Basophiler Aktivierungstest zur Allergiediagnostik

Der basophile Aktivierungstest ist ein ergänzender In-vitro-diagnostischer Test zur Beurteilung von IgE-vermittelten allergischen Reaktionen, die sich als nützlich für Reaktionen erwiesen haben, die durch Medikamente, Lebensmittel oder Inhalationsmittel sowie bei einigen Formen der chronischen Urtikaria induziert werden. Dieser Test basiert auf der Bestimmung der basophilen Reaktion auf eine Allergen- oder Arzneimittelvernetzungs-IgE-Aktivierung durch die Messung von Aktivierungsmarkern durch Durchflusszytometrie. Der basophile Aktivierungstest kann ein nützliches und ergänzendes Werkzeug sein, um kontrollierte Provokationstests zur Bestätigung der Allergiediagnose zu vermeiden, insbesondere bei Probanden mit schweren lebensbedrohlichen Reaktionen.

Darüber hinaus hat dieser Test den Vorteil, dass er die Reaktion gegen jedes Medikament oder Allergen im Vergleich zu anderen In-vitro-Methoden, die nur für wenige Medikamente und Allergene verfügbar sind, analysieren kann. Die Haupteinschränkungen des Tests beziehen sich auf eine nicht optimale Empfindlichkeit, insbesondere bei Arzneimittelallergien. Die Notwendigkeit, den Test nicht länger als 24 Stunden nach der Probenentnahme durchzuführen, und die fehlende Standardisierung zwischen Laboratorien und Diagnosealgorithmen.

Beginnen Sie mit der Sammlung von peripherem Blut in neun Milliliter-heparinisierten Röhrchen und legen Sie die Proben in einen Rotor, um sie bei Raumtemperatur zu halten, bis sie für das experimentelle Protokoll benötigt werden. Kennzeichnen Sie jeweils zwei Fünf-Milliliter-Zytometerröhrchen für die Negativkontrolle und die Positivkontrolle. Kennzeichnen Sie auch jeweils ein Röhrchen für die verschiedenen getesteten Allergen- oder Arzneimittelkonzentrationen.

Legen Sie dann die Schläuche in ein Gestell, damit die Schläuche perfekt passen, ohne zu verrutschen. Für die erste Positivkontrolle wird eine viermikromolare Lösung von N-Formylmethionyl-leucyl-phenylalanin oder fMLP in 0,05% PBS-T hergestellt, um die Qualität der Basophilen zu bestätigen. Für die zweite Positivkontrolle wird eine 0,05 Milligramm pro Milliliter Anti-IgE-Lösung mit PBS-T hergestellt.

Bereiten Sie die Färbemischung vor, indem Sie je einen Mikroliter CCR3-APC-, CD203c-PE- und CD63-FITC-Antikörper pro 20 Mikroliter des Stimulationspuffers hinzufügen. Dann fügen Sie 23 Mikroliter dieser Färbemischung zu jeder Tube hinzu. Geben Sie 100 Mikroliter PBS-T in die Negativkontrollröhrchen.

Fügen Sie 100 Mikroliter fMLP zu einem der positiven Kontrollröhrchen hinzu und fügen Sie 100 Mikroliter Anti-IgE in das andere zu den restlichen Röhrchen hinzu. Fügen Sie 100 Mikroliter der verschiedenen Allergen- oder Arzneimittelkonzentrationen hinzu und inkubieren Sie bei 37 Grad Celsius für 10 Minuten. Fügen Sie nach der Inkubation 100 Mikroliter Blut vorsichtig in jedes Röhrchen hinzu, um eine Hämolyse zu vermeiden.

Anschließend werden die Röhrchen vorsichtig vorgewirbelt und 25 Minuten bei 37 Grad Celsius im Thermostatbad mit mittlerem Rühren inkubiert. Halten Sie die Röhrchen mindestens fünf Minuten lang bei vier Grad Celsius, um die Degranulation zu stoppen. Fügen Sie zu jedem Röhrchen zwei Milliliter Lysing-Puffer hinzu, um die Erythrozyten zu lysieren.

Wirbeln Sie jedes Röhrchen und inkubieren Sie die Röhrchen dann fünf Minuten lang bei Raumtemperatur. Zentrifugieren Sie die Röhrchen bei 300 g bei vier Grad Celsius für fünf Minuten. Kippen Sie dann das Gestell in die Spüle, um den Überstand zu dekantieren, während die Zellen am Boden der Röhrchen verbleiben.

Fügen Sie drei Milliliter PBS-T zu jedem Röhrchen hinzu, um die Zellen zu waschen und die Röhrchen zu wirbeln. Führen Sie eine zweite Zentrifugationsrunde mit demselben Parametersatz durch und dekantieren Sie den Überstand, indem Sie das Rack in die Spüle umdrehen. Dann halten Sie die Proben bis zur Durchflusszytometrie bei vier Grad Celsius vor Licht geschützt.

Verbinden Sie das Durchflusszytometer mit der Computersoftware und warten Sie, bis das Zytometer bereit ist. Laden Sie die Vorlagen- und Instrumenteneinstellungen wie im Textmanuskript beschrieben. Starten Sie den Prozess der Probenerfassung.

Um aktivierte Basophile auszuwählen, gate Sie zunächst die Lymphozyten aus dem Side Scatter-Forward Scatter-Diagramm. Dann gate die Basophilen aus der Lymphozytenpopulation als CCR3+CD203c+Zellen und erwirbt mindestens 500 Basophile pro Röhre. Stellen Sie den CD63-Schwellenwert mit den Negativkontrollröhrchen auf ca. 2,5% ein und analysieren Sie die Proben.

IgE-abhängige Überempfindlichkeitsreaktionen wurden durch einen basophilen Aktivierungstest (BAT) mit Allergenen und Medikamenten untersucht. Die Basophilensensitivität wurde analysiert, indem die Reaktivität bei mehreren abnehmenden Allergenkonzentrationen gemessen wurde, die dazu beitragen, die allergische Konzentration zu bestimmen, die die Reaktion von 50% Basophilen oder EC50 induziert. Zuerst wurden die Lymphozyten aus dem seitlichen Streu-Vorwärts-Streudiagramm gesteuert.

Dann wurden Basophile aus der Lymphozytenpopulation als CCR3 + CD203c + Zellen entfernt. Dann wurde ein CCR3-CD63-Diagramm verwendet, um die basophile Aktivierung unter Verwendung von CD63 als Aktivierungsmarker für zwei Medikamente und unterschiedliche Konzentrationen eines Allergens zu analysieren. Der Test wird mit frischem Vollblut durchgeführt und darf nicht länger als 24 Stunden nach der Blutentnahme durchgeführt werden.

Der im Test verwendete Stimulus sollte keine Hilfsstoffe enthalten und die chemischen Eigenschaften der Medikamente müssen berücksichtigt werden. Weitere zusätzliche in vitro Methoden zur Diagnose von IgE-vermittelten allergischen Reaktionen oder zur Bestimmung von sIgE oder zum Histaminfreisetzungstest.