Anwendung der CRISPR-Interferenz (CRISPRi) zur Gen-Silencing bei pathogenen Leptospira-Spezies

Mein Name ist Jarlath Nally, und ich bin Teil des Forschungsteams hier am National Animal Disease Center in Ames, Iowa, und wir arbeiten an Leptospirose. Leptospirose ist eine vernachlässigte Krankheit. Es ist eine globale Krankheit.

Und wirklich, wir haben ein sehr begrenztes Verständnis davon, wie diese einzigartige Gruppe von Bakterien Infektionen verursacht. In der heutigen Präsentation geht es also darum, einen Überblick über ein neues Werkzeug zu geben, das zur Verfügung steht, um die Bewertung pathogener Mechanismen der Leptospirose zu erleichtern, indem bestimmte Gene, die von Leptospira exprimiert werden, mit einer Technik namens CRISPR-Interferenz spezifisch zum Schweigen gebracht werden. Die Fähigkeit, Newton-Kolonien auszuwählen, hängt jedoch stark davon ab, das beste Wachstumsmedium für diese anspruchsvollen Leptospiras bereitzustellen.

Also, zuerst werden wir Ihnen Rick Hornsby vorstellen, der sehr kurz ein neues Medium eingeführt hat, um diese anspruchsvollen Bakterien zu vermehren. Und dann stellen wir Ihnen Louis Fernandez vor, der über die CRISPR-Interferenzmethodik sprechen wird, um Zielgene in Leptospira zum Schweigen zu bringen. Hallo, ich bin Rick Hornsby.

Seit ihrer Identifizierung durch Anada vor über 100 Jahren wurden Leptospiras typischerweise bei 29 Grad Celsius isoliert und vermehrt, einer Temperatur, die weder die Umwelt noch die Körpertemperatur des Säugetierwirts widerspiegelt. Vor 10 Jahren begann USDA ERS mit der Erforschung von Verbesserungen auf Leptospira-Medien und aus dieser Forschung wurde Hornsby-Alt-Nally-Medien entwickelt. Mit diesen Medien konnten Kliniker und Forscher Leptospiras aus Feldfällen und in der In-vitro-Forschung bei einer Temperatur und in einer Umgebung, die dem Säugetierwirt näher ist, schneller isolieren und vermehren.

Wir optimieren diese Medien weiterhin, aber so wie es aussieht, hat HAN das Potenzial gezeigt, die veterinärmedizinische und menschliche klinische Isolierung in vitro-Forschung und die Entwicklung wirksamerer Impfstoffe zur Vorbeugung von Leptospirose signifikant zu verbessern. Hallo, ich bin Louis Fernandez. Bisher war die Pathogenese der Leptospirose noch wenig erforscht, hauptsächlich aufgrund des Mangels an wirksamen und einfach durchzuführenden genetischen Röhrchen.

Hier werden wir eine neue Technik namens CRISPR-Interferenz oder CRISPRi beschreiben. Und diese Technik ist sehr einfach, weil wir nur zwei Komponenten exprimieren müssen, ein DNA-bindendes Protein namens dead Cas9 oder dCas9 und ein chimäres RNA-Molekül namens Single-Guide-RNA. Und der Komplex dCas9 und die Leit-RNA werden die Basenpaarung zu unserem Zielgen bilden und daher die Transkription reduzieren oder sogar blockieren.

Auch durch die Verwendung der neu beschriebenen HAN-Medien konnten wir die Koloniebildungszeit für eine Mutantenerholung drastisch verkürzen. Der erste Schritt besteht darin, den Protospacer zu definieren, der in der Leit-RNA enthalten sein wird. Diese Sequenz umfasst 20 Nukleotide, die die Basenpaarung zu den gewünschten Genzielen definieren.

Senden Sie eine Nukleotidsequenz an den Webserver CHOPCHOP, wobei Parameter für Streptococcus pyogenes, Cas9, und Protospacer adjacent motif, NGG, definiert sind. Wählen Sie basierend auf den Ergebnissen Protospacer mit den besten Werten innerhalb des Minustrends aus. Das NGG-Motiv wird nicht in die endgültige Sequenz aufgenommen.

Wir haben den lipL32-Promotor zur Exprimierung der Single-Guide-RNA verwendet, die die variablen 20 Nukleotide an fünf Primzahlen an einem konservierten dCas9-Gerüst enthalten wird. Nach Erhalt der Kassette wird sie in die PMaOri verbannt. dCas9-Plasmid auf der Xma1-Einschränkungsseite.

Zur Konjugation werden Leptospirazellen bei 29 oder 37 Grad Celsius in HAN-Medien gezüchtet. Einen Tag vor einer Konjugation werden Donor-Ausgleichszellen in LB-Medien gezüchtet, die mit Diaminopimelsäure, DAP und Spectinomycin ergänzt sind. Als nächstes grillen Am Tag der Konjugation die gesättigten E.coli-Kulturen in LB plus DAP.

In einer Biosicherheitshaube montierte die Filtervorrichtung, indem der Membranfilter auf die Glasbasis gelegt wurde, gefolgt von einem 15 ML Glastrichter. Beide Teile werden durch diese Federklemme zusammengehalten. Dann verbinden Sie das Glas mit einer Vakuumpumpe, fügen Sie fünf ML Leptospira-Kulturen in den Trichter hinzu.

Als nächstes fügen Sie den E.Coli beta 2163-Stamm hinzu, der das plasmid von Interesse enthält. Das Volumen variiert je nach optischer Dichte der Kultur. Wir streben eine Eins-zu-Eins-Zell-Pipersion an.

Drehen Sie die Vakuumpumpe, jetzt werden Flüssigkeiten, die wir durch die Membran bekommen, und die Zellen werden darauf konzentriert. Nehmen Sie den Filter und legen Sie ihn auf die EMJH-Platte plus DAP, Bicurier-Seite nach oben. Inkubieren Sie die Platten bei 29 Grad Celsius für 24 Stunden.

Dann die Filter von den Platten zurückholen und in ein 50 ML konisches Rohr geben. Verwenden Sie ein ML flüssiges HAN-Medium, um die Zellen durch Pipettieren aus dem Filter zu gewinnen. Visualisieren Sie die wiederhergestellten Zellen durch Dunkelfeldmikroskopie.

In diesem Stadium können äquivalente Zahlen von E.coli und Leptospiras gesehen werden. 100 bis 200 Mikroliter werden verwendet, um die Bakterien auf HAN-Platten zu verteilen, die Spectinomycin enthalten. In diesem Stadium wird DAP weggelassen und E.coli wird nicht wachsen.

Die Platten werden bei 37 Grad Celsius und 3% CO2 inkubiert. Kolonien sollten zwischen acht und 10 Tagen sichtbar sein. Leptospira interrogans Kolonien sind ein wenig schwierig zu visualisieren.

Hier zeigen wir überwucherte Kolonien, um sie leichter zu sehen. Fügen Sie 100 Mikroliter flüssiges HAN zu 1,5 ML-Röhrchen hinzu, um die Mutanten zurückzugewinnen. Es wird empfohlen, mindestens drei Kolonien von jedem Teller zu nehmen.

Mit einer Pipettenspitze werden einzelne Kolonien von den Platten geborgen. Es wird erwartet, dass Agger alleine genommen wird. Kolonien sollten von Kontrollplatten entnommen werden, die MTP PMaOri enthalten.

dCas9 Plasmid. Und Platten mit Leptospiras, die Plasmid enthalten, sowohl mit dCas9 als auch mit Leit-RNA, die für das Zielgen entwickelt wurden. Die geborgenen Zellen können nun unter Dunkelfeldmikroskopie visualisiert werden, um das Vorhandensein von lebensfähigen Leptospirasen zu bestätigen.

Nach der Visualisierung von Leave Leptospiras werden die Zellen auf flüssige HAN-Medien übertragen, die Spectinomycin enthalten. Nach dem Kulturwachstum können nun Zellen zur Stummschaltungsbestätigung und Phänotypbewertung wiederhergestellt werden. Wenn Antikörper gegen die Zielproteine verfügbar sind, ist Immunoblot eine einfache Methode, um das Silencing zu bewerten.

Leptospiras, die pMAOri enthalten. dCas9 allein oder mit der Leit-RNA Cas werden mittels PCR, holzflankenden Primern, ausgewertet. DMT-Plasmid führt zu einem Band von etwa 300 Basenpaaren und nur etwa 700 wird erreicht, wenn die Leit-RNA-Kassette vorhanden ist.

Immunoblots mit ganzzelligen Extrakten werden zur Stummschaltungsbestätigung durchgeführt, die lipL32-Proteinexpression wird in Zellen, die Plasmide enthalten, die in dCas9 exprimiert werden, abgeschafft und leiten RNA, die auf dieses Gen abzielt. Und sowohl Link A als auch Link B fehlen in Zellen, die die Leit-RNA enthalten, ist spezifisch für beide Gene. Die Steuerung lipL41 ist in allen Fahrspuren zu sehen.

Also haben wir CRISPR-Interferenz bei Leptospira-Interroganen verwendet, wir haben es auch bei mehreren zusätzlichen pathogenen Leptospira-Arten verwendet. Wir haben es verwendet, um bestimmte Gene zum Schweigen zu bringen und die Expression kleiner nicht-kodierender RNAs zum Schweigen zu bringen. Unser Forschungsinteresse besteht darin, pathogene Mechanismen der Infektion zu verstehen, daher versuchen wir normalerweise, Varianzfaktoren zu identifizieren, aber offensichtlich können Sie Ihr eigenes Gen der Wahl und entsprechend Ihrem eigenen Forschungsgebiet zum Schweigen bringen.

Und das könnte zum Beispiel Motilität oder das Verständnis sein, wie Leptospiras in der Umwelt persistieren, oder Der Stoffwechsel. In jedem Fall sollten Sie in der Lage sein, eine spezifische Mutante zu erzeugen, die es Ihnen ermöglicht, funktionelle Genomik durchzuführen und die biologische Bedeutung des betreffenden Gens zu verstehen. Von uns allen hier im National Animal Disease Center wünschen wir Ihnen viel Glück bei Ihrer Forschung.