Verwendung von Baseplating und einem Miniskop, das mit einer Objektivlinse vorverankert ist, für die Calcium-Transienten-Forschung bei Mäusen

Dieses Miniskop kann das Schrumpfungsproblem mit Zahnzement während des Grundplattenverfahrens reduzieren und die Erfolgsrate von Miniskopaufnahmen von Fluoreszenzsignalen in zwei Längenkonfigurationen erhöhen. Wenn die transiente Fluoreszenz während der Grundbeschichtung nicht beobachtet werden kann, überprüfen Sie die Expression des Kalziumindikators und die Position einer Relaislinse auf der Hirnscheibe. Beginnen Sie mit der Montage der inneren Nadel eines intravenösen Katheters mit einem Durchmesser von 20 Gauge und einem Durchmesser von einem Millimeter auf dem stereotaktischen Arm.

Senken Sie den Katheter in den ventralen Mais ammonis 1 in die Zielregion. Anschließend wird die Mikroinjektionsnadel mit einer Geschwindigkeit von 100 bis 200 Mikrometern pro Minute in die ventrale Cornu ammonis 1 abgesenkt und 200 Nanoliter des viralen Vektors mit einer Geschwindigkeit von 25 Nanolitern pro Minute in die Zielregion infundiert. Nachdem Sie das Virus 10 Minuten lang diffundieren ließen, ziehen Sie die Mikroinjektionsnadel mit einer Geschwindigkeit von 100 bis 200 Mikrometern pro Minute zurück.

Nach der Desinfektion der Relaislinse die Linse bis zur Implantation in kalter, pyrogenfreier Kochsalzlösung einweichen. Halten Sie die Relaislinse mit einer Mikro-Bulldog-Klemme mit Schrumpfschlauch fest und legen Sie sie mit einer Geschwindigkeit von 100 bis 200 Mikrometern pro Minute auf den Zielbereich. Dann stabilisieren Sie die Linse mit Zahnzement.

Um ein Miniskop einzustellen, befestigen Sie das Objektiv an der Unterseite und montieren Sie die Grundplatte auf das Miniskop. Wickeln Sie 10 Zentimeter Paraffinfolie um die Außenseite der Grundplatte. Halten Sie das Miniskop mit der stereotaktischen Armsonde aus wiederverwendbarem Klebeton.

Richten Sie das Objektiv auf der Oberseite des Relaisobjektivs aus, wobei der Abstand zwischen den Linsen so gering wie möglich ist. Verwenden Sie Zahnzement, um die Positionierung der Grundplatte so zu sichern, dass der Zement nur den Paraffinfilm berührt. Wenn der Zahnzement getrocknet ist, entfernen Sie den Paraffinfilm, die Grundplatte und das Miniskop und halten Sie den Zahnzementboden hohl.

Versiegeln Sie die Relaislinse mit Formsilikonkautschuk und bedecken Sie den Silikonkautschuk mit einer dünnen Schicht Zahnzement. Trennen Sie die Maus von den stereotaktischen Instrumenten und legen Sie sie in eine Aufwachkammer. Schneiden Sie für die Grundierung die dünne Schicht des Dentalzementdaches vorsichtig mit einem Knochenrongeur ab und entfernen Sie den Silikonkautschuk.

Reinigen Sie die Oberfläche der Relaislinse mit 75%igem Alkohol. Befestigen Sie die Stellschraube neben der Grundplatte, um sie an der Unterseite des Miniskops zu befestigen. Stellen Sie den Fokusschieber so ein, dass er etwa 2,7 bis 3 Millimeter vom Hauptgehäuse entfernt ist.

Wenn die Einstellung abgeschlossen ist, schließen Sie das Miniskop an die Datenerfassungskarte an und schließen Sie es an einen USB 3.0-Anschluss an einem Computer an. Führen Sie die vom UCLA-Team entwickelte Datenerfassungssoftware aus. Stellen Sie die Belichtung auf 255, die Verstärkung auf 64x und die Anregungs-LED auf 5% einUm das Miniskop mit der Datenerfassungssoftware zu verbinden, klicken Sie auf die Schaltfläche "Verbinden" und sehen Sie sich den Livestream der Datenerfassungssoftware an, wobei der Rand der Relaislinse als Orientierungspunkt dient.

Sobald das Relaisobjektiv gefunden wurde, richten Sie das Miniskopobjektiv von Hand auf das Relaisobjektiv aus. Passen Sie die verschiedenen Winkel und Abstände des Miniskops an und beginnen Sie mit der Suche nach den Fluoreszenzsignalen. Halten Sie das Miniskop in der optimalen Position, bewegen Sie den stereotaktischen Arm in Richtung des Miniskops und befestigen Sie das Miniskop mit wiederverwendbarer Klebemasse am stereotaktischen Arm.

Suchen Sie nach der besten Ansicht, indem Sie die X-, Y- und Z-Arme leicht anpassen. Passen Sie den Winkel zwischen der Oberfläche des Objektivs und der Relaislinse an, indem Sie die Ohrstange, die Zahnstange oder die wiederverwendbare Klebemasse auf der Z-Achse drehen. Die Virusexpression und die Linsenimplantation sind erfolgreich, wenn mindestens eine Zelle Fluoreszenztransienten während der Grundbeschichtung verdrängt.

Befestigen Sie die Grundplatte fest mit der kleinstmöglichen Menge Zahnzement und überwachen Sie den interessierenden Bereich, um sicherzustellen, dass sich die optimale Position nicht ändert. In der repräsentativen Studie erwies sich das Verfahren der Dummy-Baseplattierung als vorteilhaft, da es zu einer geringeren Verschiebung der Bodenplattenlage führte als das ursprüngliche Verfahren. Die Verschiebung der Bodenplatte wurde auch durch die Höhe des Zahnzements beeinflusst.

Die Grundplatte, die 0,5 Zentimeter über dem Schädel verankert war, verschob sich deutlich weniger als die Grundplatte, die einen Zentimeter über dem Schädel befestigt war. In einem Beispiel für eine erfolgreiche Bildgebung während des Basisbeschichtungsverfahrens wurden Fluoreszenztransienten zusammen mit Blutgefäßen bei dem anästhesierten Tier festgestellt. Fluoreszenztransienten wurden fünf Tage nach der Grundierung beobachtet, selbst wenn sich die Maus in ihrem Heimatkäfig frei verhielt, mit nur einer geringfügigen Verschiebung der Position.

Anschließend wurde eine Kalzium-Bildgebung von Mäusen durchgeführt. In einigen Fällen traten während des Baseplating-Vorgangs Probleme auf, wie z. B. das Fehlen von etwas außer einem einheitlichen Hintergrund oder der Sichtbarkeit von weißen Zellenrändern. ohne Fluoreszenztransienten.

Es ist wichtig, die Grundplatte mit möglichst wenig Zahnzement fest auf der Zielregion zu fixieren. Mit der Slate-Technik können Forscher die neuronale Aktivität in Längsrichtung beobachten. Mit der entsprechenden Lizenz kann dieses Verfahren auch zur Beobachtung des neuronalen Netzes im Sichtfeld angewendet werden.