Name: Implantation eines kranialen Fensters für wiederholte In-vivo-Bildgebung bei wachen Mäusen (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-06-22T15:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 33 s
Description: Lernen Sie die Implantation eines kranialen Fensters für wiederholte In-vivo-Bildgebung bei wachen, kopffixierten Mäusen. Diese Methode ermöglicht die langzeitliche Untersuchung neuronaler und astrozytärer Dynamiken.

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Alle Tierversuche wurden in Übereinstimmung mit den von der IACUC am University of Nebraska Medical Center genehmigten Richtlinien durchgeführt.
1. Vor der Operation
<ol><li>Bereiten Sie Pipetten für virale Injektionen vor. Ziehen Sie Borosilikatglaskapillaren mit einem Pipettenabzieher und fase Sie die Pipette in einem Winkel von 20°. Sterilisieren Sie die Pipetten über Nacht.</li>
	<li>Bereiten Sie frische Stücke sterilen Gelschaums vor, indem Sie sie in kleine Quadrate schneiden. Tauchen Sie den Gelschaum in ein steriles Mikrofugenröhrchen, das 0,5 ml Kochsalzlösung enthält. Weichen Sie den Gelschaum vor Gebrauch mindestens 30 Minuten in Kochsalzlösung ein.</li>
	<li>Bereiten Sie frische Stücke von Schwammstreifen vor, indem Sie sie in dünne Streifen schneiden.</li>
	<li>Zwanzig Minuten vor der Operation injizieren Sie 4-6 Wochen alten GLAST-CreER/GCaMP6f-Mäusen intraperitoneal 0,2 mg/kg Dexamethason, um eine Schwellung des Gehirns zu verhindern, und 5 mg/kg Carprofen zur Verringerung der Entzündung. HINWEIS: Um die Rekombination und Expression von GCaMP6f in etwa 40% der Astrozyten zu induzieren, wurden GLAST-CreER/GCaMP6f-Mäusen nach 3 Wochen an 5 aufeinanderfolgenden Tagen 100 mg/kg Tamoxifen injiziert.</li>
</ol>2. Beginn der Operation
<ol><li>Nach 20 min die Mäuse mit 3% Isofluran mit Sauerstoff bei einer Durchflussrate von 1 L/min für ca. 1,5 min betäuben.</li>
	<li>Legen Sie die Maus nach der Betäubung auf einen stereotaktischen Rahmen, der auf einer Wasserumlaufdecke sitzt, um während der gesamten Operation eine Körpertemperatur von 37 ° C aufrechtzuerhalten. Befestigen Sie die Maus mit der Schnauzenklemme und den Ohrbügeln am Rahmen. Stellen Sie sicher, dass die Schnauzenklemme und die Ohrstangen stabil genug sind, dass sich der Kopf während des Eingriffs nicht bewegt, aber nicht so fest, dass der Schädel beschädigt wird.</li>
	<li>Halten Sie die Anästhesie mit 1-1,5% Isofluran mit Sauerstoff bei einer Durchflussrate von 1-2 l / min aufrecht. Beachten Sie, dass einige Tiere möglicherweise mehr oder weniger Isofluran benötigen, um die Sedierung aufrechtzuerhalten. Überwachen Sie die Atmung des Tieres sowie seine Reflexe auf Zehen- und Schwanzkneifen und passen Sie das Isofluran entsprechend an.</li>
	<li>Tragen Sie Augensalbe mit einem Baumwollspitzenapplikator auf jedes Auge auf, um zu verhindern, dass die Augen während des Eingriffs austrocknen.</li>
	<li>Rasieren Sie mit Nagetiertrimmern die Haare vom Hals bis knapp hinter den Augen. Seien Sie vorsichtig, um sicherzustellen, dass die Schnurrhaare des Tieres nicht versehentlich beschnitten werden.</li>
	<li>Reinigen Sie den rasierten Bereich mit einem Jod-Prep-Pad, gefolgt von einem Alkohol-Prep-Pad.</li>
	<li>Schneiden und entfernen Sie mit steriler Gewebezange und chirurgischer Schere die Haut von den frontalen Nähten vor der Bregma bis hin zum Lambda.</li>
	<li>Sobald die Haut entfernt ist, fügen Sie dem Schädel etwa 0,1 ml 1% Xylocain (Lidocain mit Adrenalin 1: 200.000) hinzu, um die Blutung des Schädels zu minimieren.</li>
	<li>Mit einer sterilen chirurgischen Klinge aus Kohlenstoffstahl der Größe 11, die an einem Griff befestigt ist, kratzen Sie das Bindegewebe vorsichtig vom Schädel. Seien Sie besonders vorsichtig, wenn Sie das Bindegewebe in der Nähe des Schädelrandes entfernen, da verbleibendes Gewebe später eine starke Haftung des Glases oder der Kopfplatte verhindern könnte.</li>
	<li>Verwenden Sie sterile Gewebezangen, um loses Bindegewebe aus dem Schädel zu entfernen.</li>
	<li>Reinigen Sie mit sterilen Baumwollspitzenapplikatoren das verbleibende Xylocain aus dem Schädel.</li>
	<li>Sobald Sie fertig sind, entfetten Sie den Schädel gründlich mit einem sterilen Baumwollspitzenapplikator, der in Aceton getaucht ist. Verwenden Sie Druckluft, um den Schädel sofort zu föhnen.</li>
</ol>3. Kraniotomie
<ol><li>Messen Sie mit einem Feinpunktmarker und einem Lineal die passende Größe für die Öffnung an der gewünschten Stelle. Bestätigen Sie die Größe der Öffnung, indem Sie sie mit der Größe des Deckglases (3 oder 5 mm Durchmesser) vergleichen. Stellen Sie sicher, dass die Öffnung etwas kleiner als die Größe des Deckglases ist.</li>
	<li>Zeichnen Sie mit einem Zahnbohrer allmählich die Umrisse der Öffnung nach und dünnen Sie den Knochen aus. Bohren Sie langsam, um ein Bohren durch den Knochen zu verhindern, und bohren Sie in konzentrischen Kreisen, um eine gleichmäßige Ausdünnung des Knochens zu erleichtern.</li>
	<li>Fügen Sie nach jedem konzentrischen Durchgang ein oder zwei Tropfen steriler Kochsalzlösung in den gebohrten Bereich ein. Lassen Sie die Kochsalzlösung mindestens 10 s sitzen, um zu verhindern, dass der Knochen überhitzt und die darunter liegende Dura beschädigt.</li>
	<li>Verwenden Sie einen sterilen Baumwollspitzenapplikator, um verbleibende Kochsalzlösung zu absorbieren. Blasen Sie Druckluft über den Bereich, um sicherzustellen, dass die gesamte verbleibende Kochsalzlösung verdampft ist, bevor Sie das Bohren wieder aufnehmen. Tun Sie dies, um Knochenreste wegzublasen.</li>
	<li>Wiederholen Sie die Schritte 3.2-3.4, bis der Knochen für die Entfernung ausreichend ausgedünnt ist.</li>
	<li>Stellen Sie sicher, dass der Knochen für die Entfernung ausreichend ausgedünnt ist, indem Sie mit einer feinen Pinzette vorsichtig auf den zentralen Bereich des Knochens drücken, um zu überprüfen, ob sich der ausgedünnte Schädel bewegt. Das darunter liegende Gefäßsystem sollte dort sichtbar sein, wo die Bohrungen stattgefunden haben. Beachten Sie, dass der Knochen so aussehen kann, als würde er dort reißen, wo eine Ausdünnung aufgetreten ist. HINWEIS: Das Training in diesem Stadium ist entscheidend, um festzustellen, wann der Knochen entsprechend ausgedünnt wurde.</li>
	<li>Bevor Sie versuchen, den Knochen zu entfernen, überprüfen Sie die Maus, um sicherzustellen, dass sie vollständig sediert ist. Wenn nicht, erhöhen Sie allmählich die Isofluran-Wartung, um eine Schwellung des Gehirns beim Entfernen des Knochens zu verhindern.</li>
	<li>Fügen Sie dem ausgedünnten Schädel ein kleines Stück Gelschaum hinzu, das in Kochsalzlösung gesättigt ist. Fügen Sie ein oder zwei zusätzliche Tropfen Kochsalzlösung zum ausgedünnten Schädel hinzu. HINWEIS: Viel Kochsalzlösung über dem ausgedünnten Schädel hilft, Blutungen zu reduzieren und die Dura beim Entfernen der Knochenklappe zu schützen.</li>
	<li>Führen Sie die Klinge vorsichtig mit einer 15° spitzen Miniaturklinge in den ausgedünnten Knochen ein und schneiden Sie sie entlang des ausgedünnten Knochens. Halten Sie den Gelschaum in Kochsalzlösung getränkt, um eventuell auftretende Blutungen zu stoppen.</li>
	<li>Heben Sie den Knochen vorsichtig mit einer Pinzette an und entfernen Sie ihn. Seien Sie so sanft wie möglich, um Schäden am darunter liegenden Gewebe und Gefäßsystem zu vermeiden. Achten Sie äußerst darauf, die Dura Mater nicht zu beschädigen.</li>
	<li>Sobald der Knochenlappen entfernt ist, fügen Sie ein frisches Stück Gelschaum, das in Kochsalzlösung gesättigt ist, in den Kortex ein. Fügen Sie ein paar Tropfen Kochsalzlösung hinzu, um zu verhindern, dass der Gelschaum austrocknet, da dies zu Schäden am darunter liegenden Gewebe führt.</li>
</ol>4. Virale Injektionen
<ol><li>Führen Sie virale Injektionen mit einem stereotaktischen Gerät durch.<ol>
<li>Bereiten Sie AAV1 vor. CaMKII.0.4.Cre (Titer von 3 × 1013 Genomkopien (GC)/ml) bei 1:5.000 durch serielle Verdünnungen in Kochsalzlösung.</li>
		<li>Bereiten Sie die Mischung aus AAV1 vor. CaMKII.0.4.Cre (1:5.000) und AAV1. CAG. FLEX.tdTomate (Titer von 5 × 1012 GC/ml) auf einem kleinen Stück Parafilm.</li>
		<li>Füllen Sie eine sterile abgeschrägte Glaspipette mit einer Spitzengröße von 20 μm mit der Virusmischung, indem Sie die Pipette vorsichtig auf die Lösung legen.</li>
		<li>Senken Sie die Pipette ab, so dass sie nur die Oberfläche des Gehirns berührt, und senken Sie sie für weitere 200-300 μm für L2/3-Injektionen. Unter Verwendung eines intrazellulären Mikroinjektions-Dosiersystems (siehe Materialtabelle) wird 12-15 Mal über 2 min (20 psi, 9 ms Pulsdauer) unter Druck injiziert. Beobachten Sie den Meniskus im Pipettentropfen bei jeder Injektion, um sicherzustellen, dass die Pipette nicht verstopft ist.</li>
		<li>Lassen Sie die Pipette nach der Injektion 4-5 Minuten im Gehirn, um einen Rückfluss zu verhindern. Ziehen Sie die Pipette langsam zurück.</li>
		<li>Wiederholen Sie die Injektionen an 2-3 Stellen (ca. 500 μm Abstand).</li>
		<li>Entsorgen Sie die gebrauchten Glaspipetten, Parafilme, Pipettenspitzen und Mikrofugenröhrchen, die für serielle Verdünnungen des Cre-Virus verwendet werden, in 10% Bleichmittel.</li>
	</ol>
</li>
</ol>5. Implantation des Schädelfensters
<ol><li>Entfernen Sie den Gelschaum und verwenden Sie einen kleinen Streifen Schwammstreifen, um die restliche Kochsalzlösung aufzusaugen.</li>
	<li>Geben Sie ein paar Tropfen des Antibiotikums Enrofloxacin (22,7 μg / ml) in die Öffnung und lassen Sie es dort für 1 min bleiben. Verwenden Sie nach 1 Minute ein frisches Stück Schwammstreifen, um das verbleibende Enrofloxacin zu absorbieren. Wiederholen Sie diesen Vorgang noch zwei weitere Male.</li>
	<li>Nach dem dritten Waschen ein paar Tropfen Kochsalzlösung in die Öffnung geben und dort 1 min verbleiben lassen. Verwenden Sie nach 1 min ein frisches Stück Schwammstreifen, um die restliche Kochsalzlösung zu absorbieren. Wiederholen Sie diesen Waschvorgang noch zwei weitere Male und fügen Sie nach der dritten Wäsche einen kleinen Tropfen Kochsalzlösung in die Öffnung ein.</li>
	<li>Legen Sie das Deckglas über die Öffnung. Verwenden Sie eine Pinzette, um sicherzustellen, dass das Glas bündig über die Öffnung ist, um Bilder von guter Qualität zu erhalten.</li>
	<li>Während Sie das Glas vorsichtig an Ort und Stelle halten, tragen Sie Cyanacrylat-Klebegel (Table of Materials) um den Umfang des Glases auf, um die Kanten des Fensters mit dem Schädel zu versiegeln. Achten Sie darauf, den Kleber nicht unter das Deckglas sickern zu lassen, und halten Sie so viel Kleber wie möglich von der Oberfläche des Deckglases fern.</li>
	<li>Tragen Sie eine Schicht Sekundenkleber über das Klebegel auf. Fügen Sie eine Schicht Zahnzementflüssigkeit über den Kleber hinzu, damit er aushärten kann.</li>
	<li>Nehmen Sie eine Hubschrauberkopfplatte in geeigneter Größe und tragen Sie eine dünne Schicht Klebstoff um die zentrale Öffnung auf. Legen Sie die Kopfplatte über das Deckglas und lassen Sie den Kleber kurz trocknen.</li>
	<li>In einem 1,5-ml-Mikrofugenröhrchen fügen Sie der 0,1-ml-Markierung auf der Tube Zahnzementpulver hinzu. Fügen Sie 7-8 Tropfen schnell aushärtender, sofortiger Klebstoff hinzu und mischen Sie. Ziehen Sie in eine 1-ml-Spritze mit einer 19-G-Nadel, die geschnitten wurde, um eine größere Öffnung zu schaffen.</li>
	<li>Injizieren Sie die Mischung durch die seitlichen Löcher der Hubschrauberstange, bis sie von beiden Seiten versickert. Tragen Sie die Zahnzement-Klebstoff-Mischung auf den Rest des freiliegenden Schädels auf, um die Kopfplatte am Schädel zu befestigen, wodurch Bewegungsartefakte während der Bildgebung reduziert werden.</li>
	<li>Lassen Sie die Mischung mindestens 15 Minuten an der Luft trocknen.</li>
	<li>Injizieren Sie der Maus subkutan 0,5 ml Kochsalzlösung, um die Genesung zu unterstützen.</li>
</ol>6. Nach dem Betrieb
<ol><li>Entfernen Sie die Maus aus dem stereotaktischen Frame und bringen Sie sie in ihren Käfig zurück.</li>
	<li>Legen Sie einen Teil des Käfigs auf eine Wasserumlaufdecke, Raumgel-Heizkissen oder Isothermiepads, um die Erholung zu unterstützen.</li>
	<li>Stellen Sie dem Tier zusätzlich zu seiner normalen Ernährung eine kleine Portion Futterpellets und Nassfutter zur Verfügung, um die Genesung weiter zu unterstützen. Fügen Sie jeden Tag nach der Operation für die Dauer der Genesung neue Futterpellets und Nassfutter hinzu.</li>
	<li>Injizieren Sie Mäusen am Tag nach der Operation einmal 5 mg/kg Carprofen und 5 mg/kg Enrofloxacin.</li>
	<li>Injizieren Sie den Mäusen an den Tagen 2-6 einmal 5 mg/kg Carprofen und zweimal 5 mg/kg Enrofloxacin, vorbehaltlich der Zulassung durch die lokale IACUC. Trennen Sie die Enrofloxacin-Injektionen um mindestens 8 h.</li>
	<li>Injizieren Sie den Mäusen an den Tagen 7-20 täglich 5 mg/kg Carprofen.</li>
</ol>7. Tiergewöhnung für die Bildgebung
<ol><li>Untersuchen Sie am 14. Tag nach der Operation das Schädelfenster auf optische Klarheit. Verwenden Sie keine Mäuse mit unklaren oder anderweitig beschädigten Fenstern (z. B. übermäßige Angiogenese).</li>
	<li>Überprüfen Sie die tdTomato-Expression unter einem Fluoreszenzmikroskop. Wenn markierte Zellen identifiziert werden können, fahren Sie mit der Tiergewöhnung fort.</li>
	<li>Erster Tag der Gewöhnung (Handhabung)<ol>
<li>Halten Sie die Maus einige Minuten lang gedrückt und bringen Sie sie nach der Handhabung in ihren Käfig zurück. Wiederholen Sie die Handhabung dreimal mit einem Abstand von 15 Minuten zwischen den Sitzungen.</li>
		<li>Gewöhnen Sie sich nach dem dritten Versuch an die Maus, indem Sie das Tier in ein kleines Stück Stoff wickeln.</li>
		<li>Halten Sie die Maus in Stoff gewickelt für ca. 1 min.</li>
		<li>Bringen Sie die Maus nach dem Versuch in ihren Käfig zurück. Wiederholen Sie diesen Vorgang noch zwei weitere Male, so dass zwischen den einzelnen Versuchen ein Intervall von 15 Minuten liegt.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Zweiter Tag der Gewöhnung<ol>
<li>Wiegen und notieren Sie das Gewicht der Maus.</li>
		<li>Wickeln Sie die Maus in ein Tuch und befestigen Sie sie über ihre Kopfplatte am Kopffixationsarm des luftgestützten Heimkäfigs.</li>
		<li>Lassen Sie den Hauskäfig dem Licht ausgesetzt.</li>
		<li>Lassen Sie die Maus 15 Minuten lang im Wohnmobilkäfig gesichert bleiben.</li>
		<li>Entfernen Sie nach der Gewöhnung die Maus aus dem Hauskäfig und schalten Sie den Luftstrom aus.</li>
		<li>Wiegen Sie die Maus und bringen Sie sie in ihren Käfig zurück. Achten Sie darauf, nur Mäuse einzubeziehen, die nicht mehr als 10% ihres Körpergewichts verlieren. Schließen Sie Mäuse, die an einem beliebigen Tag der Gewöhnung mehr als 10% ihres Gewichts verlieren, von bildgebenden Experimenten aus.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Tag drei der Gewöhnung und darüber hinaus<ol>
<li>Wiegen und notieren Sie das Mausgewicht, bevor Sie es am luftgehissten Heimkäfig befestigen.</li>
		<li>Befestigen Sie die Maus am luftgestützten Heimkäfig.</li>
		<li>Decken Sie den Hauskäfig mit etwas ab, das ein dunkles Interieur bietet, z. B. eine Box, und lassen Sie die Maus 30 Minuten lang gesichert bleiben.</li>
		<li>Entdecken Sie nach 30 Minuten den Heimkäfig, entfernen Sie die Maus und schalten Sie den Luftstrom aus.</li>
		<li>Wiegen und notieren Sie das Gewicht der Maus nach der Gewöhnung.</li>
		<li>Wiederholen Sie diesen Vorgang jeden Tag und erhöhen Sie die Dauer, die die Maus am Heimkäfig befestigt ist, um 15 Minuten. Setzen Sie diesen Vorgang fort, bis die Maus für 1,5 Stunden am Heimkäfig befestigt werden kann, da dies die ungefähre Dauer einer Zwei-Photonen-Bildgebungssitzung ist.</li>
		<li>Um die Maus an Geräusche zu gewöhnen, führen Sie einige Gewöhnungssitzungen am Mikroskop durch, um die Maus an die Geräusche der Laserscanning-Spiegel zu gewöhnen. Schließen Sie Mäuse aus, die sich nicht ausreichend gewöhnen (z. B. Vokalisationen und stressinduzierte Defäkation).</li>
	</ol>
</li>
</ol>8. Multiphotonen-Bildgebung
<ol><li>Beginnen Sie 3 Wochen nach der Operation mit der Bildgebung, damit sich das Fenster öffnen kann.</li>
	<li>Führen Sie die Bildgebung auf einem maßgeschneiderten oder handelsüblichen Multiphotonenmikroskop durch, das mit einem Ti:Saphir-Laser ausgestattet ist. Erfassen Sie Bilder mit einem Wassertauchobjektiv mit hoher numerischer Apertur (NA). HINWEIS: Die Zweikanal-Bildgebung wird durch die Verwendung eines dichroitischen 565-nm-Spiegels und zweier externer Photomultiplierröhren erreicht. Ein 535/50-Bandpassfilter wird verwendet, um GCaMP6f-Emissionen zu erkennen, und ein 610/75-Bandpassfilter wird verwendet, um tdTomato zu erkennen. Ein 25-faches Wassertauchobjektiv (1,05 NA) und Resonanzscanner wurden verwendet, um Bilder in Abbildung 1 und Abbildung 2 zu erfassen. Jede Region von Interesse bestand aus einem Stapel von Bildern, die axial durch 1 μm getrennt waren. Jeder optische Abschnitt wurde mit 512 x 512 Pixeln, 0,18 μm/Pixel gesammelt. Bilder wurden aus dem Vordergliedmaßenbereich des primären motorischen Kortex aufgenommen, der durch stereotaktische Koordinaten bestimmt wurde.</li>
	<li>Stellen Sie die Wellenlänge des Lasers auf 920 nm ein (990 nm, wenn ein rotverschobener GECI verwendet wird).</li>
	<li>Legen Sie die Maus auf den Käfig des Wohnmobils und klemmen Sie die Kopfplatte an den Kopfbefestigungsarm.</li>
	<li>Fügen Sie ein paar Tropfen Wasser in die Mitte des Fensters hinzu.</li>
	<li>Wählen Sie im Weitfeldmodus des Mikroskops 2-3 Positionen eines leicht identifizierbaren Gefäßsystems aus. Speichern Sie die Bilder dieser Blutgefäße und zeichnen Sie die X- und Y-Koordinaten auf, die auf dem Motorcontroller erscheinen, um die tdTomato-markierten Dendriten für nachfolgende Bildgebungssitzungen zu verschieben. Passen Sie die X- und Y-Koordinaten jedes Mal an, um sie mit den gespeicherten Bildern der Blutgefäße neu auszurichten.</li>
	<li>Sobald das Gefäßsystem abgebildet und die Positionen aufgezeichnet wurden, lokalisieren Sie die Regionen mit Neuronen, die tdTomato exprimieren (Abbildung 1). Stellen Sie die synaptischen Strukturen (Dendriten und Axone) von Neuronen und die GCaMP6f-Aktivität in Astrozyten dar. HINWEIS: Die Dendriten dienen als Landmarken, um zuverlässig in die gleichen Regionen zurückzukehren und die gleichen Dendriten und Astrozyten über wiederholte Tage abzubilden. Bei stabiler Kopffixierung und nach Gewöhnung an die Kopffixierung wurde keine nachweisbare Verschiebung in der Bildgebungsebene beobachtet. Verschiebungen, die in X- und Y-Richtung auftreten, werden bewegungskorrigiert.</li>
	<li>Bringen Sie die Maus nach der Bildgebung in ihren Käfig zurück. HINWEIS: Mäuse werden in der Regel maximal 2 Stunden auf dem Zielfernrohr gehalten. Wenn die Bildgebung lange anhält, kann das Wasser unter dem Objektiv trocknen. Während der Experimente sollte Wasser hinzugefügt werden. Alternativ kann anstelle von Wasser ein Ultraschallgel verwendet werden.</li>
</ol>

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<li>Paukert, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Norepinephrine+controls+astroglial+responsiveness+to+local+circuit+activity%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Norepinephrine controls astroglial responsiveness to local circuit activity.</a> Neuron. 82 (6), 1263-1270 (2014).</li>
<li>Delekate, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Metabotropic+P2Y1+receptor+signalling+mediates+astrocytic+hyperactivity+in+vivo+in+an+Alzheimer%27s+disease+mouse+model%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Metabotropic P2Y1 receptor signalling mediates astrocytic hyperactivity in vivo in an Alzheimer's disease mouse model.</a> Nature Communications. 5, 5422(2014).</li>
</ol>

Hier haben wir ein Protokoll für die Implantation chronischer Schädelfenster für die In-vivo-Bildgebung von kortikalen Astrozyten und Neuronen in wachen, kopfgefesselten Mäusen auf einem luftgestützten Hauskäfig vorgestellt. Konkrete Beispiele für die kraniale Fensteranwendung zur Abbildung von Astrozyten, die GECIs und neuronale synaptische Strukturen exprimieren, wurden bereitgestellt. Mit Hilfe der Multiphotonenmikroskopie können astrozytäre Calciumsignaldynamiken und strukturelle synaptische Dynamiken wieder...

Die Fähigkeit, in vivo Multiphotonen-Fluoreszenzmikroskopie im Kortex von Mäusen durchzuführen, ist von größter Bedeutung für die Untersuchung der zellulären Signalgebung und Struktur 1,2,3,4,5,6,7,8,9, der Krankheitspathologie 10,11 und der zellulären Entwicklung 12,13 . Mit der Implantation chronischer Schädelfenster ist eine Längsschnittbildgebung möglich, die eine wiederholte Bildgebung von kortikalen Arealen für Tage, Wochen oder Monate13,14 bei lebenden Tieren ermöglicht. Die Multiphotonenmikroskopie ist ideal für die wiederholte In-vivo-Bildgebung aufgrund der verbesserten Tiefensondierung und der reduzierten Lichtschäden im Zusammenhang mit dem verwendeten Infrarotlaser. Dies ermöglicht die Untersuchung der molekularen und zellulären Dynamik bestimmter Zellen in verschiedenen kortikalen Regionen.
Die Multiphotonenmikroskopie wurde für die In-vivo-Bildgebung von neuronalen und Gliazellen in Mäusen 15,16,17,18,19,20 verwendet. Verschiedene Strategien können implementiert werden, um bestimmte Zelltypen und Interessengebiete zu kennzeichnen. Ein gängiger Ansatz besteht darin, die Expression genetisch kodierter fluoreszierender Proteine auf zellspezifische Weise mit dem Cre-Lox-Rekombinationssystem voranzutreiben. Dies kann mit gentechnisch veränderten Mäusen durchgeführt werden, z. B. durch Kreuzung der "floxierten" Maus (Ai14) mit einer Maus, die die Cre-Rekombinase unter einem Promotor von Interesseexprimiert 21. Alternativ kann eine zell- und standortspezifische Markierung mit viralen Injektionen erreicht werden. Hier werden ein Virus, das für die Cre-Rekombinase unter einem zellspezifischen Promotor kodiert, und ein Virus, das für ein floxiertes Gen von Interesse kodiert, in eine definierte Region injiziert. Geeignete Zelltypen, die beide viralen Vektoren erhalten, exprimieren dann die gewünschten Gene. Diese Gene können strukturelle Marker wie tdTomato sein, um Veränderungen in der Zellmorphologie 22 zu sehen, oder genetisch kodierte Kalziumindikatoren (GECIs), wie GCaMP und / oderRCaMP, um die Kalziumdynamik23 zu untersuchen. Methoden der genetischen Rekombination können einzeln oder in Kombination angewendet werden, um einen oder mehrere Zelltypen zu markieren. Ein dritter Ansatz, der keine transgenen Mäuse oder viralen Konstrukte (die eine begrenzte Verpackungskapazität haben) erfordert, ist die In-utero-Elektroporation von DNA-Konstrukten24. Abhängig vom Zeitpunkt der Elektroporation können verschiedene Zelltypen anvisiert werden25,26,27.
Bei der Durchführung von Multiphotonen-Bildgebung können Mäuse im Wachzustand oder in Narkose abgebildet werden. Die Bildgebung von wachen Mäusen kann durchgeführt werden, indem die Maus über eine angebrachte Kopfplatte28 gesichert wird. Dieser Ansatz wird weniger stressig, indem eine relativ freie Bewegung des Tieres mit Methoden wie freischwebenden, luftgestützten Styroporkugeln29, frei schwebenden Laufbändern1 oder einem luftgestützten Heimkäfigsystem ermöglicht wird, bei dem Mäuse durch eine angebrachte Kopfplatte befestigt werden und sich in einer offenen Kammer30 bewegen dürfen. Für jede dieser Bildgebungsbedingungen ist es zunächst notwendig, die Mäuse an den Bildgebungsaufbau zu gewöhnen. Dieses Papier beschreibt das Gewöhnungs- und Bildgebungsverfahren unter Verwendung eines luftgestützten Heimkäfigsystems.
Dieses Protokoll beschreibt die Implantation eines chronischen Schädelfensters für die longitudinale In-vivo-Bildgebung im Kortex. Hier werden wir Mäuse verwenden, die GCaMP6f in Astrozyten bedingt exprimieren, um die Dynamik der Kalziumsignalisierung zu überwachen. Darüber hinaus beschreibt dieses Papier das Verfahren für virale Injektionen mit tdTomato als Label für Neuronen. Dies ermöglicht die Bestimmung von Veränderungen der neuronalen synaptischen Struktur und/oder der Verfügbarkeit als Strukturmarker, der eine wiederholte Bildgebung desselben Astrozyten ermöglicht. Während des gesamten Protokolls werden entscheidende Schritte hervorgehoben, um die bestmögliche Qualität der Bilder aus der Multiphotonenmikroskopie zu gewährleisten.

<table><tbody><tr><td>15o Spitzklinge</td><td>Surgistar</td><td>6500</td><td>Chirurgie-Werkzeuge</td></tr><tr><td>19 g Nadeln</td><td>BD</td><td>305186</td><td>Chirurgie Versorgung</td></tr><tr><td>AAV1-CAG-FLEX-tdTomato</td><td>Addgene</td><td>28306-AAV1</td><td>Viraler Vektor</td></tr><tr><td>AAV1-CaMKII-0-4-Cre</td><td>Addgene</td><td>105558-AAV1</td><td>Viraler Vektor</td></tr><tr><td>Acteon</td><td>Fisher Scientific</td><td>A16P4</td><td>Reagenz</td></tr><tr><td>Alkohol Vorbereitung</td><td>Pads Fisher Scientific</td><td>Covidien 5750</td><td>Chirurgie Versorgung</td></tr><tr><td>Beveler</td><td>Narishige</td><td></td><td>Ausrüstung</td></tr><tr><td>Borosilikatglas</td><td>Welt Präzisionsinstrumente</td><td>TW100F-4</td><td>Chirurgie Versorgung</td></tr><tr><td>Hartmetallbohrer</td><td>SS Weiß Dental</td><td>14717</td><td>Chirurgie Werkzeuge</td></tr><tr><td>Carprofen (Rimadyl), 50 mg/mL</td><td>Zoetis Mylan Institutional, LLC.Drug</td><td></td><td></td></tr> <tr><td>Compressed Air</td><td>Fisher Scientific</td><td>23-022-523</td><td>Chirurgie Zubehör</td></tr><tr><td>Wattestäbchen Applikatoren</td><td>Puritan</td><td>836-WC NO BINDER</td><td>Chirurgie</td></tr><tr><td>Versorgung Deckglas, Nr. 1 Dicke, 3 mm/5 mm</td><td>Warner Instruments</td><td>64-0720, 64-0700</td><td>Chirurgie Zubehör</td></tr><tr><td>Zahnbohrer</td><td>Aseptico</td><td></td><td>Ausrüstung</td></tr><tr><td>Dexamethason, 4 mg/mL</td><td>Mylan Institutional, LLC.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Mikroskop zum Präparieren</td> von Medikamenten <td>Nikon</td><td></td><td>Equipment</td></tr><tr><td>Duralay Liquid&nbsp; (Zahnzement flüssig)</td><td>Patterson Dental</td><td>602-8518</td><td>Reagenz</td></tr><tr><td>Duralay Pulver&nbsp; (Zahnzementpulver)</td><td>Patterson Dental</td><td>602-7932</td><td>Reagenz</td></tr><tr><td>Enrofloxacin, 2,27%</td><td>Bayer</td><td></td><td>Drug</td></tr><tr><td>Augensalbe</td><td>Dechra</td><td>17033-211-38</td><td>Chirurgie Versorgung</td></tr><tr><td>Fiber Lite High Intensity Illuminator</td><td>Dolan-Jenner Industries</td><td></td><td>Ausrüstung</td></tr><tr><td>Pinzette (groß)</td><td>World Precision Instruments</td><td>14099</td><td>Chirurgie Werkzeuge</td></tr><tr><td>Pinzette ( Small)</td><td>World Precision Instruments</td><td>501764</td><td>Surgery Tools</td></tr><tr><td>GCaMP6f B6; 129S-GT(ROSA)26Sortm95.1(CAGGCaMP6f)Hze/J</td><td>The Jackson Laboratory</td><td>Lagernummer: 024105</td><td>Mauslinie</td></tr><tr><td>Germinator</td><td>Fisher Scientific</td><td></td><td>Equipment</td></tr><tr><td>GLAST-CreER Tg (Slc1a3-cre/ERT) 1Nat/J</td><td>Das Jackson Laboratory</td><td>Lagerbestandsnummer: 012586</td><td>Mauslinie</td></tr><tr><td>Kopfplatte</td><td>Neurotar</td><td>Modell 1, Modell 3</td><td>Chirurgie Zubehör</td></tr><tr><td>Hämostatische Pinzette</td><td>World Precision Instruments</td><td>501705</td><td>Chirurgie</td></tr> Werkzeuge <tr><td>Halter für 15o Spitze Klinge</td><td>World Precision Instruments</td><td>501247</td><td></td></tr><tr><td>Chirurgie Werkzeughalter für Skalpellklingen</td><td>World Precision Instruments</td><td>500236</td><td>Chirurgie Werkzeuge</td></tr><tr><td>Jodvorbereitungspads</td><td>Avantor</td><td>15648-926</td><td>Chirurgie Versorgung</td></tr><tr><td>Isofluran</td><td>Piramal</td><td></td><td>Chirurgie Versorgung</td></tr><tr><td>Isofluran Tischsystem mit Induktionsbox</td><td>Harvard Geräteausrüstung</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Isofluran Vaporizer</td><td>SurgiVet</td><td></td><td>Ausrüstung</td></tr><tr><td>Krazy Glue</td><td>Office Depot</td><td>KG517</td><td>Reagenz</td></tr><tr><td>Loctite 401</td><td>Henkel</td><td>40140</td><td>schnellhärtender Sofortklebstoff</td></tr><tr><td>Loctite 454</td><td>Fisher</td><td>Scientific NC9194415</td><td>Cyanacrylat-Haftgel</td></tr><tr><td>Mikropipette Abzieher</td><td>Sutter Instruments</td><td></td><td>Ausrüstung</td></tr><tr><td>für Multiphotonenmikroskope</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Ausrüstung Stickstoff</td><td>Matheson</td><td>NI M200</td><td>Gas</td></tr><tr><td>Sauerstoff</td><td>Matheson</td><td>OX M250</td><td>Gas</td></tr><tr><td>Picospritzer</td><td>Parker</td><td></td><td>Intrazelluläres Mikroinjektions-Dosiersystem</td></tr><tr><td>Pipettenspitzen</td><td>Rainin</td><td>17014340</td><td>Chirurgie Versorgung</td></tr><tr><td>Nagetier Haarschneider</td><td>Wahl</td><td></td><td>Ausrüstung</td></tr><tr><td>Kochsalzlösung (0,9 % Natriumchlorid)</td><td>Med Vet International</td><td>RX0,9NACL-30BAC</td><td>Chirurgie Versorgung</td></tr><tr><td>Skalpellklingen, Größe 11</td><td>Integra</td><td>4-111</td><td>Chirurgie Werkzeuge</td></tr><tr><td>Schere</td><td>World Precision Instruments</td><td>503667</td><td>Chirurgie Werkzeuge</td></tr><tr><td>Stereotaktische Instrumente</td><td>Stoelting</td><td></td><td>Equipment</td></tr><tr><td>Sugi Schwamm Strips (Schwammstreifen)</td><td>Kettenbach Dental</td><td>31002</td><td>Chirurgie</td></tr><tr><td>Zubehör SURGIFOAM (Gelschaum)</td><td>Ethicon</td><td>1972</td><td>Chirurgie Zubehör</td></tr><tr><td>Spritze mit 26 g Nadel</td><td>BD</td><td>309625</td><td>Chirurgie Versorgung</td></tr><tr><td>Tamoxifen</td><td>Sigma Aldrich</td><td>T5648-1G</td><td>Reagenz</td></tr><tr><td>Ti:Saphir Laser</td><td>Kohärente</td><td></td><td>Ausrüstung</td></tr><tr><td>Transfer Pipetten</td><td>Fisher Scientific</td><td>13-711-9AM</td><td>Chirurgie Versorgung</td></tr><tr><td>Wasserdecke</td><td>Fisher Scientific</td><td></td><td>Ausrüstung</td></tr><tr><td>Xylocain MPF mit Adrenalin (1:200.000), 10 mg/ mL</td><td>Fresenius Kabi USA</td><td></td><td>Medikament</td></tr></tbody></table>

implantation eines kranialen fensters für wiederholte in-vivo-bildgebung bei wachen mäusen

Implantation of a Cranial Window for Repeated In Vivo Imaging in Awake Mice

Um die zelluläre Physiologie von Neuronen und Gliazellen bei sich benehmenden Tieren vollständig zu verstehen, ist es notwendig, ihre Morphologie zu visualisieren und ihre Aktivität in vivo bei sich verhaltenden Mäusen aufzuzeichnen. Dieses Papier beschreibt eine Methode zur Implantation eines chronischen Schädelfensters, um die Längsbildgebung von Gehirnzellen in wachen, kopfgefesselten Mäusen zu ermöglichen. In Kombination mit genetischen Strategien und viralen Injektionen ist es möglich, bestimmte Zellen und Regionen von Interesse mit strukturellen oder physiologischen Markern zu markieren. Dieses Protokoll zeigt, wie virale Injektionen kombiniert werden können, um Neuronen in der Nähe von GCaMP6-exprimierenden Astrozyten im Kortex zu markieren, um beide Zellen gleichzeitig durch ein Schädelfenster abzubilden. Multiphotonen-Bildgebung der gleichen Zellen kann für Tage, Wochen oder Monate in wachen, sich verhaltenden Tieren durchgeführt werden. Dieser Ansatz bietet Forschern eine Methode zur Betrachtung der Zelldynamik in Echtzeit und kann angewendet werden, um eine Reihe von Fragen in den Neurowissenschaften zu beantworten.

Die Qualität des Schädelfensters kann daran gemessen werden, wie scharf die neuronalen Strukturen erscheinen. In einem guten Fenster sind dendritische Stacheln deutlich sichtbar (Abbildung 1). Mit den gespeicherten Struktur- und Positionsdaten kann dasselbe Tier wiederholt Tage, Wochen oder Monate lang abgebildet werden, um dieselben Zellen zu untersuchen (Abbildung 1). Die Bilder in Abbildung 1 wurden aus dem Vordergliedmaßenbereic...

Hier wird ein Protokoll zur Implantation eines chronischen Schädelfensters für die Längsbildgebung von Gehirnzellen in wachen, kopfgefesselten Mäusen vorgestellt.

Implantation eines kranialen Fensters für wiederholte In-vivo-Bildgebung bei wachen Mäusen

To fully understand the cellular physiology of neurons and glia in behaving animals, it is necessary to visualize their morphology and record their ...

Das Protokoll beschreibt, wie virale Injektionen durchgeführt und ein Schädelfenster für die Bildgebung von Gehirnzellen in wachen, kopfgefesselten Mäusen implantiert werden können. Der Vorteil dieser Methode besteht darin, dass Struktur und Aktivität von Neuronen und Astrozyten wiederholt über mehrere Sitzungen abgebildet werden können. Mit diesem Ansatz kann bestimmt werden, wie neuronale Zellen in Modellen neurologischer Entwicklungsstörungen oder neurodegenerativer Erkrankungen verändert sind oder ob die erfahrungsabhängige Plastizität beeinträchtigt ist.Beginnen Sie mit der Befestigung einer betäubten Maus an einem stereotaktischen Rahmen mit der Schnauzenklemme und den Ohrstangen. Schneiden und entfernen Sie die Haut mit sterilen chirurgischen Werkzeugen von den frontalen Nähten vor dem Bregma bis nach hinten zum Lambda. Kratzen Sie mit einer sterilen chirurgischen Klinge aus Kohlenstoffstahl der Größe 11 vorsichtig das gesamte Bindegewebe vom Schädel.Bohren Sie mit Hilfe eines Zahnbohrers den Schädelknochen allmählich entlang des Umrisses der Öffnung in konzentrischen Kreisen, um eine gleichmäßige Ausdünnung des Knochens zu erleichtern. Fügen Sie nach jedem konzentrischen Durchgang einen oder zwei Tropfen Kochsalzlösung in den gebohrten Bereich ein und lassen Sie die Kochsalzlösung mindestens 10 Sekunden ruhen, bevor Sie das Bohren fortsetzen. Drücken Sie vorsichtig auf den zentralen Bereich des Schädelknochens mit einer feinen Pinzette, um zu überprüfen, ob der Schädel ausreichend ausgedünnt ist und sich bewegt.Stellen Sie sicher, dass das darunter liegende Gefäßsystem, in dem die Bohrung stattgefunden hat, intakt ist und dass der Knochen nicht gerissen ist. Führen Sie vorsichtig eine 15-Grad-Miniatur-Spitzklinge in den ausgedünnten Knochen ein und schneiden und verwenden Sie den in Kochsalzlösung getränkten Gelschaum, um eventuell auftretende Blutungen zu stoppen. Verwenden Sie eine Pinzette, heben und entfernen Sie den Knochen vorsichtig und achten Sie darauf, die Dura Mater nicht zu beschädigen.Für die Injektion eine sterile abgeschrägte Glaspipette mit einer 20-Mikrometer-Spitze mit der Virusmischung füllen. Senken Sie dann die Pipette ab, um die Oberfläche des Gehirns zu berühren, und senken Sie sie für weitere 200 bis 300 Mikrometer für Schicht-2/3-Injektionen weiter. Mit einem intrazellulären Mikroinjektions-Dosiersystem injizieren Sie das System 12 bis 15 Mal über zwei Minuten.Für die Schädelfensterimplantation das Deckglas über die Öffnung im Schädel legen. Verwenden Sie eine Pinzette, um sicherzustellen, dass das Glas bündig über die Öffnung ist. Um die Kanten des Glasfensters mit dem Schädel zu versiegeln, tragen Sie Cyanacrylat-Klebegel um den Umfang der Glasoberfläche auf.Über das Klebegel eine Schicht Klebstoff auftragen. Dann fügen Sie eine Schicht Zahnzementflüssigkeit hinzu. Wenn Zahnzement aushärtet, tragen Sie eine dünne Schicht Klebstoff um die zentrale Öffnung der Hubschrauberkopfplatte auf und legen Sie die Hubschrauberkopfplatte der entsprechenden Größe über das Deckglas.Lassen Sie den Kleber trocknen. Fügen Sie Zahnzementpulver in einem 1,5-Milliliter-Mikrofugenröhrchen bis zur 0,1-Milliliter-Marke hinzu. Mischen Sie sieben bis acht Tropfen schnell aushärtenden Sofortkleber in das Pulver und ziehen Sie die resultierende Mischung in eine Ein-Milliliter-Spritze mit einer 19-Gauge-Nadel, die geschnitten wurde, um eine größere Öffnung zu schaffen.Injizieren Sie die Pulvermischung durch die seitlichen Löcher der Hubschrauberstange, bis sie von beiden Seiten versickert. Tragen Sie die Zahnzement-Klebstoffmischung auf den Rest des freiliegenden Schädels auf, um die Kopfplatte am Schädel zu befestigen. Wickeln Sie die Maus in Stoff und befestigen Sie sie über ihre Kopfplatte am Kopfbefestigungsarm des in die Luft gehobenen Heimkäfigs, dann lassen Sie den Hauskäfig dem Licht ausgesetzt.Nach einer Eingewöhnungszeit von 15 Minuten die Maus aus dem Hauskäfig entfernen. Wählen Sie im Weitfeldmodus des Mikroskops zwei bis drei Positionen des leicht identifizierbaren Gefäßsystems aus. Speichern Sie die Bilder der Blutgefäße und zeichnen Sie die x- und y-Koordinaten auf, die auf dem Motorcontroller erscheinen.Stellen Sie sich die synaptischen Strukturen von Neuronen und die GCaMP6f-Aktivität in Astrozyten vor. In der repräsentativen Analyse wurde die Qualität des Schädelfensters mit wiederholter Bildgebung von Dendriten und GCaMP6f-exprimierenden Astrozyten über Tage bewertet. In einem guten Fenster erschienen die neuronalen Strukturen knackig mit deutlich sichtbaren dendritischen Stacheln.Zwei neue Stacheln erschienen am zweiten Tag der Bildgebung. Nur eine Wirbelsäule blieb bestehen und war am fünften Tag sichtbar. Die Kalziumaktivität wurde in Astrozyten untersucht, die GCaMP6f zu verschiedenen Zeitpunkten exprimierten.Ein globales Ereignis, das die gesamte Zelle umfasste, wurde während eines Fortbewegungskampfes beobachtet. Die beiden kritischen Schritte dieses Protokolls sind, dass der Knochen vor der Entfernung des Knochens ausreichend ausgedünnt werden muss, und die richtige Platzierung des Deckglases über der Öffnung. Die Bildgebung kann mit einer Verhaltensanalyse kombiniert werden, entweder während der Bildgebung oder nach dem Verhalten, z. B. dem Erlernen einer neuen motorischen Fähigkeit, um zu bestimmen, wie die Struktur und Funktion von neuronalen und Astrozyten durch Lernen moduliert wird.

implantation-cranial-window-for-repeated-vivo-imaging-awake

Research

Forschung

JoVE Journal

Neuroscience

Neurowissenschaften

Durch die Kombination aus poliertem und verstärkte Dünnschicht-Schädel (Ports) cranial Fenster und Glioblastom (GBM) Zellinjektion können wir beobachten, Gliom Initiierung und Wachstum aus injiziert GBM Zellen in das Gehirn eines lebenden Maus Längsrichtung.

Imaging Gliom Initiation<em&gt; In Vivo</em&gt; Durch eine Poliert und Reinforced Thin-skull Cranial Fenster

Dieses Video zeigt ein chirurgisches Verfahren zur Implantation eines Schädelfensters in einem Mausmodell, um einen stabilen optischen Zugang zu verschiedenen Regionen des Gehirns zu ermöglichen.

Implantation eines kranialen Bildgebungsfensters im Mausmodell: Ein chirurgisches Verfahren zur Implantation eines glasbasierten Deckglases für einen stabilen optischen Zugang zu Regionen des Mausgehirns

Dieses Video zeigt die Aufzeichnung der neuronalen Aktivität des Gehirns durch ein optisches Fenster in transgenen Mäusen. Die Mäuse exprimieren ein fluoreszierendes Protein, das den Nachweis neuronaler Aktivitäten ermöglicht. Ein kleiner Teil des Schädels wird vorsichtig entfernt, um ein optisches Fenster zu installieren, und der Schädel wird dann mit schwarzem Zement bedeckt, um das Licht vor der Bildgebung zu blockieren.

Installation von optischen Fenstern im Gehirn transgener Mäuse zur Abbildung neuronaler Aktivitäten

Quelle: Pietruczyk, E. A., et al. Laminektomie und Implantation eines Rückenmarksfensters bei der Maus. J. Vis. Exp. (2019)Dieses Video zeigt die Implantation eines Rückenmarksfensters in eine anästhesierte Maus für die in vivo Bildgebung. Das Protokoll stabilisiert das freiliegende Rückenmark mit einem Borosilikat-Deckglas und einer 3D-gedruckten Rückplatte. Diese Methode ermöglicht die hochauflösende Zwei-Photonen-Mikroskopie, um die Dynamik der Blut-Hirn-Schranke und neurovaskuläre...

Implantation eines Rückenmarksfensters in einer Maus für die In-vivo-Bildgebung

Dieses Protokoll beschreibt eine chronische Cranial Window Implantationstechnik, die für die Längsbildgebung von neurogliovaskulären Strukturen, Wechselwirkungen und Funktion unter gesunden und kranken Bedingungen verwendet werden kann. Es dient als ergänzende Alternative zum transkraniellen Bildgebungsansatz, der zwar oft bevorzugt wird, aber einige kritische Einschränkungen besitzt.

Präzise Gehirnkartierung zur Durchführung von Repetitiven In-Vivo-Bildgebungen der Neuro-Immun-Dynamik bei Mäusen

Dieses Protokoll beschreibt ein neuartiges Brustbildfenster mit einem austauschbaren Deckel (R.MIW). Die intravitale Mikroskopie nach Implantation des R.MIW ermöglicht eine Längs- und Mehrtagesbildgebung der gesunden und erkrankten Brustdrüse mit zellulärer Auflösung während der verschiedenen Entwicklungsstadien.

Längsschnittliche intravitale Mikroskopie unter Verwendung eines Brustbildgebungsfensters mit austauschbarem Deckel

In dieser Arbeit beschreiben wir ein Protokoll, das die Adeno-assoziierte Virusinjektion mit der Implantation eines Schädelfensters kombiniert, um die Dynamik der Mikroglia und die neuronale Aktivität in wachen Mäusen simultan abzubilden.

Simultane Bildgebung von Mikrogliadynamik und neuronaler Aktivität in wachen Mäusen

Das vorliegende Protokoll beschreibt die Herstellung eines großen (6 x 3 mm2) Schädelfensters mit Lebensmittelverpackung, transparentem Silikon und Deckglas. Dieses Schädelfenster ermöglicht in vivo Weitfeld- und Zwei-Photonen-Kalzium-Bildgebungsexperimente in derselben Maus.

Im lebenden Organismus Weitfeld- und Zwei-Photonen-Kalzium-Bildgebung einer Maus mit einem großen Schädelfenster

Diese Studie zeigt die Verabreichung eines wiederholten Schädel-Hirn-Traumas an Mäuse und die gleichzeitige Implantation eines kranialen Fensters für die anschließende intravitale Bildgebung eines neuronenexprimierten EGFP mittels Zwei-Photonen-Mikroskopie.

Intravitale Bildgebung der fluoreszierenden Proteinexpression bei Mäusen mit Schädel-Hirn-Trauma und Schädelfenster mit einem Zwei-Photonen-Mikroskop

Dieses Protokoll enthält eine ausführliche Beschreibung eines Schritt-für-Schritt-Ansatzes für ein chronisches Schädelfenster- und mikrovaskuläres Embolismus-Mausmodell, das für die in vivo Zweiphotonenmikroskopie mit fluoreszierenden Polystyrol-Mikrosphären optimiert ist.

Mikrovaskuläres Embolismus-Mausmodell für die In-vivo-Zweiphotonenmikroskopie mit fluoreszierenden Polystyrol-Mikrosphären

Dieses Protokoll beschreibt eine zweiphasige chirurgische Methode, um bei Mäusen ein großes, wiederverschließbares, dura-schonendes Schädelfenster zu schaffen. Diese Technik ermöglicht chronische, multimodale elektrophysiologische Aufzeichnungen aus verteilten, tief-gehirnbasierten Netzwerken wie dem Default Mode Network über mehrere Wochen.

Chirurgisches Protokoll für ein großes, wiederverschließbares Schädelfenster, das longitudinale, multimodale elektrophysiologische Aufzeichnungen des Maus-Default-Mode-Netzwerks ermöglicht

Lernen Sie die Implantation eines kranialen Fensters für wiederholte In-vivo-Bildgebung bei wachen, kopffixierten Mäusen. Diese Methode ermöglicht die langzeitliche Untersuchung neuronaler und astrozytärer Dynamiken.

Implantation eines kranialen Fensters für wiederholte In-vivo-Bildgebung bei wachen Mäusen

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