Name: Longitudinale Nachsorge von Harnwegsinfektionen und deren Behandlung bei Mäusen mittels Biolumineszenz-Bildgebung (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-06-14T13:30:00.000+00:00
Duration: 7 min 39 s
Description: Erfahren Sie, wie Biolumineszenz-Bildgebung die longitudinale Analyse von Harnwegsinfektionen bei Mäusen ermöglicht. Diese Methode reduziert Tierzahlen und liefert Echtzeit-Einblicke in Infektionsdynamik.

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Diese Arbeit wurde durch Zuschüsse der Forschungsstiftung - Flandern (FWO Vlaanderen; G0A6113N), der Forschungsrat der KU Leuven (C1-TRPLe; T.V. und W.E.) und das VIB (an T.V.). W.E. ist leitender klinischer Forscher der Forschungsstiftung - Flandern (FWO Vlaanderen). Die Sorte UTI89-lux war ein großzügiges Geschenk aus dem Labor von Prof. Seed13.

Alle Tierversuche wurden in Übereinstimmung mit den Richtlinien des Gemeinschaftsrates der Europäischen Union durchgeführt und von der Tierethikkommission der KU Leuven genehmigt (P158/2018).
1. Kultivierende Bakterien (angepasst an7,13,14)
<ol><li>Präparat<ol>
<li>Wählen Sie einen lumineszierenden UPEC-Stamm, der den experimentellen Anforderungen am besten entspricht. HINWEIS: Hier wurde das klinische Zystitis-Isolat, UTI89 (E. coli), wegen seiner uropathogenen Kapazität sowohl bei Menschen als auch bei Nagetieren und seiner häufigen Verwendung in murinen UTI-Modellen5,7,15ausgewählt . Der biolumineszierende isogene Stamm, der das komplette Lux-Operon (luxCDABE) trägt, wird weiter als UTI89-lux bezeichnet. Dieses Operon trägt auch Kanamycinsulfat (Km) -Resistenzgene. Daher kann Km verwendet werden, um biolumineszierende Kolonienauszuwählen 13.</li>
		<li>Machen Sie eine Korrelationskurve für die KBE und die optische Dichte bei 600 Nanometern (OD 600 nm) für den gewählten Bakterienstamm7.<ol>
<li>Um dies zu tun, kultivieren Sie Bakterien (unter Verwendung des protokolls unten) und machen 8 verschiedene Verdünnungen in phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS). Messen Sie den OD bei 600 nm für all diese Verdünnungen und platten Sie sie auf Luria-Bertani (LB) Platten, um die KBE zu bestimmen.</li>
			<li>Zeichnen Sie die OD 600 nm-Werte und die KBE-Werte auf, um die Korrelation zu bestimmen und eine Standardkurve zu erhalten. HINWEIS: Messen Sie für zukünftige Experimente die OD bei 600 nm und verwenden Sie diese Standardkurve, um eine sofortige Schätzung der KBE in einer bakteriellen Lösung zu erhalten. ACHTUNG: UPEC sind pathogene Bakterien, stellen Sie sicher, dass die Räume ordnungsgemäß ausgestattet sind und verwenden Sie persönliche Schutzausrüstung.</li>
		</ol>
</li>
	</ol></li>
	<li>Drei Tage vor der Instillation<ol>
<li>Erhalten Sie einzelne Kolonien, indem Sie den Glycerinvorrat der Bakterien unter Verwendung einer Impfschleife auf LB-Platten, ergänzt mit 50 μg / ml Km, und kulturieren Sie über Nacht bei 37 ° C. Verschließen Sie diese Platten mit einer Paraffinfolie und lagern Sie sie bei 4 °C bis zu 1 Woche.</li>
	</ol></li>
	<li>Zwei Tage vor der Instillation<ol>
<li>Füllen Sie ein steriles 14 mL Polystyrol-Rundbodenröhrchen mit Doppelpositions-Schnappkappen mit 5 mL LB-Brühe, ergänzt mit 50 μg / ml Km. Wählen Sie eine einzelne Bakterienkolonie mit einer Impfschleife und fügen Sie diese der LB-Brühe hinzu. Wirbel für 10 s, um eine ordnungsgemäße Mischung zu gewährleisten.</li>
		<li>Kultur statisch mit dem Schnappverschluss in geöffneter Position bei 37 °C über Nacht. HINWEIS: Das statische Wachstum von E. coli fördert die Expression von Typ-1-Pili, die für die Adhärenz und Invasion von Epithelzellen im Urin entscheidend sind.</li>
		<li>Bereiten Sie einen sterilen Erlenmeyer- oder Kulturkolben vor.</li>
	</ol></li>
	<li>Einen Tag vor der Instillation<ol>
<li>Nach der Inkubation das Röhrchen für 10 s vorwirbeln, um eine ordnungsgemäße Homogenisierung der Bakterienkultur zu gewährleisten. Machen Sie eine Subkultur im Erlenmeyer, indem Sie 25 μL der Bakteriensuspension zu 25 ml frischem LB-Medium ohne Antibiotika hinzufügen.</li>
		<li>Schließen Sie den Erlenmeyer und die Kultur statisch bei 37 °C über Nacht.</li>
	</ol></li>
	<li>Am Tag der Instillation<ol>
<li>Wirbeln Sie den Erlenmeyer für 10 s, um eine ordnungsgemäße Mischung zu gewährleisten.</li>
		<li>Die Kultur aus dem Erlenmeyer in ein 50 mL Kulturröhrchen gießen und bei 3.000 x g und 4 °C für 5 min zentrifugieren. Dekantieren Sie den Überstand und resuspenieren Sie das Bakterienpellet in 10 mL sterilem PBS und Wirbel erneut für 10 s.</li>
		<li>Wählen Sie die experimentelle Konzentration des Inokulums (KBE) und verwenden Sie die in Schritt 1.1.2 erhaltene Standardkurve, um die entsprechenden OD 600 nm zu bestimmen.</li>
		<li>1 ml der resuspendierten Bakterienkultur in 9 ml steriles PBS geben und die OD bei 600 nm überprüfen. Stellen Sie weiter ein, indem Sie entweder steriles PBS oder konzentrierte Bakterienlösung hinzufügen, bis die gewünschte OD 600 nm erreicht ist7. HINWEIS: Zum Beispiel für UTI89-lux die Kultur durch Hinzufügen von PBS anpassen, bis der OD 600 nm 0,45 erreicht, was 2 x 107 KBE / 50 μL entspricht. Um die Anzahl der lebensfähigen CFUs zu überprüfen, machen Sie 10-fache serielle Verdünnungen und platten Sie 50 μL der fünften und sechsten 10-fachen Verdünnung auf LB-Platten in dreifacher Ausfertigung, um weniger als 300 Kolonien zu erhalten. Zählen Sie die erhaltenen Kolonien am nächsten Tag nach der nächtlichen Inkubation bei 37 ° C. OD 600 nm ergibt eine sofortige Ablesung, verwenden Sie jedoch CFU als Qualitätskontrolle.</li>
	</ol></li>
</ol>2. Impfung der Tiere (angepasst von7,16)
<ol><li>Vorbereitung der Tiere<ol>
<li>Wählen Sie den gewünschten Mausstamm (die gewünschten Mausstämme) in Abhängigkeit von der Forschungsfrage und der Verfügbarkeit von Knock-out-Linien, experimentellen Details und Unterschieden in der UTI-Anfälligkeit5,17. Denken Sie daran, dass die transurethrale Katheterisierung bei weiblichen Mäusen einfacher ist. Verwenden Sie keine Tiere, die jünger als 8 Wochen sind, da sie immunologisch unreif sind. Hier wurden 12 Wochen alte weibliche C57Bl/6J-Mäuse verwendet.</li>
		<li>Bestellen Sie Tiere rechtzeitig im Voraus und lassen Sie sie sich akklimatisieren, idealerweise für 7 Tage. Gruppenhaustiere in einzeln belüfteten Käfigen unter standardisierten 12 h Hell/Dunkel-Bedingungen.</li>
		<li>Rasieren Sie die Bauchregion der Tiere, um den Signalverlust zu begrenzen. Verwenden Sie keine Haarentfernungscreme, da sie die Haut der Tiere schnell verbrennen kann. Halten Sie das Tier zurück, indem Sie den Scruff und die Hinterbeine mit der nicht dominanten Hand fest halten, während Sie sich mit der dominanten Hand rasieren. Alternativ können Sie sich unter Isoflurananästhesie rasieren. HINWEIS: Die Tiere wurden 2 Tage vor der Bildgebung rasiert, wenn man bedenkt, dass die Tiere den rasierten Bereich noch weiter pflegen werden.</li>
		<li>Stellen Sie während des gesamten Experiments Wasser und Standardnahrung ad libitum zur Verfügung. Nehmen Sie den Tieren jedoch 2 h vor dem Einträufeln Wasser, um das Blasenvolumen während der Instillation zu minimieren.</li>
		<li>Montieren Sie eine sterile 24 G Angiokatheterspitze auf eine 100 μL Spritze und füllen Sie die Spritze mit der in Schritt 1.5.3 hergestellten Bakterienlösung. HINWEIS: Um die Hintergrundlumineszenz zu bestimmen, erhalten Sie vor der Instillation ein Basislinienbild (siehe Schritt 3 unten).</li>
	</ol>
</li>
	<li>Instillation der Tiere<ol>
<li>Legen Sie die Tiere in eine Induktionskammer und betäuben Sie sie durch Inhalation von Isofluran mit reinem Sauerstoff als Trägergas (Induktion bei 3% und Erhaltung bei 1,5%).</li>
		<li>Legen Sie ein Tier in Rückenlage auf eine Arbeitsfläche und halten Sie während der Instillation eine stabile Isoflurananästhesie mit einem Nasenzapfen aufrecht. Tragen Sie die Augensalbe auf.</li>
		<li>Vertreiben Sie den Resturin durch sanfte Kompression und kreisförmige Bewegungen auf der suprapubischen Region. Reinigen Sie den Unterbauch vor der Instillation mit 70% Ethanol.</li>
		<li>Schmieren Sie die Katheterspitze mit normaler Kochsalzlösung. Legen Sie den Zeigefinger der nicht dominanten Hand auf den Bauch und drücken Sie ihn sanft nach oben. Beginnen Sie die Katheterisierung der Harnröhre in einem Winkel von 90 ° (vertikal) und kippen Sie sie, sobald ein Widerstand auftritt, horizontal, bevor Sie sie weiter einführen (0,5 cm). HINWEIS: Drücken Sie den Katheter niemals gewaltsam, da dies die Harnröhre schädigt. Sanfte Drehbewegungen können bei der Kathetereinführung hilfreich sein. Auf der anderen Seite deutet ein Mangel an Widerstand in der Regel auf ein fehlerhaftes Einführen in die Vagina hin.</li>
		<li>Führen Sie eine langsame (5 μL/s) Instillation von 50 μL des bakteriellen Inokulums (2 x 107 KBE) durch. HINWEIS: Höhere Volumina oder eine schnellere Instillation können zu Reflux in die Nieren führen. Während der Praxis der Technik kann blaue Tinte verwendet werden, um den Reflux zu bewerten.</li>
		<li>Halten Sie nach dem Einträufeln sie die Spritze und den Katheter noch einige Sekunden an Ort und Stelle und ziehen Sie sie dann langsam zurück, um ein Auslaufen zu vermeiden. Notieren Sie alle Unregelmäßigkeiten wie eine hohe Menge an Leckagen oder einen blutigen Meatus und schließen Sie tiere aus, falls erforderlich.</li>
		<li>Positionieren Sie das Tier in Rückenlage am Nasenkegel der bildgebenden Kammer und wiederholen Sie die vorhergehenden Schritte 2.1.1-2.1.6 für alle übrigen Tiere. Verwenden Sie einen Katheter pro Versuchsgruppe. Stellen Sie sicher, dass die Anästhesie fortgesetzt wird und minimieren Sie die Zeit zwischen dem ersten und dem letzten Tier.</li>
		<li>Falls erforderlich, verabreichen Sie Antibiotika oder experimentelle Medikamente vor oder nach der Bildgebung (Schritt 3). Zum Beispiel, um Enrofloxacin zu verabreichen, fügen Sie 40 μL der Enrofloxacin (100 mg / ml) -Lösung zu 3,96 ml physiologischer Kochsalzlösung hinzu, um eine 1/100-Verdünnung zu erhalten. 100 μL/10 g subkutan um 9 und 17 Uhr injizieren, um 3 Tage lang zweimal täglich 10 mg/kg Enrofloxacin zu verabreichen.</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. Biolumineszenz-Bildgebung
<ol><li>Aufbereitung und Auswahl von Bildgebungsparametern<ol>
<li>Öffnen Sie die BLI-Erfassungssoftware (siehe Materialtabelle)und klicken Sie im Bildgerät auf Initialisieren (siehe Materialtabelle), um das Kamera- und Stage-Controller-System zu testen und die CCD-Kamera auf -90 °C zu kühlen. HINWEIS: Während dieses Vorgangs ist die Tür verriegelt und der Fortschritt der Initialisierung kann auf dem Bedienfeld verfolgt werden. Ein grünes Licht zeigt an, dass die Temperatur von -90 °C erreicht ist. Eine Warnung wird angezeigt, wenn vor Abschluss der Initialisierung eine Bildgebung versucht wird.</li>
		<li>Sicherstellen, dass Daten automatisch gespeichert werden: Klicken Sie auf Erfassung Automatisch speichern in und wählen Sie den richtigen Ordner aus.</li>
		<li>Wählen Sie Lumineszenz und Fotografieren aus. Überprüfen Sie die Standard-Lumineszenzeinstellungen: Stellen Sie den Anregungsfilter auf Block und den Emissionsfilter auf Öffnen ein.</li>
		<li>Stellen Sie die Belichtungszeit bei der Aufnahme des ersten Bildes auf Auto ein, insbesondere wenn Sie ein schwaches Signal erwarten, um eine ausreichende Anzahl von Photonen zu gewährleisten. Für In-vivo-Messungen und helle Signale stellen Sie die Belichtungszeit auf ~30 s ein. Wenn das Bild gesättigt ist, wird eine Warnung angezeigt. Wenn dies geschieht, reduzieren Sie die Belichtungszeit.</li>
		<li>Wählen Sie das Medium Binning, F/Stop 1 und wählen Sie das richtige Sichtfeld (FOV) (D für 5 Tiere).</li>
		<li>Stellen Sie die Motivhöhe auf 1 cm ein, wenn Sie Mäuse abbilden.</li>
		<li>Klicken Sie in der Systemsteuerung für die Erfassung dreimal auf Hinzufügen, um eine Sequenz von drei Bildern als technische Replikate zu erhalten.</li>
	</ol></li>
	<li>Bildgebung<ol>
<li>Platzieren Sie Mäuse in der Bildgebungskammer in Rückenlage und verwenden Sie den mannigfaltigen Nasenkegel, um die Anästhesie (Isofluran 1,5%) während des gesamten Experiments aufrechtzuerhalten. Stellen Sie bis zu 5 Mäuse gleichzeitig vor und trennen Sie die Tiere mithilfe der Lichtleitwand, um eine Reflexion zu verhindern.</li>
		<li>Schließen Sie die Tür und klicken Sie auf Erfassen, um die Bildgebungssequenz zu starten.</li>
		<li>Füllen Sie detaillierte Informationen über das Experiment aus (Wildtyp- und Knockout-Tiere, Behandlungen, Tag der Bildgebung usw.). Die Imaging-Einstellungen, wie z.B. die Belichtungszeit, werden automatisch gespeichert.</li>
		<li>Entfernen Sie Mäuse aus der Bildgebungskammer und bringen Sie sie in ihren Käfig zurück. Überprüfen Sie die vollständige Genesung nach der Narkose. Innerhalb von Minuten sollten die Tiere vollständig wach und explorativ sein. Bieten Sie keine Analgesie an, da dies den UTI-Kurs beeinträchtigen könnte18.</li>
		<li>Bringen Sie die Käfige bis zum nächsten Bildgebungszyklus in die belüfteten Racks zurück. Nach Abschluss des Experiments werden die Tiere durch CO2-Erstickung oder zervikale Luxation eingeschläfert. Tun Sie dies vor der Wiederherstellung der Isofluran-Anästhesie, um die Belastung zu minimieren.</li>
	</ol></li>
	<li>Analyse der Bilder<ol>
<li>Starten Sie die Imaging-Software und laden Sie die experimentelle Datei, indem Sie auf Durchsuchenklicken.</li>
		<li>Verwenden Sie die Werkzeugpalette, um die Farbskala des Bildes anzupassen. Standardisieren Sie den visuellen Aspekt der Ergebnisse, indem Sie für alle Bilder die gleichen Einstellungen verwenden, d. H. Verwenden Sie eine logarithmische Skala mit einem Minimum von 104 bis maximal 107 Photonen. Diese Anpassungen betreffen nicht die Rohdaten, sondern nur die grafische Darstellung.</li>
		<li>Verwenden Sie die ROI-Tools, um eine Region of Interest (ROI) auf dem Bild zu zeichnen. Stellen Sie sicher, dass der ROI groß genug ist, um den gesamten Bereich abzudecken, und verwenden Sie die gleichen Abmessungen für alle Bilder. Hier wurde ein quadratischer ROI von 3,5 cm x 4,5 cm über den Unterbauch gelegt.</li>
		<li>Klicken Sie auf ROI-Messung, um die Lichtintensität (Anzahl oder Gesamtphotonenfluss) zu quantifizieren. Exportieren Sie diese Daten und verwenden Sie den Durchschnitt der technischen Replikate. HINWEIS: Zählungen stellen die Anzahl der von der Kamera erkannten Photonen dar und sollten nur für die Bildqualitätskontrolle verwendet werden. Um Daten zu melden, verwenden Sie den gesamten Photonenfluss. Der gesamte Photonenfluss ist physiologisch relevanter, da er das von der Oberfläche emittierte Licht darstellt und eine kalibrierte Einheit ist, die um die Belichtungszeit (pro Sekunde) korrigiert wird.</li>
	</ol></li>
</ol>

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</ol>

Die Autoren erklären keine Interessenkonflikte.

Vorteile von BLI gegenüber CFU-Zählungen Längsschnittdaten Ein großer Nachteil der traditionellen Methode zur Zählung der KBE zur Quantifizierung der mikrobiellen Belastung ist die Anforderung von postmortalen Organhomogenaten, die nur einen Querschnittsdatenpunkt pro Tier liefern. Umgekehrt ermöglicht BLI eine nicht-invasive Längsschnitt-Nachsorge infizierter Tiere. Die Tiere können 2 bis 3 Mal am Tag abgebildet werden und geben einen detaillierten Einblick in die Kinetik der Infektion. D...

Harnwegsinfektionen (UTI) gehören zu den häufigsten bakteriellen Infektionen beim Menschen. Fast die Hälfte aller Frauen wird im Laufe ihres Lebens eine symptomatische Harnwegsinfektion erfahren1. Infektionen, die auf die Blase beschränkt sind, können zu Harnwegssymptomen wie Zunahme der Harnfrequenz, Dringlichkeit, Hämaturie, Inkontinenz und Schmerzen führen. Wenn die Infektion in die oberen Harnwege aufsteigt, entwickeln die Patienten pyelonephritis mit Unwohlsein, Fieber, Schüttelfrost und Rückenschmerzen. Darüber hinaus leiden bis zu 20% der Patienten mit Harnwegsinfektionen an wiederkehrenden Infektionen, was zu einer dramatischen Abnahme der Antibiotikaempfindlichkeit führt2,3,4. In den letzten Jahren gab es ein wachsendes Interesse an neuartigen Therapien zur Behandlung und Prävention von rezidivierenden Harnwegsinfektionen. Trotz eines besseren Verständnisses der angeborenen und adaptiven Immunität der unteren Harnwege und der bakteriellen Virulenzfaktoren, die für die Invasion und Kolonisierung notwendig sind, wurden keine radikalen Veränderungen im Behandlungsregime auf die tägliche urologische Praxis übertragen2. Um die Pathogenese und Suszeptibilität von Harnwegsinfektionen in vivozu untersuchen, ist ein reproduzierbarer und nicht-invasiver Assay unerlässlich.
Mehrere tierische UTI-Modelle wurden beschrieben, die von Nematoden bis zu Primaten reichen, aber das murine Modell wird überwiegend verwendet5,6. Dieses Modell besteht aus der transurethralen Katheterisierung von (weiblichen) Mäusen und der anschließenden Instillation einer bakteriellen Suspension, am häufigsten uropathogenen Escherichia coli (UPEC), direkt in das Blasenlumen7. Nach der Impfung wurde die Keimbelastung traditionell durch Bestimmung der koloniebildenden Einheiten (KBE) quantifiziert. Diese Technik erfordert das Opfern von Tieren, um postmortale Organhomogenate und serielle Verdünnungen zu erhalten, was die Datenausgabe und Reproduzierbarkeit einschränkt. Darüber hinaus ist eine longitudinale Nachsorge der Keimbelastung bei einzelnen Tieren mit dieser Technik nicht möglich.
1995 schlugen Contag etal. die Verwendung von biolumineszenzmarkierten Krankheitserregern zur Überwachung von Krankheitsprozessen beilebendenTieren vor 8,9. Seitdem wurde die Biolumineszenzbildgebung (BLI) auf zahlreiche Infektionsmodelle wie Meningitis, Endokarditis, Osteomyelitis, Haut- und Weichteilinfektionen usw. angewendet.10,11,12. Im murinen UTI-Modell kann eine UPEC-Dehnung mit dem kompletten Lux-Operon (luxCDABE) von Photorhabdus luminescens verwendet werden13. Eine enzymatische Reaktion wird durch die bakterielle Luciferase katalysiert, die von der Oxidation langkettiger Aldehyde abhängig ist, die mit reduziertem Flavinmononukleotid in Gegenwart von Sauerstoff reagieren und das oxidierte Flavin, eine langkettige Fettsäure und Licht12ergeben. Das Lux-Operon kodiert für die Luciferase und andere Enzyme, die für die Synthese der Substrate benötigt werden. Daher emittieren alle metabolisch aktiven Bakterien kontinuierlich blaugrünes (490 nm) Licht, ohne dass die Injektion eines exogenen Substrats erforderlich ist12. Photonen, die von lux-markiertenBakterien emittiert werden, können mit hochempfindlichen, gekühlten CCD-Kameras (Charge-Coupled Device) erfasst werden.
Die Verwendung von biolumineszierenden Bakterien in einem Modell für Harnwegsinfektionen ermöglicht die longitudinale, nicht-invasive Quantifizierung der Bakterienbelastung, wobei die Notwendigkeit entfällt, Tiere zu festen Zeitpunkten während der Nachbeobachtung für die CFU-Bestimmung zu opfern. Trotz der breiten Palette von Möglichkeiten, die Beweise für die Robustheit dieser BLI-Technik in anderen Bereichen und ihre Vorteile gegenüber klassischen Modellen der Harnwegsinfektion sammeln, wurde sie in der HWI-Forschung nicht weit verbreitet. Das hier vorgestellte Protokoll bietet eine detaillierte Schritt-für-Schritt-Anleitung und hebt die Vorteile von BLI für die gesamte zukünftige UTI-Forschung hervor.

<table><tbody><tr><td>96-Well-Platte aus schwarzem Polystyrol mit flachem Boden</td><td>Corning</td><td>3925</td><td>für in vitro Bildgebung</td></tr><tr><td>Aesculap ISIS</td><td>Aesculap</td><td>GT421</td><td>Haarschneider, mit GT608-Kappe</td></tr><tr><td>Anästhesie-Vaporizer</td><td>Harvard apparatus limited</td><td>N/A</td><td>https://www.harvardapparatus.com/harvard-apparatus-anesthetic-vaporizers.html</td></tr><tr><td>Baytril 100 mg/mL</td><td>Bayer</td><td>N/A</td><td>Enrofloxacin</td></tr><tr><td>BD Insyte Autoguard 24 GA</td><td>BD</td><td>382912</td><td>Gelber Angiokatheter, verwenden Sie eine sterile Kunststoffspitze für die Instillation</td></tr><tr><td>C57Bl/6J Mäuse Janvier</td><td></td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Zentrifuge 5804R</td><td>Eppendorf</td><td>EP022628146</td><td></td></tr><tr><td>Dropsense 16</td><td>Unchained Labs</td><td>Trinean</td><td>zur Messung von OD 600nm</td></tr><tr><td>Dulbecco's Phosphate Buffered Kochsalzlösung, Gibco</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>REF 14040-083</td><td></td></tr><tr><td>Ethanol 70% denaturiert 5L</td><td>VWR international</td><td>85825360</td><td></td></tr><tr><td>Falcon 14ml Tube aus Polystyrol mit rundem Boden, Snap-Cap</td><td>Corning</td><td>352057</td><td></td></tr><tr><td>Falcon 50ml Cellstart</td><td>Greiner</td><td>227285</td><td></td></tr><tr><td>Hamilton GASTIGHT Spritze, PTFE Luer Lock, 100 & Mikro; L</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>26203</td><td>zur Gewährleistung einer langsamen bakteriellen Instillation von 50 &; Mikro; L</td></tr><tr><td>Impföse</td><td>Roth</td><td>6174.1</td><td>Halter: Art.-Nr. Nr. 6189.1</td></tr><tr><td>Iso-Vet 1000mg/g</td><td>Dechra Veterinärprodukte</td><td>N/A</td><td>Isofluran</td></tr><tr><td>IVIS Spectrum In Vivo Imaging System</td><td>PerkinElmer</td><td>REF 124262</td><td>Imaging Device</td></tr><tr><td>Kanamycine Lösung 50 mg/mL</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>CAS 25389-94-0</td><td></td></tr><tr><td>Living Imaging Software</td><td>PerkinElmer</td><td>N/A</td><td>BLI Erfassungssoftware, Version 4.7.3</td></tr><tr><td>Luria Bertani Bouillon</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>REF L3022</td><td>alternativ kann</td></tr><tr><td>Luria Bertani Bouillon mit</td><td>Agar hergestellt werden Sigma-Aldrich</td><td>REF L2897</td><td>alternativ kann</td></tr><tr><td>Petrischale Sterilin 90mm</td><td>hergestellt werden ThermoFisher Scientific</td><td>101VR20</td><td>zum Befüllen mit LB Agar ergänzt mit Km</td></tr><tr><td>Pyrex Kulturkolben 250 mL</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>SLW1141/08-20EA</td><td></td></tr><tr><td>Slide 200 Trinean</td><td>Unchained Labs</td><td>701-2007</td><td>zur Messung von OD 600nm</td></tr><tr><td>UTI89-lux</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td>Großzügiges Geschenk von Prof. Seed</td></tr><tr><td>Vortex</td><td>VWR international</td><td>444-1372</td><td></td></tr></tbody></table>

longitudinale nachsorge von harnwegsinfektionen und deren behandlung bei mäusen mittels biolumineszenz-bildgebung

Longitudinal Follow-Up of Urinary Tract Infections and Their Treatment in Mice using Bioluminescence Imaging

Harnwegsinfektionen (UTI) gehören zu den häufigsten bakteriellen Infektionen beim Menschen und werden routinemäßig mit empirischen Antibiotika behandelt. Aufgrund der zunehmenden mikrobiellen Resistenz ist die Wirksamkeit der am häufigsten verwendeten Antibiotika jedoch zurückgegangen. Um alternative Behandlungsmöglichkeiten zu finden, besteht ein großer Bedarf an einem besseren Verständnis der HWI-Pathogenese und der Mechanismen, die die UTI-Anfälligkeit bestimmen. Um dies im Tiermodell zu untersuchen, ist ein reproduzierbarer, nicht-invasiver Assay zur Untersuchung des Verlaufs der Harnwegsinfektion unabdingbar.
Der Goldstandard für die Aufzählung der Bakterienbelastung ist seit Jahren die Bestimmung von Colony Forming Units (CFU) für ein bestimmtes Probenvolumen. Diese Technik erfordert postmortale Organhomogenate und serielle Verdünnungen, die die Datenausgabe und Reproduzierbarkeit einschränken. Als Alternative gewinnt die Biolumineszenz-Bildgebung (BLI) an Popularität, um die Bakterienbelastung zu bestimmen. Die Markierung von Krankheitserregern mit einem Lux-Operon ermöglicht den sensitiven Nachweis und die Quantifizierung auf nicht-invasive Weise und ermöglicht so eine longitudinale Nachsorge. Bisher ist die Einführung von BLI in der Harnwegsinfektionsforschung begrenzt.
Dieses Manuskript beschreibt die praktische Implementierung von BLI in einem Maus-Harnwegsinfektionsmodell. Hier wird eine Schritt-für-Schritt-Anleitung für die Kultivierung von Bakterien, die intravesikale Instillation und die Bildgebung bereitgestellt. Die in vivo Korrelation mit CFU wird untersucht und ein Proof-of-Concept wird durch den Vergleich der Keimbelastung von unbehandelten infizierten Tieren mit antibiotikabehandelten Tieren erbracht. Darüber hinaus werden die Vorteile, Einschränkungen und Überlegungen speziell für die Implementierung von BLI in einem in vivo UTI-Modell diskutiert. Die Implementierung von BLI im UTI-Forschungsfeld wird die Erforschung der Pathogenese von UTI und die Entdeckung neuer Wege zur Prävention und Behandlung von UTI erheblich erleichtern.

In vivo BLI korreliert mit der KBE des Inokulums zum Zeitpunkt der Instillation. Um die Nachweisgrenze von BLI in vivo und die Korrelation mit der KBE des Inokulums zu bewerten, wurden Mäuse mit unterschiedlichen Konzentrationen von UTI89-lux und PBS als Negativkontrolle infiziert. Vor der Instillation wurden nicht infizierte Tiere gescannt, um die Hintergrundlumineszenz zu bestimmen. Nachfolgende Bilder wurden unmittelbar nach der Instillation aufgenommen ...

Dieses Manuskript beschreibt die intravesikale Verabreichung von uropathogenen Bakterien mit einem Lux-Operon zur Induktion einer Harnwegsinfektion bei Mäusen und die anschließende longitudinale In-vivo-Analyse der Bakterienbelastung mittels Biolumineszenzbildgebung.

Longitudinale Nachsorge von Harnwegsinfektionen und deren Behandlung bei Mäusen mittels Biolumineszenz-Bildgebung

Urinary tract infections (UTI) rank among the most common bacterial infections in humans and are routinely treated with empirical antibiotics. However, ...

Die Aufzählung der koloniebildenden Einheiten schränkte die Reproduzierbarkeit der Forschung im Bereich der Harnwegsinfektion ein. Die Biolumineszenz-Bildgebung wird die In-vivo-UTI-Forschung zur Blasenphysiologie, Harnwegsinfektionspathogenese und Suszeptibilität vorantreiben. Die Biolumineszenz-Bildgebung ermöglicht eine longitudinale Nachsorge mit Echtzeit-Einblick in die Entwicklung der Infektion.Darüber hinaus reduziert es drastisch die Anzahl der benötigten Tiere. Die Biolumineszenz-Bildgebung erleichtert die Erforschung wiederkehrender oder chronischer Infektionen, die beim Menschen häufig auftreten. Darüber hinaus können Forscher aufsteigende Infektionen oder die Verbreitung im Blut mithilfe der Biolumineszenzbildgebung identifizieren.Erhalten Sie einzelne Kolonien, indem Sie den Glycerinbestand von Bakterien mit einer Impfschleife auf LB-Platten, die mit Kanamycinsulfat ergänzt werden, ausstreifen und über Nacht bei 37 Grad Celsius kultivieren. Füllen Sie ein steriles rundes 14-Milliliter-Polystyrol-Bodenrohr mit zweistufigen Schnappkappen mit fünf Millilitern LB-Brühe, ergänzt mit Kanamycinsulfat. Wählen Sie eine einzelne Bakterienkolonie mit einer Impfschleife und fügen

longitudinal-follow-up-urinary-tract-infections-their-treatment-mice

Research

Forschung

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologie und Infektion

Dieses Video demonstriert Methoden zur transurethral induzieren Maus Harnwegsinfektionen und zu quantifizieren, das Ausmaß der daraus resultierenden Infektionen.

Transurethrale Induktion von Maus Harnwegsinfekt

Methoden für die Biolumineszenz-Bildgebung von bakteriellen Infektionen in lebenden Tieren beschrieben. Krankheitserreger werden geändert, um auszudrücken Luciferase ermöglicht optische Ganzkörperbildgebungssysteme von Infektionen in lebenden Tieren. Tiermodelle können mit Luciferase exprimierenden Krankheitserreger infiziert werden und die daraus resultierende Verlauf der Erkrankung visualisiert in Echtzeit durch Biolumineszenz-Bildgebung.

Mit Luciferase to Image Bakterielle Infektionen bei Mäusen

Dieser Artikel beschreibt die Verwaltung...

Bioluminescent Bakterielle Imaging<em&gt; In Vivo</em

Quelle: Valentine, M. E., et al. Generierung von In-Frame-Gendeletionsmutanten in Pseudomonas aeruginosa und Test auf Virulenzabschwächung in einem einfachen Mausmodell der Infektion. J. Vis. Exp. (2020)Dieses Video demonstriert die Verwendung von Biolumineszenz, um das in vivo-Verhalten von virulenten und abgeschwächten Bakterienstämmen bei Mäusen zu visualisieren und zu vergleichen. Es beschreibt die Herstellung von biolumineszierenden Bakteriensuspensionen und deren intraperitoneale...

Verfolgung der bakteriellen Infektionsdynamik in einer Maus mit Hilfe von Biolumineszenz

Quelle: de Vries, C. R., et al., Ein verzögertes Impfungsmodell der chronischen Wundinfektion von Pseudomonas aeruginosa . J. Vis. Exp. (2020).Dieses Video demonstriert eine biolumineszente Bildgebungstechnik zur Überwachung des Verlaufs bakterieller Infektionen in einem lebenden Mausmodell. Pathogene Bakterien, die mit dem luxABCDE-Reportersystem konstruiert wurden, senden Licht an der Infektionsstelle aus, was die Visualisierung metabolisch aktiver Bakterien ermöglicht. Durch die Abbildung...

Biolumineszenzbildgebung bakterieller Infektionen bei Mäusen

Quelle: Valentine, M. E. et al., Erzeugung von In-Frame-Gen-Deletionsmutanten in Pseudomonas aeruginosa und Tests auf Virulenzabschwächung in einem einfachen Mausmodell der Infektion. J. Vis. Exp. (2020)Dieses Video demonstriert die Anwendung eines biolumineszenzbasierten Bildgebungsansatzes zur Überwachung bakterieller Infektionen in einem Live-Mausmodell. Sequentielle biolumineszente und Röntgenbildgebung ermöglicht eine Echtzeitvisualisierung und anatomische Lokalisierung der Infektion, die...

Echtzeitbildgebung bakterieller Infektionen in einem Mausmodell mittels Biolumineszenz

Quelle: Luyts, N., et al. Longitudinale Nachbeobachtung von Harnwegsinfektionen und deren Behandlung bei Mäusen mittels Biolumineszenzbildgebung. J. Vis. Exp. (2021).Dieses Video demonstriert die Induktion und Verfolgung einer Harnwegsinfektion in einem Mausmodell unter Verwendung biolumineszenter E. coli, die in die Blase injiziert wird, wo bakterielle Adhäsion, Invasion und intrazelluläre Replikation stattfinden. Das vom biolumineszente Operon ausgesendetes Licht dient als Echtzeit-Marker für...

Visualisierung der Harnwegsinfektion in einem Mausmodell mittels Biolumineszenz

Source: Hunt, A. M. A., et al. Come to the Light Side: In Vivo Monitoring of Pseudomonas aeruginosa Biofilm Infections in Chronic Wounds in a Diabetic Hairless Murine Model. J. Vis. Exp.(2017).This video demonstrates the procedure for assessing infection clearance and healing progression in a wounded diabetic mouse using bioluminescent and microscopic images.

Bioluminescence Imaging to Track Bacterial Infection and Wound Healing in a Mouse Model

In diesem Video beschreiben wir die Technik zur intravesikalen Verabreichung von uropathogenen Bakterien, um ein Harnwegsinfektionsmodell bei Mäusen zu erstellen. Dieses Modell kann verwendet werden, um die Ausbreitung uropathogener bakterieller Infektionen im Harnsystem und die Mechanismen zu verstehen, die die Anfälligkeit für Harnwegsinfektionen bestimmen.

Generierung eines Harnwegsinfektionsmodells: Eine Technik zur Verabreichung uropathogener Bakterien in der Maus zur Entwicklung eines Harnwegsinfektionsmodells

Multi-Bildgebung ist ein wertvoller Ansatz zur Untersuchung bakterieller Besiedlung in kleinen Tiermodellen. Dieses Protokoll beschreibt Infektion von Mäusen mit...

4D Imaging von Multimodalität<em&gt; Citrobacter rodentium</em&gt; Infektionen bei Mäusen

Das etablierte Modell der transurethrale Katheterisierung von Mäusen ermöglicht die Untersuchung von Erkrankungen der Blase, einschließlich urinausscheidende Fläche Infektion, aber kann nur bei Frauen durchgeführt werden. Ein neues Modell der männlichen transurethrale Instillation, das hier vorgestellte wird Forschung in einem Gebiet, geprägt von starken klinischen und epidemiologischen Unterschiede zwischen den Geschlechtern zu ermöglichen.

Urinausscheidende Fläche Infektion in eine kleine Tiermodell: transurethrale Katheterisierung von männlichen und weiblichen Mäusen

Erfahren Sie, wie Biolumineszenz-Bildgebung die longitudinale Analyse von Harnwegsinfektionen bei Mäusen ermöglicht. Diese Methode reduziert Tierzahlen und liefert Echtzeit-Einblicke in Infektionsdynamik.

Longitudinale Nachsorge von Harnwegsinfektionen und deren Behandlung bei Mäusen mittels Biolumineszenz-Bildgebung

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