagnosekameras in den Mondmodus und reduzieren Sie den Fanglaser auf etwa 50%, dann senken Sie den Kondensator und passen Sie seine Position an, so dass Sie ungefähr 10 Lichtbänder sehen. Die Messkammer hat fünf Kanäle, und vor dem Experiment sollten verschiedene Rüstmöglichkeiten in Betracht gezogen werden. Für ein einfaches Force-Ramp-Experiment ist beads-buffer-beads eine bequeme Kanalanordnung.Für Messungen mit der vierten Verbindung, wie fluoreszierende Ribosomen oder Transaktionsfaktoren, ist der Perlen-Perlen-Pufferfaktor eine bessere Anordnung, aber es macht es schwieriger, Perlen zu fangen. Ein Aliquot des geglühten Konstrukts wird mit drei Mikroliter AD-Perlensuspension, einem Mikroliter RNase-Inhibitor und acht Mikroliter des Assay-Puffers bei Raumtemperatur für 10 bis 20 Minuten inkubiert. Anschließend wird die Probe in 500 Mikroliter Assay-Puffer verdünnt und in den jeweiligen Kanal gegeben.Für die zweite Art von Kügelchen werden 0,8 Mikroliter Assay-Kügelchen mit einem ml Assay-Puffer gemischt und in den entsprechenden Kanal verabreicht. Die Kanäle werden geöffnet und mit niedrigem Druck gewaschen. Schalten Sie nun den Fanglaser ein.Um Perlen aufzufangen, werden die Laser voneinander entfernt und eine AD-Perle wird in Falle eins gefangen. Als nächstes wird die Stufe zum SA-Perlenkanal bewegt und eine Perle wird in Falle zwei gefangen. Um den Verlust der Perlen zu vermeiden oder eine zweite in derselben Falle zu fangen, wird die Bühne in den Pufferkanal verschoben und alle Kanäle werden geschlossen.Im Puffer wird eine Trap-Kalibrierung durchgeführt. Die gefangenen Perlen sollten als visuelle Vorlagen für nachfolgende Messungen festgelegt werden. Und der Ähnlichkeitswert sollte zwischen den Messungen über 90% gehalten werden, um die Vergleichbarkeit zu gewährleisten.Schließlich werden die Perlen näher zusammengeschoben und man kann anfangen, ein einzelnes Seil zu fangen. Dies geschieht, indem die Perlen für einige Sekunden nahe bewegt werden und dann langsam wieder die Perlen verlassen werden. Eine Tetherbildung führt zu einer Erhöhung der gemessenen Kraft, wenn die beiden Perlen voneinander weggezogen werden.Die Anzahl und Qualität der Haltegurte kann überprüft werden, indem das überdehnte Plateau gefunden und die Flugbahn mit dem frei gelenkigen Ketten- oder wurmartigen Kettenmodell verglichen wird. Das überdehnte Plateau sollte zwischen 50 und 60 Piconewton für ein einzelnes Seil liegen. Um die Fluoreszenzmessungen durchzuführen, schalten Sie die konfokalen Laser und die Photonenzählung an der Einheits- und optischen Pinzette ein.Schalten Sie anschließend den Anregungslaser der gewünschten Wellenlänge und die Softwareschnittstelle ein und stellen Sie die Leistung des Lasers je nach Fluorophor auf 5% oder höher ein. Nun kann die Bildgebung über die Bild- oder Kymographenfunktionen der Software gestartet werden. Um gut fokussierte Bilder zu erhalten, stellen Sie sicher, dass die Brennebene des konfokalen Mikroskops und die optischen Fallen ausgerichtet sind.Zu diesem Zweck kann die Autofluoreszenz der Polystyrolperlen im blauen Laserkanal eingesetzt werden. Bewegen Sie sich mit der Brennebene der optischen Fallen auf und ab, bis die Autofluoreszenz der Perlen ihren höchsten Durchmesser erreicht. An dieser Stelle können die am angebundenen Molekül ablaufenden Fluoreszenzsignale detektiert werden.Für beide Funktionen ist es wichtig, die entsprechenden Interessensgebiete auszuwählen. Während der gesamten Messung kann die Pufferzusammensetzung leicht geändert werden, indem entweder die Kügelchen in verschiedene Kanäle bewegt werden oder indem der im mikrofluidischen System bereitgestellte Puffer geändert wird. Um Photobleichen zu vermeiden, schalten Sie den Anregungslaser immer aus, wenn Sie nicht messen.Die Rohdatenausgabe des Geräts enthält oft viel Rauschen. Um verstreute Daten weiter analysieren zu können, muss man sie daher zunächst vorverarbeiten. Der erste Schritt besteht darin, die Proben zu entnehmen und die Daten mit dem Tiefpass-Butterworth-Filter zu filtern, gute Ergebnisse wurden erzielt.Für Kraftrampenexperimente müssen die Entfaltungsereignisse an den entsprechenden gefalteten und entfalteten Bereichen der ersten Abstandskurve markiert werden, die mit wurmartigen Ketten- oder freigelenkten Kettenmodellen angebracht werden können. Für die konstanten Kraftdaten kann der Abstand über die Zeit aufgezeichnet werden und es ist nützlich, ein Histogramm zu erstellen, um die vorherrschende Konformation bei einer gegebenen Kraft zu quantifizieren. Hier wird gezeigt, dass die Filterparameter entscheidend sind, um verschiedene Falzzustände zu unterscheiden.Um besser zu verstehen, was mit dieser Technik erreicht werden kann, werden einige repräsentative Ergebnisse gezeigt. So sieht eine Standard-Kraft-Abstands-Kurve aus einem Kraftrampenexperiment aus. In diesem Fall haben wir das SARS-Coronavirus-2-Frame-Shifting-Element untersucht.Wir beobachteten die Entfaltung in mehreren Schritten um 15 Piconewton. Wenn die Richtung umgekehrt ist und die Perlen wieder näher kommen, faltet sich das Seil mit etwas geringerer Kraft wieder zurück. Als wir die gleiche RNA in Gegenwart des antiviralen Zinkfingerproteins ZAP maßen, wurde ein ähnliches Muster der Entfaltung beobachtet.Aber die sekundäre Struktur der RNA faltete sich nicht neu. Dies ist ein gutes Beispiel, um zu zeigen, welchen großen Einfluss die Proteinbindung auf die RNA-Kinetik haben kann. Anhand konstanter Kraftdaten kann die sich entfaltende Kinetik weiter untersucht werden.Die Entfernung über die Zeit wird für verschiedene Kräfte aufgetragen und das Histogramm der verschiedenen beobachteten Zustände wird auf der rechten Seite hinzugefügt. Bei 10 Piconewton befindet sich die RNA vollständig im gefalteten Zustand. Bei 11,5 Piconewton wechselt es zwischen den Zuständen, und bei 13 Piconewton befindet sich die RNA dauerhaft in einem entfalteten Zustand.Als jedoch das SARS-Coronavirus-2-Frame-Shifting-Element zusammen mit ZAP gemessen wurde, befand sich die RNA bei 11 Piconewton vollständig in einem entfalteten Zustand und zeigte bei 10 Piconewton sogar nur einen sehr geringen Übergang zu einem gefalteten Zustand. Dies deutet darauf hin, dass ZAP an das einzelsträngige Rahmenverschiebungselement bindet und die Bildung einer Sekundärstruktur verhindert. Schließlich werden wir uns einige optische Pinzettendaten in Verbindung mit konfokaler Mikroskopie ansehen.In diesem Experiment wurde ein Fluoreszenzfarbstoff verwendet, der doppelsträngige Nukleinsäuren markiert, nicht spezifisch mit zunehmender Kraft. Der Kymograph zeigt, dass, wenn die Perlen voneinander entfernt werden, die Fluoreszenzintensität zunimmt und vollständig verschwindet, sobald das Band zu stark gedehnt wird und bricht. In der letzten Abbildung wurden fluoreszierend markierte Ribosomen durch Kanal vier hinzugefügt.In diesem Experiment wurde eine spezifische Ribosomenbindung an den RNA-Tether beobachtet. Wir hoffen, dass dieses Video Ihnen einen Einblick in die optische Pinzette gegeben hat und was mit dieser unglaublichen Technik durchgeführt werden kann.

optical-tweezers-to-study-rna-protein-interactions-translation

Research

Forschung

JoVE Journal

Biochemistry

Biochemie

Dieses Video zeigt einen in vitro RNA-Pulldown-Assay zur Identifizierung von RNA-bindenden Proteinen (RBPs), die mit den Adenylat-Uridylat-Rich Element (ARE)-Sequenzen in mRNA interagieren. Die Ziel-RBPs aus einem Zelllysat werden mit einer RNA-Sonde gemischt, um RNA-Protein-Komplexe zu bilden. Die Komplexe werden mittels Affinitätsreinigung isoliert, wobei die Affinität der Desthiobiotin-Markierung der RNA-Sonde zu einem Streptavidin-markierten magnetischen Kügelchen genutzt wird.

RNA-Protein-Pull-Down-Assay zur Isolierung von RNA-bindenden Proteinen mittels Affinitätsextraktion

Hier beschreiben wir die Instrumentierung und Verfahren zum Nachweis einzelner fluoreszenzmarkierten Proteinmoleküle in Wechselwirkung mit einem einzelnen DNA-Molekül zwischen den zwei optisch eingeschlossene Mikrokügelchen suspendiert.

Die Kombination von Einzelmolekül-Imaging und Manipulation für das Studium der Protein-DNA-Wechselwirkungen

Optische Pinzetten wurden verwendet, um die RNA-Faltung zu untersuchen, indem einzelne Moleküle von ihren 5'- und 3'-Enden gedehnt wurden. Hier werden gängige Verfahren zur Synthese von RNA-Molekülen für die Pinzette, zur Kalibrierung des Instruments und Methoden zur Manipulation einzelner Moleküle beschrieben.

Nanomanipulation von RNA-Einzelmoleküle durch Optische Pinzetten

Dieses Manuskript beschreibt eine Methode zum visualisieren und lokalisierte Übersetzung Veranstaltungen in subzelluläre Kompartimente zu quantifizieren. In diesem Manuskript vorgeschlagene Vorgehensweise erfordert eine grundlegende confocal imaging-System und Reagenzien und ist schnell und kostengünstig.

Quantitative Immunfluoreszenz Maßnahme Global lokalisierte Übersetzung

Toeprinting zielt darauf ab, die Möglichkeit der in-vitro- Messung transkribierte RNA zu Form Übersetzung Einleitung komplexe mit Ribosomen unter den unterschiedlichsten Bedingungen. Dieses Protokoll beschreibt eine Methode für Toeprinting Säugetieren RNA und kann zur GAP-abhängige und IRES-driven Übersetzung zu studieren.

Toeprinting Analyse der Übersetzung Einleitung Komplexbildung auf Säugetier-mRNAs

Ein Tandem RNA Isolierung (Reise) für die Verwertung von endogen gebildeten mRNA-Protein-komplexe Vorgehensweise wird. Speziell, RNA-Protein-komplexe sind vernetzt in VivoPolyadenylated RNAs sind isoliert aus Extrakten mit oligo(dT) Perlen und besonderen mRNAs werden mit modifizierten RNA antisense Oligonukleotide erfasst. Proteine gebunden, mRNAs werden vom Immunoblot Analyse erkannt.

Ein Oligonukleotid-basierte Tandem RNA Isolierung Vorgehensweise eukaryotischen mRNA-Protein-komplexe

Bei dieser Methode quantifizieren wir die Bindungsaffinität von RNA-bindenden Proteinen (RBPs) zu kognazierenden und nicht-kogatierten Bindungsstellen mit einem einfachen, live, Reporter-Assay in Bakterienzellen. Der Test basiert auf der Unterdrückung eines Reportergens.

Ein Assay zur Quantifizierung der Protein-RNA-Bindung in Bakterien

Dual DNA Lineal Assay wird entwickelt, um die mRNA-Position während der ribosomen Translokation zu bestimmen, die auf den Dissoziationskräften der gebildeten DNA-mRNA-Duplexe beruht. Mit einer Single-Nukleotid-Auflösung und der Fähigkeit, beide Enden der mRNA zu erreichen, kann es mechanistische Einblicke für ribosome translokation liefern und andere Nukleinsäureverschiebungen untersuchen.

Dual DNA Lineale zur Untersuchung des Mechanismus der Ribosomentranslokation mit Single-Nukleotid-Auflösung

Der Einzelmolekül-Fluoreszenz-Energietransfer ist eine Methode, die die tRNA-Dynamik während der ribosomalen Proteinsynthese verfolgt. Durch die Verfolgung einzelner Ribosomen werden inhomogene Populationen identifiziert, die Aufschluss über Mechanismen geben. Diese Methode kann verwendet werden, um biologische Konformationsänderungen im Allgemeinen zu verfolgen, um dynamische Funktionsbeziehungen in vielen anderen komplexen Biosystemen aufzudecken. Einzelmolekülmethoden können...

Einzelmolekül-Fluoreszenz-Energieübertragungsstudie zur Ribosomenproteinsynthese

Co-translationale Interaktionen spielen eine entscheidende Rolle bei Modifikationen, Targeting-, Faltungs- und Montagepfaden der entstehenden Kette. Hier beschreiben wir Selective Ribosome Profiling, eine Methode zur in vivo, direkten Analyse dieser Wechselwirkungen im Modell Eukaryote Saccharomyces cerevisiae.

Globale Identifizierung von co-translationalen Interaktionsnetzwerken durch selektives Ribosomenprofiling

In dieser Arbeit stellen wir eine optimierte in vitro Methode vor, um Proteininteraktoren spezifischer RNA-Sequenzen aufzudecken, zu quantifizieren und zu validieren, wobei Gesamtproteinextrakt aus menschlichen Zellen, Streptavidin-Kügelchen, die mit biotinylierter RNA beschichtet sind, und Massenspektrometrie-Analysen verwendet werden.

Eine optimierte quantitative Pull-Down-Analyse von RNA-bindenden Proteinen unter Verwendung kurzer biotinylierter RNA

Lernen Sie optische Pinzetten zur Untersuchung von RNA-Protein-Interaktionen in der Translationsregulation. Diese Methode ermöglicht präzise Kraftmessungen bei der RNA-Entfaltung und Bindungsereignissen in Echtzeit.

Optische Pinzette untersucht RNA-Protein-Interaktionen in der Translationsregulation

Weitere Videos entdecken