Name: Multifaktorielle Beurteilung des motorischen Verhaltens bei Ratten nach einseitiger Ischiasnervenquetschverletzung (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-07-31T14:30:00.000+00:00
Duration: 14 min 50 s
Description: Lernen Sie die multifaktorielle Beurteilung motorischer Defizite bei Ratten nach einseitiger Ischiasnervenquetschverletzung. Dieses standardisierte Protokoll umfasst Open-Field-Test, CatWalk-Ganganalyse, Beam-Walking und Sprossenlauf zur quantitativen Erfassung von Koordinationsstörungen und Erholungsverläufen.

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Diese Arbeit wurde vom Bundesministerium für Bildung und Forschung (BMBF DysTract bis C.W.I.) und vom Interdisziplinären Zentrum für Klinische Forschung (IZKF) der Universität Würzburg (N-362 bis C.W.I.; Z2-CSP3 bis L.R.). Darüber hinaus wurde dieses Projekt aus dem Forschungs- und Innovationsprogramm Horizon 2020 der Europäischen Union im Rahmen des EJP RD COFUND-EJP N° 825575 (EurDyscover to J.V.) und von der VERUM Foundation finanziert. Darüber hinaus wird C.W.I. gefördert durch die Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG) Projekt-ID 424778381-TRR 295, durch die Deutsche Stiftung Neurologie und ParkinsonFonds. L.R. wird zusätzlich von der Dystonia Medical Reseach Foundation unterstützt.
Die Autoren danken Keali Röhm, Veronika Senger, Heike Menzel und Louisa Frieß für die technische Unterstützung sowie Helga Brünner für die Tierpflege.

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</ol>

Die Autoren haben nichts preiszugeben.

Dieses Verhaltensbewertungsprotokoll bietet einen Überblick über Vor- und Nachteile sowie mögliche Auslesungen der ausgewählten Verhaltenstestbatterie in einem Nagetiermodell nach Ischiasnervenquetschverletzung. 
Um ein vergleichendes Ergebnis der Ischiasnervenquetschverletzung zu erhalten, ist eine konsistente Quetschtechnik erforderlich. Die Verwendung einer nicht gezackten Klemme (Ultra Fine Hemostat) anstelle einer Zange kann die Konsistenz des Quetschs verbessern. Verwenden Sie die gleiche Klemme sowie die gleiche Quetschposition, um eine gleichmäßige Nervenkompression zu gewährleisten. Die ausschließliche Verwendung der Klemme für die Quetschverletzung und die pflegevolle Handhabung der Klemme verbessert die Konsistenz. Führen Sie auch das Verfahren der Quetschverletzung mit Vorsicht durch. Zusätzliche Schäden am Nerv während der Operation wie unerwünschte Traktion des Nervs können zu unerwünschten Nebenwirkungen wie Autoverstümmelung führen. Daher empfiehlt sich eine sorgfältige Nervenvorbereitung sowie die Gabe eines Schmerzmittels für mindestens zwei Tage. 
Die multifaktorielle Beurteilung des motorischen Verhaltens kann den Phänotyp nach Nervenquetschverletzungen bei Ratten auf verschiedenen Ebenen charakterisieren. Wir verwendeten die OFT, CatWalk XT Ganganalyse, Beam Walking Task und Ladder Rung Walking Task. Ein verblindetes experimentelles Verfahren und die Datenanalyse zu experimentellen Gruppen ist für diese Experimente unerlässlich. Vor der Verhaltensbewertung wurden die Tiere im Testraum unter Testbedingungen für mindestens 30 Minuten akklimatiert. Alle hier angewandten Verhaltenstests haben den Vorteil, dass Nahrungs- oder Wasserentzug nicht erforderlich ist. In allen beschriebenen Verhaltenstests wurde die gleiche Gruppe von Tieren verwendet. Für jedes Tier wurden maximal zwei verschiedene Verhaltenstests pro Tag durchgeführt. Wenn Verhaltenstests in regelmäßigen Abständen durchgeführt werden, achten Sie auf ein vergleichbares Verfahren, z. B. die Durchführung des Tests in der gleichen Tierreihenfolge und zur gleichen Tageszeit. Ein weiterer wichtiger Aspekt für die Verhaltensanalyse ist der Tag-Nacht-Zyklus von Ratten. Betrachten Sie einen umgekehrten Tag-Nacht-Zyklus, um natürlichere und höhere Aktivitätsniveaus im Tageszyklus (dunkler Zyklus) zu erhalten. Dies muss insbesondere bei der Messung von spontanem Verhalten, wie dem OFT, berücksichtigt werden. In diesem Experiment konnte ein umgekehrter Tag-Nacht-Zyklus nicht implementiert werden, sondern eine ausreichende Akklimatisierung an die Testbedingungen wurde sichergestellt. Eine perfekte Ausleuchtung ist für hochauflösende Videos für die Beam Walking Task und die Ladder Rung Walking Task unerlässlich. Diese hohe Videoqualität kann bei Experimenten im Dunkeln nicht erreicht werden. 
Die Beurteilung des Ganges erfordert eine kontinuierliche Aufgabenerfüllung. Der erste wichtige Aspekt einer kontinuierlichen Aufgabenerfüllung besteht darin, die Tiere davon zu überzeugen, das Setup zu überqueren. Um die Motivation zu erhöhen, legen Sie kleine Futterpellets (45 mg) am Ende des Setups. Damit sich die Tiere mit den Futterpellets vertraut machen können, sollten die Pellets vor dem Test an sie verfüttert werden. Auch eine Zielbox am Ende des Setups kann hilfreich sein. Das Setup des CatWalk beinhaltet bereits einen Torkasten, aber Ratten zögern manchmal, den Torkasten zu betreten. Alternativ können Sie einen kleinen Käfig in den Torkasten einfügen, aber der Heimkäfig von Ratten passt nicht in den Torkasten. Lassen Sie die Ratte vor dem Erwerb einige Minuten im Käfig gewöhnungshalber. Zusätzlich kann eine weitere Ratte aus demselben Heimkäfig in den Torkasten oder in den Käfig im Torkasten gelegt werden. Achten Sie darauf, dass die zweite Ratte in der Box bleibt und den Eingang zum Torkasten nicht blockiert. Darüber hinaus ist es auch möglich, den Zielkasten aus dem CatWalk-System zu entfernen und den Rattenheimkäfig am Ende des Gehwegs zu platzieren, wodurch die Ratte nach jedem Lauf ihr "Heimatgebiet" betreten kann. Für die Einrichtung der Balkenlaufaufgabe und der Leitersprosselaufaufgabe empfehlen wir, am Ende des Aufbaus einen Torkasten oder den Heimkäfig hinzuzufügen. Um die Konsistenz zu gewährleisten, sollten der CatWalk, die Balkenlaufaufgabe und die Leitersprosse mindestens einmal pro Woche mit sechs bis zehn Läufen durchgeführt werden.
Obwohl nicht jede Analyse signifikante Unterschiede in dieser Studie ergab, bedenken Sie, dass eine Einbeziehung von genetisch veränderten Tieren oder Behandlungsgruppen wertvolle Daten liefern könnte, die zwischen Gruppen aus den gleichen Verhaltenstests unterscheiden können. 
Die Nervenquetschverletzung hatte keinen Einfluss auf die Bewegungsaktivität der Ratte, die in einem fünf Minuten OFT gemessen wurde. Die Catwalk XT-Ganganalyse ist ein objektiveres und empfindlicheres Werkzeug zur Analyse der Gang-, Pfoten- und Zehenpositionierung. Nach einem intensiven Training lernen die Ratten, den Gehweg des CatWalk XT-Geräts zu den Standardeinstellungen zu überqueren. Die Nervenverletzung verringert nicht die Fähigkeit der Ratten, den Gehweg zu überqueren. Die automatische Berechnung verschiedener Parameter stellt die Daten objektiv dar. Zusätzliche Informationen können mit dem Modul "Interactive Footprint Measurements" gewonnen werden, und in der Tat ergaben diese Analysen signifikante Unterschiede in verschiedenen Parametern der Zehenspreizung, der Drucklänge und des Pfotenwinkels zur Körperachse im Vergleich von Ratten mit und ohne Nervenverletzung.
Ratten können leicht für die Strahllaufaufgabe trainiert werden. Unterschiede in der Latenzzeit bis zum Überqueren des Strahls und in der Anzahl der Fußrutsche pro Schritt der nervenverletzten Hinterbeine wurden durch den Vergleich von Naiven mit quetschverletzten Ratten festgestellt. Ein Nachteil der Analyse von nervenverletzten Ratten mit der Beam Walking Task ist die Größe des Strahls. Innerhalb der ersten zwei Wochen nach der Ischiasnervenquetschverletzung benötigen die Ratten Hilfe, um den Strahl zu überqueren, da ihr Gleichgewicht beeinträchtigt ist. Obwohl einige Ratten in der Lage sein können, den Strahl zu überqueren, ist das Risiko von Verletzungen, die durch einen Sturz verursacht werden, hoch. Nervenzerkleinerte Tiere sollten daher in den ersten zwei Wochen nach einer Ischiasnervenquetschverletzung oder gegebenenfalls länger dabei unterstützt werden, den Strahl zu überqueren. Es ist jedoch schwierig, Läufe mit und ohne Hilfe zu vergleichen. Auch die Motorbalance ist ein wichtiger Parameter, der durch die Balkenlaufaufgabe beurteilt wird. Wir hielten diesen Parameter für nicht relevant für unser Nervenquetschrattenmodell. Daher konnten die von Ohwatashi et al. und Johansson & Ohlsson beschriebenen Scores nicht verwendet werden und Läufe mit einer unvollständigen Strahltraverse wurden für die Datenanalyseausgeschlossen 18,19.
Die 7-Kategorien-Skala von Metz et al. kann sowohl Vor- als auch Hinterbeine analysieren und zwischen unterschiedlichen Schweregraden von Fehlern aller Gliedmaßen während der Leitersprosse Gehen Aufgabe16,17unterscheiden. Durch die Analyse der prominentesten Fehler, zu denen die Kategorien von 0 bis 2 gehören, konnten beim Vergleich von nervenverletzten Wt-Ratten mit naiven Wt-Ratten keine Unterschiede der Fehler pro Schritt im Hinterbeine festgestellt werden. Darüber hinaus unterschied sich die Latenzzeit beim Durchlaufen des Leitersprossenapparates nicht zwischen nervenverletzten Ratten und naiven Ratten. Deep-Learning-Modelle könnten die Datenanalyse der Leitersprosse durch einen automatisierten Ansatz verbessern und beschleunigen. 
Es ist wichtig zu erwähnen, dass die Nervenquetschverletzung sowie alle beschriebenen Verhaltenstests leicht auf Mäuse übertragen werden können, indem die Einstellungen und Größen der Setups angepasst werden. Die Verwendung von Mäusen als Modellorganismus hat den positiven Effekt, dass transgene Modelle für viele menschliche Krankheiten existieren.

Nagetiere sind ausgezeichnete Modellorganismen, um das Verständnis menschlicher Krankheiten zu vertiefen1,2 durch das Testen von Hypothesen auf mehreren biologischen Ebenen. Eine grundlegende biologische Ebene für die Charakterisierung von Nagetiermodellen ist die Phänotypebene, gemessen durch Verhaltensbewertungen. Abhängig vom Tiermodell und der wissenschaftlichen Forschungsfrage ist die Auswahl einer leistungsfähigen und zuverlässigen Verhaltenstestbatterie unerlässlich, um ein breites Spektrum von Verhaltensaspekten abzudecken, z. B. für Tiermodelle der Parkinson-Krankheit und Dystonie3,4,5,6.
Der Ischiasnerv ist der größte Nerv im menschlichen Körper mit motorischen und sensorischen Fasern. Verletzungen des Ischiasnervs können leicht aus einer Vielzahl von Ereignissen wie Verkehrsunfällen und Operationenresultieren 7,8. Daher sind Forschungsaktivitäten mit Nagetiermodellen mit Ischiasnervenverletzungen von translational relevantem Wert. Auch wenn der translationale Aspekt der Nervenregeneration von Ratte zu Mensch kritisch zu sehen ist9, ist die Ischiasnervenquetschverletzung (Axonotmesis) in Nagetiermodellen eine häufig verwendete Methode zur Analyse von Degenerations- und Regenerationsprozessen peripherer Nerven10,11. Im Falle einer Quetschverletzung wird der Nerv nicht vollständig transektiert. Es schädigt das Axon, was direkt nach einer Quetschverletzung zu einem Leitungsblock führt, gefolgt von regenerativen Prozessen 4,12,13.
Darüber hinaus ist in der Dystonieforschung die einseitige Ischiasnervenquetschverletzung eine etablierte Methode, um dystonieähnliche Bewegungen (DLM) in genetisch prädisponierten Dystonie-Nagetiermodellen auszulösen, die keine DLM per se zeigen4,14. Es wird angenommen, dass das periphere Nerventrauma die sensomotorische Integration stört, indem es die Ischiasnervfasern beeinflusst, die für motorische und sensorische Funktionen verantwortlich sind15.
Wir bieten hier eine detaillierte Beschreibung für eine standardisierte Quetschverletzung des Ischiasnervs und eine Batterie von motorischen Verhaltensbewertungen, die sich aus dem Open-Field-Test (OFT), der CatWalk XT-Ganganalyse, der Strahl-Walking-Aufgabe und der Leiter-Sprossen-Walking-Aufgabe bei naiven Wildtyp-Ratten (n = 8-9) und Wt-Ratten fünf Wochen nach einseitiger Ischiasnervenquetschverletzung (n = 10) zusammensetzt. Das OFT gibt Auskunft über die allgemeine Bewegungsaktivität, während eine detaillierte Ganganalyse durch das automatisierte Ganganalysesystem CatWalk XT erreicht wird. Die Balkenlaufaufgabe wird verwendet, um die motorische Koordination zu bewerten, indem die Zeit bis zum Überqueren des Balkens und die Anzahl der Fußplatzierungsfehler bewertet werden. Für die Gangleistungsanalyse gibt die Leitersprosse-Gehaufgabe Aufschluss über die Platzierung von Fuß oder Pfoten und Fehler an einem horizontalen Leitersprossengerät mit einem konstanten, aber unregelmäßigen Sprossmuster.

<table><tbody><tr><td>Essigsäure, &ge; 99.8%</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>33209-1L</td><td></td></tr><tr><td>Appose ULC Skin Stapler 35W</td><td>Covidien</td><td>8886803712</td><td></td></tr><tr><td>Beam</td><td>self made</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Bepanthen Augencreme</td><td>Bayer Vital GmbH</td><td>81552983</td><td></td></tr><tr><td>Box für OFT</td><td>self made</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Camcorder GC-PX100</td><td>JVC</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Catwalk XT</td><td>Noldus</td><td></td><td>&nbsp; Setup und Software</td></tr><tr><td>Kammer für isofluran</td><td>GT-Labortechnik</td><td></td><td>Sonderanfertigung</td></tr><tr><td>Einwegskalpell Nr. 11</td><td>Feder</td><td>20.001.30.011</td><td></td></tr><tr><td>Dr&auml; ger Vapor 19.3 Isofluran System</td><td>Dr. Wilfried M&uuml; ller GmbH</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Dumont #2 - Laminektomie-Pinzette</td><td>Fine Science Tools</td><td>11223-20</td><td></td></tr><tr><td>Dumont #5 Pinzette</td><td>Fine Science Tools</td><td>11251-30</td><td>superfeine</td></tr><tr><td>Staubfreie Präzisionspellets 45 mg</td><td>Bio-Serv</td><td>F0021</td><td></td></tr><tr><td>EthoVision XT</td><td>Noldus</td><td></td><td>&nbsp; Aufbau und Software</td></tr><tr><td>Pinzette 160 mm</td><td>Hartenstein</td><td>PZ09</td><td></td></tr><tr><td>Gasanästhesiemaske, Ratte</td><td>Dr. Wilfried M&uuml; ller GmbH</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Torkasten für Leiter Sprossen Gehen Arbeitsgerät</td><td>Eigenbau</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Haarschneider Magnum 5000</td><td>Wahl GmbH</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Gehärtete Feinschere</td><td>Fine Science Tools</td><td>14090-11</td><td></td></tr><tr><td>Heiztisch</td><td>MEDAX</td><td>13801</td><td></td></tr><tr><td>Isofluran CP 1ml/ml, 250 ml</td><td>cp-pharma</td><td>1214</td><td>Rezept erforderlich</td></tr><tr><td>Kinovea</td><td>www.kinovea.org</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Leiter Sprossen Laufarbeitsgerät</td><td>Eigenbau</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Nadelhalter</td><td>KLS Martin</td><td>20-526-14-07</td><td></td></tr><tr><td>Octeniderm</td><td>Sch&uuml; lke</td><td>118211</td><td></td></tr><tr><td>Rimadyl 50 mg/ml, injizierbar</td><td>Zoetis</td><td></td><td>Carprofen, verschreibungspflichtig</td></tr><tr><td>Gummiband-Retraktoren</td><td>selbst hergestellt</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Abstandshalter für Balken</td><td>selbstgemacht</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Abstandshalter für Leiter Sprossen Gehen Arbeitsgerät</td><td>selbst hergestellt</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Naht Silkam 4/0 DS 19</td><td>B. Braun</td><td>C0762202</td><td></td></tr><tr><td>Ultrafeine Hämostate (nicht gezahnte Klemme)</td><td>Fine Science Tools</td><td>13020-12</td><td></td></tr></tbody></table>

multifaktorielle beurteilung des motorischen verhaltens bei ratten nach einseitiger ischiasnervenquetschverletzung

Multifactorial Assessment of Motor Behavior in Rats after Unilateral Sciatic Nerve Crush Injury

Die Induktion einer peripheren Nervenverletzung ist eine in den Neurowissenschaften weit verbreitete Methode zur Beurteilung von Reparatur- und Schmerzmechanismen unter anderem. Darüber hinaus wurde im Forschungsgebiet der Bewegungsstörungen eine Ischiasquetschverletzung eingesetzt, um einen dystonieähnlichen Phänotyp in genetisch prädisponierten DYT-TOR1A-Nagetiermodellen der Dystonie auszulösen. Um konsistente, reproduzierbare und vergleichbare Ergebnisse nach einer Ischiasnervenquetschverletzung zu erzielen, ist neben einer standardisierten phänotypischen Charakterisierung eine standardisierte Methode zur Induktion der Nervenquetschung unerlässlich. Dabei muss nicht nur auf das spezifische Sortiment an Verhaltenstests geachtet werden, sondern auch auf die technischen Anforderungen, die korrekte Durchführung und die konsekutive Datenanalyse. Dieses Protokoll beschreibt detailliert, wie eine Ischiasnervenquetschverletzung durchgeführt wird, und stellt eine Verhaltenstestbatterie für die Beurteilung motorischer Defizite bei Ratten bereit, die den Freifeldtest, die CatWalk XT-Ganganalyse, die Strahllaufaufgabe und die Leitersprosselaufaufgabe umfasst.

Die repräsentativen Ergebnisse des fünf Minuten OFT zeigen, dass die Nervenquetschverletzung fünf Wochen nach der Operation keinen Einfluss auf die Bewegungsaktivität hat (Abbildung 1).
Die Ganganalyse mit dem CatWalk XT System (Abbildung 2) generiert viele verschiedene Parameter. Selektive Parameter wurden statistisch analysiert, indem naive Ratten fünf Wochen nach dem Nervenquetschen mit nervenverletzten Ratten verglichen wurden (Abbildung 2D). Signifikante Veränderungen konnten für die Laufdurchschnittsgeschwindigkeit, die Schrittlänge und den Druckbereich der nervenverletzten (rechts) Hinterpfote festgestellt werden. Eine detailliertere Analyse der nervenverletzten Hinterpfote wurde mit dem Modul "Interactive Footprint Measurements" durchgeführt. Eine signifikante Reduktion der Parameter Zehenausbreitung, Zwischenkeheausbreitung und Drucklänge wurde bei nervenverletzten Wt Ratten im Vergleich zu wt naiven Ratten beobachtet. Darüber hinaus unterscheiden sich die Pfotenwinkelkörperachse und der Pfotenwinkelbewegungsvektor signifikant beim Vergleich von nervenverletzten Wt-Ratten mit wt naiven Ratten (Abbildung 2E).
Abbildung 3 zeigt Daten zur motorischen Koordination, die durch die Bewertung von Balkenlaufaufgaben erhalten wurden. Nervenverletzte Wt-Ratten zeigten eine signifikant erhöhte Latenzzeit, um den Strahl zu überqueren, verglichen mit wt naiven Ratten fünf Wochen nach der Verletzung (Abbildung 3B). Als zusätzliches Auslesen der Beam-Walking-Aufgabe wurden Voll- und Halbrutsche der nervenverletzten Hinterbeine gezählt und als Fehler für die statistische Analyse betrachtet. Der Prozentsatz der Fehler pro Schritt des nervenverletzten (rechten) Hinterbeins war bei nervenverletzten Wt-Ratten im Vergleich zu wt naiven Ratten signifikant erhöht.
Repräsentative Daten der Leitersprosselaufaufgabe (Abbildung 4) zeigen keine signifikanten Veränderungen in der Latenzzeit zum Überqueren des Gehwegs der Leitersprosse (Abbildung 4C) oder im Prozentsatz der Fehler pro Schritt des nervenverletzten (rechts) Hinterbeins (Abbildung 4D). Die Analyse des Fehlerprozentsatzes pro Schritt des nervenverletzten Hinterbeins berücksichtigte nur die Punktzahl von 0 bis 2 der 7-Kategorien-Skala von Metz et al. Die Verteilung aller Score-Kategorien pro Schritt aus der 7-Kategorie-Skala der nervenverletzten Hinterbeine und der nicht nervenverletzten (links) Hinterbeine ist in Abbildung 4Edargestellt.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62606/62606fig01.jpg"> Abbildung 1: Beurteilung der Bewegungsaktivität während des Freifeldtests. (A) Bild des Offenfeld-Testaufbaus. Ausgewähltes Bild, das von einem aufgezeichneten Video während des Freifeldtests abgezogen wurde und eine Ratte in der Freifeldarena ohne (B) und mit (C) Tracking zeigt. (D) Die Geschwindigkeit während einer fünfmonatigen Open-Field-Testaufzeichnung wurde bei naiven Ratten und Ratten fünf Wochen nach einer Nervenquetschverletzung untersucht. Die Daten werden als Mittelwert ± REM dargestellt. Die statistische Analyse wurde mit dem ungepaarten t-Test der normalverteilten Daten durchgeführt. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62606/62606fig01large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62606/62606fig02.jpg"> Abbildung 2: Ganganalyse mit dem CatWalk XT-System. (A) Bild des CatWalk XT-Geräts. (B) Beispiele für die Druckansicht, die die beschrifteten Pfotenabdrücke im Falschfarbenmodus zeigt, und Beispiele für die Timing-Ansicht, die ein zeitbasiertes Gangdiagramm von naiven Ratten und Ratten fünf Wochen nach nervenquetschernder Verletzung zeigt. (C) Beispiele für die Zehenklassifikation mit Zehenausbreitung (TS), Zwischenzehenausbreitung (ITS) und Drucklänge (PL) sowie Beispiele für die Körperachsenansicht, die die Körperachse (weiße Linie) und den Bewegungsvektor (rote Linie) von naiven Ratten und Ratten fünf Wochen nach Nervenquetschverletzung zeigt. (D) Daten ausgewählter Parameter aus der "Standard"-Klassifikation zum Vergleich von naiven Ratten und Ratten fünf Wochen nach Nervenquetschverletzung. (E) Daten ausgewählter Parameter aus dem Modul "Interactive Footprint Measurements", die fünf Wochen nach einer Nervenquetschverletzung mit naiven Ratten und Ratten verglichen werden. Die statistische Analyse wurde mit dem ungepaarten t-Test der normalverteilten Daten, dem ungepaarten t-Test mit Welchs Korrektur normalverteilter Daten mit ungleicher Varianz und dem Mann-Whitney-U-Test der nicht normalverteilten Daten durchgeführt. ± Der P-Wert &lt; 0,05 wurde als statistisch signifikant definiert und als *p &lt; 0,05, **p &lt; 0,01, ***p &lt; 0,001, ****p &lt; 0,0001 bezeichnet. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62606/62606fig02large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62606/62606fig03.jpg"> Abbildung 3: Ganganalyse mit der Strahllaufaufgabe. (A) Bild und schematische Zeichnungen der Einrichtung der Balkenlaufaufgabe. Die Latenzzeit bis zum Überqueren des Strahls (B) und die prozentualen Fußschlupffehler pro Schritt der nervenverletzten Hinterbeine während der Strahllaufaufgabe (C) wurden bei wt naiven Ratten und wt Ratten fünf Wochen nach Nervenquetschverletzung analysiert. Repräsentatives Bild für die Startzeitposition (D) und die Endzeitposition (E) der Strahllaufaufgabe. Repräsentative Bildsequenz eines Vollschlupffehlers (F) und eines Halbschlupffehlers (G) der Strahllaufaufgabe. Die Daten werden als Mittelwert ± SEM dargestellt. Die statistische Analyse wurde mit dem Mann-Whitney-U-Test der nicht normalverteilten Daten durchgeführt. Der P-Wert &lt; 0,05 wurde als statistisch signifikant definiert und als *p &lt; 0,05, **p &lt; 0,01 gekennzeichnet. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62606/62606fig03large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62606/62606fig04.jpg"> Abbildung 4: Ganganalyse mit der Leitersprosse. Bild (A) und schematische Zeichnungen (B) der Leitersprosse Walking Task Setup. Die Latenzzeit beim Durchlaufen des Leitersprossenapparates (C) und der prozentuale Fußschlupffehler pro Schritt der nervenverletzten Hinterbeine während der Leitersprosse-Gehaufgabe (D) wurden bei naiven Ratten und Ratten fünf Wochen nach nervenquetschungsverletzungen untersucht. (E) Die prozentuale Verteilung der Score-Kategorie pro Schritt nach der 7-Kategorie-Skala von Metz et al. für den linken und rechten Hinterbein von wt naiven Ratten und wt Ratten fünf Wochen nach Nervenquetschverletzung. Die statistische Analyse wurde mit dem ungepaarten t-Test der normalverteilten Daten und dem Mann-Whitney-U-Test der nicht-normalverteilten Daten durchgeführt. ± <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62606/62606fig04large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62606/62606fig05.jpg"> Abbildung 5: Beispielhafte Darstellung jeder Kategorie nach der 7-Kategorien-Skala von Metz et al. während der Leiter sprossen Gehaufgabe. Repräsentative Bildsequenz von der rechten Hinterbeine der Kategorie 0 - Totalflaz, Kategorie 1 - tiefer Schlupf, Kategorie 2 - leichter Schlupf, Kategorie 3 - Ersatz, Kategorie 4 - Korrektur, während der Leitersprosse Gehaufgabe. Repräsentative Bilder für Kategorie 5 - Teilplatzierung und Kategorie 6 - korrekte Platzierung. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62606/62606fig05large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.</a>

Wir stellen ein Protokoll zur Beurteilung des motorischen Verhaltens über eine Verhaltenstestbatterie bei Ratten nach Ischiasnervenquetschverletzung zur Verfügung.

Multifaktorielle Beurteilung des motorischen Verhaltens bei Ratten nach einseitiger Ischiasnervenquetschverletzung

The induction of a peripheral nerve injury is a widely used method in neuroscience for the assessment of repair and pain mechanisms among others. In ...

Das übergeordnete Ziel dieses Protokolls ist es, die Verfahren zu beschreiben, die an der Durchführung einer irreproduziblen Ischiasnervenzerkleinerung beteiligt sind, und ein Protokoll für die Beurteilung des motorischen Verhaltens nach peripheren Traumata bereitzustellen. Die Auswahl einer leistungsstarken und zuverlässigen Verhaltenstestbatterie ist unerlässlich, um ein breites Spektrum von Verhaltensaspekten abzudecken, und hängt vom verwendeten Tiermodell und der wissenschaftlichen Forschungsfrage ab. Dieses Protokoll beschreibt detailliert, wie eine Ischiasnervenquetschverletzung durchgeführt wird, und stellt eine Verhaltenstestbatterie zur Beurteilung motorischer Defizite bei Ratten bereit, die den Freifeldtest, die CatWalk-Ganganalyse, die Strahllaufaufgabe und die Leitersprosselaufaufgabe umfasst.Tierversuche wurden in Übereinstimmung mit den geltenden nationalen und institutionellen Richtlinien für die Pflege und Verwendung von Tieren durchgeführt. Halten Sie während des gesamten chirurgischen Eingriffs eine sterile Umgebung aufrecht. Stellen Sie den Operationstisch mit der notwendigen Ausrüstung auf.Betäuben Sie die Ratte tief in einem geschlossenen Schrank mit Isofluran und rasieren Sie einen ausgedehnten Bereich der rechten Hintergliedmaße. Als nächstes positionieren Sie die Ratte in der Anästhesiemaske und setzen Sie die Tiefenanästhesie mit Isofluran fort. Befestigen Sie den Oberkörper und beide Hinterbeine der Ratte mit Klebeband.Legen Sie beide Hinterbeine in eine symmetrische und ausgestreckte Position und drehen Sie jede Pfote flach auf den Operationstisch. Desinfizieren Sie die Haut des rasierten Bereichs mit einem geeigneten Antiseptikum. Suchen Sie nach der Ischias-Notbe des Ileums.Machen Sie einen Hautschnitt von der Ischias-Notch in Richtung Der Pfote mit einem Skalpell. Wenn die Hintergliedmaßen fixiert sind und der Hautschnitt korrekt durchgeführt wird, kann ein Hohlraum in der Faszienebene zwischen dem Musculus gluteus maximus und dem Musculus biceps femoris gesehen werden, der einer weißen Linie ähnelt. Führen Sie eine geschlossene superfeinheitliche hämostatische Hemostasette in den Hohlraum ein und verteilen Sie die Zette.Die Faszienebene sollte sich öffnen, ohne Muskelgewebe zu verletzen. Legen Sie die Gummibandretraktoren unter die Muskeln, um den Hautschnitt offen zu halten. Entfernen Sie vorsichtig das umliegende Gewebe und die Blutgefäße aus dem Ischiasnerv, bis der Nerv vollständig freigelegt ist.Es ist wichtig, den Nerv während des gesamten Eingriffs nicht zu dehnen oder zu ziehen. Zerquetschen Sie den Ischiasnerv mit einer nicht gezackten Klemme mit konstantem und schnell nutzbarem Druck. Öffnen Sie dazu die Klemme, legen Sie den Nerv auf den Unterkiefer der Klemme und schließen Sie die Klemme, indem Sie sie für 3 x 10 Sekunden in die erste Position sperren.Öffnen Sie die Klemme nach der Quetschverletzung vorsichtig wieder. die Quetschstelle des Ischiasnervs erscheint durchscheinend. Entfernen Sie die Gummibandretraktoren.Schließen Sie den Schnitt der Faszienebene mit einer resorbierbaren Naht. Schließen Sie den Hautschnitt mit Körperhautklammern. Die Bewegungsaktivität sowie die Verhaltensaktivität von Ratten können durch einen Offenfeldtest analysiert werden.Der Aufbau des offenen Feldes, das sich in einer dunklen und ruhigen Umgebung befinden sollte, besteht aus dem automatisierten Video-Tracking-System EthoVision XT und einer Arena mit einer kratzfesten, reinigbaren schwarzen Oberfläche. Platzieren Sie die Arena und die Kamera in die richtige Position und richten Sie die EthoVision XT Software ein. Platzieren Sie die Ratte vorsichtig in der Mitte der Testarena.Während der Aufnahme sollte sich der Experimentator von dem offenen Feld fernhalten, um die Ratte nicht abzulenken. Für die Datenanalyse des offenen Feldtests gehen Sie zum Analyseabschnitt in der linken Seitenleiste und wählen Sie "Visualisierung verfolgen" unter der Registerkarte "Ergebnisse". Als nächstes exportieren Sie die benötigten Parameter nach XL.Wählen Sie in der Software eine Reihe von Variablen aus verschiedenen Kategorien für die Datenanalyse aus.Eine Ganganalyse durch das CatWalk XT System kann helfen, viele verschiedene Parameter bezüglich Fußabdrücke, Haltung und Gang von Tiermodellen zu beurteilen. Ein Glassteg wird mit grünem Licht beleuchtet und das von den Fußabdrücken der Tiere gestreute Licht wird mit einer Hochgeschwindigkeits-Videokamera eingefangen, die sich unter dem Gehweg befindet. Die Signale können mit der CatWalk XT Software analysiert werden.Das Experiment muss unter dunklen Bedingungen durchgeführt werden. Beginnen Sie mit der Einrichtung des CatWalk XT-Systems. Wählen Sie die experimentellen Einstellungen aus.Platzieren Sie die Kamera in Position und stellen Sie den Fokus ein. Richten Sie die Erkennungseinstellungen ein. Richten Sie die Korridorwände des CatWalk-Systems ein und stellen Sie sicher, dass die Wände parallel zum Gehweg bleiben.Definieren Sie die Länge des Gehwegs und kalibrieren Sie den Gehweg. Als Nächstes fangen Sie ein Hintergrundbild an. Für das Hintergrundbild wird ein sauberer und leerer Gehweg benötigt.Die Ratte sollte den Gehweg ohne Unterbrechung überqueren. Gemäß den definierten Laufkriterien werden für die Datenanalyse drei konforme Läufe pro Ratte benötigt. Trainiere Tiere mindestens acht Tage lang, bevor du mit dem eigentlichen Experiment beginnst.Der CatWalk sollte mindestens einmal pro Woche mit 6 bis 10 Läufen durchgeführt werden, um eine kontinuierliche Aufgabenleistung zu gewährleisten. Für die Datenanalyse nur die konformen Läufe auswerten. Klassifizieren Sie Pfotenabdrücke automatisch mit der CatWalk XT Software.Überprüfen Sie die Pfotendrucketiketten manuell. Korrigieren Sie falsche Pfotendrucketiketten, fügen Sie Etiketten mit nicht erkannten Pfotenabdrücken hinzu und löschen Sie alle Geräusche und falschen Etiketten. Die numerischen Ergebnisse werden in einem XL-Blatt angezeigt, das eine Reihe grundlegender Parameter anzeigt.Für detailliertere Informationen über jeden Fußabdruck klassifizieren Sie die Zehen der Hinterpfoten. Diese Analyse erfordert das interaktive Footprint-Messmodul. Legen Sie die Marker für die Footprint-Analyse manuell fest.Analysieren Sie jeden Hinterpfotenabdruck in allen drei konformen Durchläufen. Zeichnen Sie eine Linie von der Mitte des ersten Zeichnzes zur Mitte des fünften Zeichzeichnes, um die Zehenausbreitung zu messen. Zeichnen Sie eine Linie von der Mitte des zweiten Zeichnzes zur Mitte des vierten Zeichzeichnes, um die zwischengeschaltete Zehenausbreitung zu messen.Zeichnen Sie eine Linie von der Mitte des dritten Zehs bis zur Ferse der Hinterpfote, um die manuelle Drucklänge zu messen. Überprüfen Sie die numerischen Ergebnisse der interaktiven Fußabdruckmessungen, die in einem separaten Blatt angezeigt werden. Gangdefizite können durch die Strahllaufaufgabe bestimmt werden.Der Schwerpunkt der Beam Walking-Aufgabe in diesem spezifischen Forschungsthema wird die Analyse der motorischen Koordination und nicht die Bewertung der motorischen Balance sein. Für die Beam-Walking-Aufgabe werden ein Beam, ein Abstandhalter, ein Tisch, ein einheitlicher Hintergrund und ein Camcorder benötigt. Verwenden Sie einen Holzbalken von 90 Zentimetern Länge, 1,7 Zentimeter Breite und 2 Zentimeter Höhe.Trainiere die Tiere sieben Tage lang. Legen Sie die Ratte auf die Startplattform des Balkens. Die Ratte sollte den Strahl dreimal ohne Unterbrechung überqueren.Selbst wenn die Ratte innerhalb der ersten drei Läufe drei konforme Läufe erreicht, sollten mindestens 6 bis 10 Läufe für eine kontinuierliche Aufgabenleistung durchgeführt werden. Wählen Sie die Videosequenzen von drei kompatiblen Läufen aus der Aufnahme aus. Definieren Sie den Startzeitpunkt und den Endzeitpunkt der ausgewählten drei kompatiblen Durchläufe.Hier wird der Startzeitpunkt durch eine schwarze Linie auf dem Balken markiert, und die Platzierung des ersten Hinterglieds hinter der schwarzen Linie wird als Startzeitpunkt des Laufs definiert. Die Platzierung der ersten Hintergliedmaße auf der Plattform am Ende des Balkens definiert den Endzeitpunkt. Als nächstes berechnen Sie die Zeit, die die Ratte benötigt, um den Strahl zu überqueren.Bewerten Sie die Anzahl der Schritte und Fehler aus drei konformen Läufen für beide Hinterbeine separat, indem Sie die Zoom- und Zeitlupenfunktion der Software verwenden. Zu den Fehlern gehören totale Fußrutsche und halbe Fußrutschen. Ein totaler Fußschlupf ist definiert als eine Fußplatzierung, der ein tiefer Rutsch folgt, der zu einem Verlust des Kontakts der betroffenen Pfote mit dem Balken führt.Ein halber Schlupf ist definiert als die Pfote, die von der Seitenwand des Balkens rutscht, ohne den vollständigen Kontakt zu verlieren. Berechnen Sie den Prozentsatz der Fußschlupfe im Verhältnis zur Anzahl der Schritte, die den Balken überqueren müssen. Die Leitersprosse-Gehaufgabe kann die motorische Funktion, die Platzierung der vorderen Gliedmaßen und der hinteren Gliedmaßen sowie die Koordination zwischen den Gliedmaßen beurteilen.Für diesen Verhaltenstest werden ein Leitersprossengerät, ein Abstandhalter, ein Tisch, ein einheitlicher Hintergrund und ein Camcorder benötigt. Die horizontale Buchstabensprosse besteht aus Metallsprossen und klaren Polycarbonat-Seitenwänden. Trainiere die Tiere acht Tage lang.Platzieren Sie die Ratte auf der Startzone der Leitersprossenoperatoren. Die Ratte muss den 100 Zentimeter großen Gehweg des Leitersprossengeräts dreimal ohne Unterbrechung überqueren, damit sie sich als konformer Lauf qualifizieren kann. Wählen Sie die Videosequenzen von drei kompatiblen Läufen aus der Aufnahme aus.Definieren Sie den Startzeitpunkt und den Endzeitpunkt der ausgewählten drei kompatiblen Durchläufe. Die Platzierung der Hintergliedmaße hinter der ersten schwarzen Linie an der Seitenwand des Geräts definiert den Startzeitpunkt des Laufs. Die Platzierung des ersten vorderen Glieds hinter der zweiten schwarzen Linie an der Seitenwand des Geräts definiert den Endzeitpunkt des Laufs.Berechnen Sie als Nächstes die Dauer des Laufs über den Gehweg. Bewerten Sie die drei konformen Läufe mit der 7-Kategorie-Skala von Mets und Kollegen, indem Sie die Zeitlupen- oder die Frame-by-Frame-Funktion der Software verwenden. Bestimmen Sie die Anzahl der Schritte und die Anzahl der Fehler gemäß den Kategorien der Skala für jedes Glied separat.Die Skala unterscheidet zwischen den folgenden Kategorien. Totaler Fehlschlag. Tiefer Schlupf.Leichter Ausrutscher. Ersatz.Korrektur. Teilplatzierung. Und korrekte Platzierung.Als nächstes berechnen Sie die Fehler pro Schritt. Die repräsentativen Ergebnisse des fünfminütigen Freifeldtests zeigen, dass die Nervenquetschverletzung fünf Wochen nach der Operation keinen Einfluss auf die Bewegungsaktivität hat. Die Ganganalyse mit dem CatWalk XT System generiert viele verschiedene Parameter.Signifikante Veränderungen konnten für die Laufdurchschnittsgeschwindigkeit, die Schrittlänge und den Druckbereich der nervenverletzten rechten Hinterpfote festgestellt werden. Nervenverletzte Wildtypratten zeigten eine signifikant erhöhte Latenzzeit, um den Strahl zu überqueren, verglichen mit wildtypnaiven Ratten fünf Wochen nach der Verletzung. Als zusätzliches Auslesen der Strahllaufaufgabe wurden Voll- und Halbrutschen der nervenverletzten Hintergliedmaße gezählt und als Fehler für die statistische Auswertung betrachtet.Der Prozentsatz der Fehler pro Schritt der nervenverletzten rechten Hintergliedmaße war bei nervenverletzten Wildtypratten im Vergleich zu wildtypnaiven Ratten signifikant erhöht. Repräsentative Daten der Leitersprosse-Gehaufgabe zeigen keine signifikanten Veränderungen in der Latenzzeit, um den Gehweg des Leitersprossenapparates zu überqueren, oder im Prozentsatz der Fehler pro Schritt der nervenverletzten rechten Hintergliedmaße. Die Analyse des Fehlerprozentsatzes pro Schritt der nervenverletzten Hintergliedmaße berücksichtigte nur die Punktzahl von 0 bis 2 der 7-Kategorieskala von Mets und Kollegen.Nachdem Sie sich dieses Video angeschaut haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man eine Ischiasnervenquetschung durchführt und wie man eine multifaktorielle Bewertung des motorischen Verhaltens bei Ratten nach einseitiger Ischiasnervenzerkleinerung implementiert. Um konsistente, reproduzierbare und vergleichbare Ergebnisse nach einer Ischiasnervenquetschverletzung zu erzielen, ist eine standardisierte Methode zur Induktion des Nervenquetschs sowie eine standardisierte phänotypische Charakterisierung unerlässlich. Richtiges Training für spezifische Verhaltenstests bietet die Vorteile, Zeit während der Testbewertung zu sparen und bessere Ergebnisse zu erzielen.

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Research

Forschung

JoVE Journal

Neuroscience

Neurowissenschaften

In diesem Bericht beschreiben wir eine Methode zur Maus Ischiasnerv zu zerschlagen. Diese Methode verwendet leicht verfügbar Arterienklemmen und einfach und reproduzierbar produziert komplette Ischiasnerv verknallt. Darüber hinaus beschreiben wir eine Methode, um Muskeln ganzen Halterungen für die Analyse der Nervenregeneration nach Ischiasnerv verknallt vorzubereiten.

Reproduzierbare Maus Ischiasnerv Crush und anschließende Bewertung der Regeneration von Whole mount Muskelanalyse

Quelle: Li, Q., et al. Untersuchung der Axonregeneration von Säugetieren: In vivo Elektroporation des Spinalwurzelganglion einer adulten Maus. J. Vis. Exp. (2018)Dieses Video zeigt den Prozess der axonalen Regeneration in einem Ischiasnerv einer Maus nach einer Quetschverletzung. Der isolierte Nerv wird fixiert und für die Bildgebung vorbereitet, wobei fluoreszierende Proteine in Neuronen exprimiert werden, um das Axonwachstum sichtbar zu machen. Mit einem Epifluoreszenzmikroskop wird die...

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Drei neue Verhaltenstests (Vordergliedmaße Schritt-Wechsel, Haltungsinstabilität Test, Pasta Handling-Test) für die Bewertung Vordergliedmaße Funktion nach einer zervikalen Rückenmarksverletzung bei Nagetieren beschrieben.

Bewertung der Vordergliedmaße Funktion nach Einseitige Cervical SCI mit Novel Aufgaben: Gliedmaßen Step-Wechsel, Haltungsinstabilität und Pasta Handhabung

Die Pyramidenbahn, einer der wichtigsten sensomotorischen Striche können einseitig in das Nagetier brainstem um neuroplasticity induzierenden Therapien für das zentrale Nervensystem zu testen läsionierten werden. Dieses chirurgische Verfahren ("pyramidotomy") und postoperative Beurteilungen werden in diesem Protokoll beschrieben.

Einseitige Pyramidotomy der Pyramidenbahn in Ratten für Bewertung der Neuroplastizität treibenden Therapien

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Die Brustbrust-Spinal-Hemisektion ist ein wertvolles und reproduzierbares Modell der einseitigen Rückenmarksverletzung, um die neuronalen Mechanismen der bewegungsmotorischen Erholung und Behandlungswirksamkeit zu untersuchen. Dieser Artikel enthält eine detaillierte Schritt-für-Schritt-Anleitung, um das Hemisection-Verfahren durchzuführen und die Leistung des Bewegungsapparates in einer Offenen Allee zu bewerten.

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Wir führen eine kinematische Analysemethode ein, die ein dreidimensionales Bewegungserfassungsgerät mit vier Kameras und Datenverarbeitungssoftware für die Durchführung funktionaler Auswertungen während der Grundlagenforschung mit Nagetiermodellen verwendet.

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Die automatisierte Ganganalyse ist ein praktikables Werkzeug zur Bewertung der funktionellen Erholung in Nagetiermodellen von peripheren Nervenverletzungen und Rückenmarksprellungen. Während es nur ein Setup erfordert, um die Funktion des Bewegungsapparates in verschiedenen experimentellen Modellen zu bewerten, ist eine sorgfältige Hard- und Software-Anpassung und Das Training der Tiere sehr wichtig.

Automatisierte Gait-Analyse zur Beurteilung der funktionellen Erholung bei Nagetieren mit peripheren Nerven- oder Rückenmarkskontitionsverletzungen

Die Bewertung der motorischen Erholung bleibt das Benchmark-Ergebnismaß in experimentellen peripheren Nervenstudien. Die isometrische tetanische Kraftmessung des Tibialis-Vordermuskels bei der Ratte ist ein unschätzbares Werkzeug, um funktionelle Ergebnisse nach der Rekonstruktion von Ischiasnervendefekten zu beurteilen. Die Methoden und Nuancen werden in diesem Artikel ausführlich beschrieben.

Maximale isometrische tetanische Kraftmessung des Tibialis-Vordermuskels bei ratten

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Verwendung des MouseWalkers zur Quantifizierung der Dysfunktion des Bewegungsapparates in einem Mausmodell für Rückenmarksverletzungen

Lernen Sie die multifaktorielle Beurteilung motorischer Defizite bei Ratten nach einseitiger Ischiasnervenquetschverletzung. Dieses standardisierte Protokoll umfasst Open-Field-Test, CatWalk-Ganganalyse, Beam-Walking und Sprossenlauf zur quantitativen Erfassung von Koordinationsstörungen und Erholungsverläufen.

Multifaktorielle Beurteilung des motorischen Verhaltens bei Ratten nach einseitiger Ischiasnervenquetschverletzung

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