Chromosomen-Screening von humanen Präimplantationsembryonen unter Verwendung von verbrauchtem Kulturmedium: Probenentnahme und Chromosomenploidie-Analyse

Das Protokoll besteht darin, die Sammlung des Kulturmediums und die chromosomale Ploidieanalyse auf der Grundlage nicht-invasiver Chromosomen-Screening-NICS von menschlichen Präimplantationsembryonen zu normalisieren. Der Hauptvorteil von NICS ist die einfache Bedienung anstelle der TiDieR-Mikromanipulation, die Zeitersparnis und die effektive Reduzierung des Verlusts invasiver Biopsieproben. Die Probenahmemethode ist sehr flexibel.

Hier bieten wir Ihnen zwei verschiedene Optionen an, eine für die routinemäßige sequentielle Embryonenkultur und eine andere für einen Schritt. Dies sind die Hauptkollegen unseres Teams, Dr. Yaxin Yao und Dr. Xiaohui Zhu, die hauptsächlich für die Bibliotheksvorbereitung und die NICS-Regenerationssequenzierung verantwortlich sind. Dr. Jialin Jia und ich führen die embryologische Arbeit und die Probenentnahme durch.

Professor Liu ist der Leiter unserer Gruppe. Sie ist auch die korrespondierende Autorin dieses Artikels. Bereiten Sie zunächst die Reagenzien und Werkzeuge vor.

Vor Gebrauch 20 bis 30 Mikroliter Nährmedium und Hyaluronidase vorwärmen und ausgleichen. Geben Sie dann das Nährmedium und die Hyaluronidase auf eine Arbeitsfläche in einem Abzug. Überführen Sie die verdauten OCCCs schnell in die Kulturschale für die Handhabung der Eizellen und bedecken Sie sie in jeder Vertiefung mit Mineralöl.

Saugen Sie die Eizellen sanft fünf bis 10 Mal ab und lassen Sie sie frei, um die verbleibenden Granulosazellen um die Eizellen herum zu entfernen. Wiederholen Sie diesen Schritt in den verbleibenden drei Vertiefungen, um die Granulosazellen vollständig zu entfernen. Beurteilen Sie die Vollständigkeit der Entfernung von Granulosazellen mit einem Mikroskop.

Dann führen Sie eine intrazytoplasmatische Spermieninjektion, auch ICSI genannt, durch und übertragen den Embryo auf das Kulturmedium. Bereiten Sie für jeden Embryo 20 bis 30 Mikroliter Mikrotröpfchen des Blastozystenkulturmediums vor. Am zweiten Tag werden die Embryonen in einer Gewebekulturschale mit Mineralöl bedeckt und bei 37 Grad Celsius, 5 % Kohlendioxid und 5 % Sauerstoff inkubiert.

Nachdem Sie den Embryo am dritten Tag in das Waschmikrotröpfchen übertragen haben, saugen Sie den Embryo vorsichtig ab und geben Sie ihn in den drei Tröpfchen nacheinander mit den Pipetten in den drei Tröpfchen frei. Anschließend wird der Embryo in das Blastozystenkulturmedium übertragen. Bereiten Sie die Waschmikrotröpfchen vor und kultivieren Sie die Mikrotröpfchen.

Am Nachmittag des vierten Tages wird der Embryo in vorgewärmte Mikrotröpfchen des Nährmediums überführt und jeder Embryo mit den Pipetten sanft nacheinander in drei Mikrotröpfchen gewaschen. Jeder Embryo wird zur Probenentnahme in ein einzigartiges, vorgewärmtes einzelnes Mikrotröpfchen Kulturmedium übertragen. Kultivieren Sie den Blastozystenembryo vor der Kryokonservierung.

Um die Vitrifikation vor der Kryokonservierung des Embryos durchzuführen, bereiten Sie die Mikrotröpfchen der Kultur vor und überführen Sie den Embryo in vorgewärmte Mikrotröpfchen von 10 bis 15 Mikrolitern Kulturmedium. Und waschen Sie jeden Embryo sanft nacheinander in drei Mikrotröpfchen, indem Sie am Morgen des fünften Tages pipettieren. Wie bereits gezeigt, wird jeder Embryo zur Probenentnahme in ein einzigartiges, vorgewärmtes einzelnes Mikrotröpfchen des Kulturmediums übertragen.

Und kultivieren Sie den Blastozystenembryo bei 37 Grad Celsius und 5 % Kohlendioxid vor der Kryokonservierung. Als nächstes stellen Sie das ICM vorsichtig in einem beträchtlichen Abstand vom Zielpunkt des Laserstrahls ein, der sich auf die Zellverbindung des Trophektoderms konzentriert, um ein kleines Loch im Trophektoderm zu erzeugen, um die Flüssigkeit aus dem Blastocoel-Hohlraum freizusetzen. Um die Probe zu sammeln, tauen Sie den Puffer im Kit bei Raumtemperatur auf und zentrifugieren Sie ihn kurz.

Anschließend wird das Kulturmedium von jedem kultivierten Embryo in ein RNase-DNase-freies PCR-Röhrchen überführt, das fünf Mikroliter des Zelllysepuffers enthält. Bereiten Sie die Reagenzien und Werkzeuge vor. Nach der Quantifizierung der genomischen DNA wird sie mit dem Kulturmedium auf eine Konzentration von 50 Pikogramm pro Mikroliter verdünnt.

Nach gründlichem Mischen wird das Röhrchen fünf Sekunden lang kurz bei 200 G zentrifugiert. Nach dem Zentrifugieren des Nährmediums in einer Mikrozentrifuge für 30 bis 60 Sekunden werden 10 Mikroliter Kulturmedium vom Boden des Röhrchens mit verdünnter Positivkontrolle und frischem Nährmedium in ein neues 0,2-Milliliter-PCR-Röhrchen pipettiert. Fügen Sie einen Mikroliter MT-Enzymmischung hinzu und mischen Sie sie gründlich durch Pipettieren.

Dann sofort für zwei bis drei Sekunden zentrifugieren. Legen Sie das PCR-Röhrchen in eine vorgeheizte Vorbereitungsstation für gemischte Proben und führen Sie das Lyseprogramm durch. Sobald der Pre-Lib-Puffer aufgetaut und gemischt ist, zentrifugieren Sie ihn sofort für zwei bis drei Sekunden bei 200 G. Bereiten Sie einen Mastermix für die Pre-Library-Reaktion vor, indem Sie zwei Mikroliter Pre-Library-Enzymmischung zu 60 Mikrolitern Pre-Library-Puffer hinzufügen.

Die Reaktion gründlich mischen und kurz zentrifugieren. Geben Sie 60 Mikroliter Reaktionsmischung aus der Vorbibliothek in die vorbehandelte Mediumprobe. Nach gründlichem Mischen durch Pipettieren sofort zwei bis drei Sekunden bei 200 G zentrifugieren.Stellen Sie das PCR-Röhrchen in die vorgewärmte Probenvorbereitungsstation.

Führen Sie das Pre-Library-Programm aus und halten Sie es bei vier Grad Celsius. Bereiten Sie eine Mastermischung für die Bibliotheksreaktion vor, indem Sie 1,6 Mikroliter Bibliotheksenzymmischung zu 60 Mikrolitern Bibliothekspuffer hinzufügen. Mischen Sie die Reaktion gründlich und zentrifugieren Sie sie wie zuvor gezeigt.

Geben Sie 60 Mikroliter der Bibliotheksreaktionsmischung und zwei Mikroliter des Barcode-Primers zu jedem Vorbibliotheksprodukt. Dann wird die Reaktion gründlich gemischt und wie gezeigt zentrifugiert. Legen Sie das PCR-Röhrchen nach der Zentrifugation in den Thermocycler.

Führen Sie das Bibliotheksvorbereitungsprogramm aus und halten Sie es dann bei vier Grad Celsius. Bereiten Sie die Reagenzien und Werkzeuge vor. Fügen Sie die vorbereiteten 1X präparierten Megaperlen zum Bibliotheksbeispiel hinzu.

Quantifizieren Sie die gereinigten Bibliotheken, wie im Textmanuskript beschrieben, und verwenden Sie 10 Nanogramm jeder Bibliotheksprobe für das Pooling. Lesen Sie das Benutzerhandbuch für die Sequenzierung und führen Sie nach Abschluss der Sequenzierung eine Datenanalyse durch. Geben Sie den Namen und das Passwort des Benutzers auf der Anmeldeseite für die Datenanalyse in ChromGo ein.

Sobald Sie angemeldet sind, klicken Sie auf der Registerkarte "NICS" auf "Übermittlung erstellen". Wählen Sie dann NGS für die Plattform, Illumina für Corporation und NICSInst für das Reagenz. Geben Sie die Projektinformationen in das Feld unter Projekt-ID ein.Legen Sie die Analyseeinstellungen fest und laden Sie die Dateien hoch.

Sobald alle Sequenzierungsdateien erfolgreich hochgeladen wurden, klicken Sie auf Senden, um die Analyse zu starten. Die eingereichten Projekte werden auf der Registerkarte "Einreichungen anzeigen" aufgelistet. Klicken Sie im Feld Bericht auf die Schaltfläche Anzeigen, um die Übersichtstabelle der NICS-Analyse anzuzeigen.

Klicken Sie auf die Schaltfläche Bericht exportieren, um die Berichte zu speichern. Sechs Blastozysten wurden von den Patientinnen entnommen und NICS wurde an allen sechs Embryonen vom vierten bis zum fünften Tag durchgeführt. Die Chromosomenanomalien, die durch die balancierte Translokation der Eltern verursacht wurden, wurden in fünf der Chromosomen mit dem NICS-Assay nachgewiesen und daher nicht für den Transfer verwendet.

Die NICS-Ergebnisse der beiden Embryonen zeigten, dass der gleiche Karyotyp 45 XN und die Chromosom-18-Deletion beide Chromosom-18-Deletionen waren. Der kurze Arm des Karyotyps 46 XN der Deletion der Chromosomenregion war nur der kurze Arm der Deletion der Chromosomenregion. Die NICS-Ergebnisse zeigten den Karyotyp 46 XN mit dem langen Arm der Chromosom-18-Regionendeletion und dem kurzen Arm der Duplikation der Chromosom-18-Region.

Obwohl es sich bei den Karyotypen um Chromosomen-5-Duplikationen handelte und acht Mosaikunterschiede aufwiesen, konnte der NICS-Assay alle 24 Chromosomen auf Aneuploidie untersuchen. Dieses Verfahren bietet eine neue Methode zur Übertragung einzelner Blastozysten des normalen Karyotyps. Bei diesem Verfahren ist es wichtig, daran zu denken, die kumulären Zellen vollständig zu entfernen, um die Kontamination mütterlichen Ursprungs zu vermeiden, und das Kulturmedium und das Blastozystenstadium zu sammeln, wenn der DNA-Gehalt für die Amplifikation ausreicht.

Durch den Einsatz der NICS-Technologie rationalisierte die vorliegende Studie die Vorbereitungsschritte der WGA- und WGS-Bibliothek in etwa drei Stunden und das nicht-invasive CCS-Ergebnis in etwa neun Stunden. Nach ihrer Entwicklung bot die Technik dem Kliniker in der ART eine neuartige Möglichkeit, die morphologische Beurteilung mit NICS zu kombinieren, um aploiden Embryo mit guter Morphologie in die Gebärmutter zu übertragen, was die laufenden Schwangerschaftsraten und Lebendgeburtenraten verbessern könnte.