Name: 5-Ethynyl-2-Desoxyuridin/Phospho-Histon H3 Dual-Labeling Protocol for Cell Cycle Progression Analysis in Drosophila Neural Stem Cells (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-05-04T15:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 34 s
Description: Lernen Sie die Analyse des Zellzyklus in Drosophila-Neuralstammzellen mit EdU/pH3-Doppelfärbung. Dieses Protokoll ermöglicht die Unterscheidung von G1-, S- und M-Phasen und hilft bei der Untersuchung genetischer Mutationen.

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Diese Arbeit wurde durch Mittel des Schweizerischen Nationalfonds (Projektstipendium 31003A_173188; www.snf.ch) und der Universität Bern (www.unibe.ch) an die BS unterstützt. Die Geldgeber spielten keine Rolle beim Studiendesign, der Datenerhebung und -analyse, der Entscheidung zur Veröffentlichung oder der Vorbereitung des Manuskripts.

1. Vorbereitung von Reagenzien und Beständen für den Click-it EdU Assay
HINWEIS: Weitere Informationen zum Kit und zu den mit dem Kit gelieferten Reagenzien finden Sie in der Materialtabelle und in Tabelle 1.
<ol><li>Bringen Sie die Durchstechflaschen auf Raumtemperatur, bevor Sie die Lösungen vorbereiten.</li>
	<li>10 mM EdU (Komponente A) Stammlösung unter Zugabe von 2 ml Dimethylsulfoxid (DMSO, Komponente C) herstellen. Gut mischen und bei -20 °C lagern.</li>
	<li>Bereiten Sie eine funktionierende Lösung von Alexa Fluor 647-Azid (Komponente B) vor, indem Sie 70 μL DMSO (Komponente C) hinzufügen. Gut mischen und bei -20 °C lagern.</li>
	<li>Bereiten Sie eine 1x-Lösung von Click-iT EdU-Reaktionspuffer (Komponente D) vor, indem Sie 4 ml dieser Lösung mit 36 mL entionisiertem Wasser mischen. Die restliche Lösung wird bei 2-6 °C gelagert.</li>
	<li>Machen Sie einen 10-fachen Vorrat (200 mg/ml) des Click-iT EdU-Pufferadditivs (Komponente F) durch Zugabe von 2 mL entionisiertem Wasser. Gut mischen und bei -20 °C lagern.</li>
	<li>Hoechst 33342 (Komponente G) bei 2-6 °C lagern. DMSO (Komponente C) in einem Exsikkator bei -20 °C lagern. HINWEIS: Handschuhe sollten verwendet werden, um DMSO und Hoechst zu handhaben.</li>
</ol>2. Dissektion des dritten Larvengehirns im Stadium und EdU-Einbau
HINWEIS: Das Protokoll für Gehirndissektionen wurde zuvor beschrieben12. Stellen Sie vor Beginn der Dissektion sicher, dass ausreichende Mengen der EdU- und PFA-Lösungen hergestellt und aufgetaut sind, wie in den Abschnitten 2.6 und 3.1 beschrieben.
<ol><li>Man bereitet 10x phosphatgepufferte Kochsalzlösung (PBS) vor, indem man 25,6 g Na2 HPO4.7H20, 80 g NaCl, 2 g KCl und 2 gKH2PO4 zu 1 L entionisiertem Wasser hinzufügt. Stellen Sie den pH-Wert auf 7,4 ein und bereiten Sie anschließend eine 1-fache Lösung in entionisiertem Wasser vor.</li>
	<li>Fügen Sie Schneiders Dissektionsmedium (SM) zu zwei aufeinanderfolgenden Vertiefungen einer Glas(3 oder 9) Depressionsglas-Spotplatte hinzu. Fügen Sie 1x PBS zur nächsten aufeinanderfolgenden Depression hinzu.</li>
	<li>Pflücken Sie mit einer Pinzette wandernde Larven im dritten Stadium und legen Sie sie auf ein mit PBS benetztes Gewebe, um Fliegenfutterrückstände zu entfernen. Platzieren Sie die Larve in der Vertiefung mit PBS und dann in der aufeinanderfolgenden Depression mit SM.</li>
	<li>Entfernen Sie mit einer feinen Pinzette 3/4 des Unterkörpers der Larve.<ol>
<li>Greifen Sie vorsichtig die Larvenmaulhaken mit einer Pinzette und halten Sie die Nagelhaut am anderen Ende mit der anderen Pinzette.</li>
		<li>Drehen Sie den Larvenkopf von innen nach außen, indem Sie die Mundhaken nach innen drücken und gleichzeitig das Gewebe am anderen Ende abziehen.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Beobachten Sie das Larvengehirn mit angeschlossenen imaginären Bandscheiben. Entfernen Sie andere Gewebe, die am Gehirn befestigt sind, und übertragen Sie das Gehirn auf die nächste aufeinanderfolgende Depression mit SM.</li>
	<li>Tauen Sie die 10 mM EdU-Lagerlösung auf. Bereiten Sie eine 100-μM-Lösung vor, indem Sie diese 10 mM-Menge in SM verdünnen.</li>
	<li>100 μL dieser 100 μM EdU+SM Lösung in eine weitere Vertiefung auf der Pyrexplatte geben. Inkubieren Sie ~ 5-10 sezierte Gehirne in 100 μL 100 μM EdU + SM-Lösung für 2 h bei 25 ° C. HINWEIS: Da sich NBs einmal in ~ 2 h teilen, zielt dieses Protokoll darauf ab, einen vollständigen Zellzyklus zu analysieren. Verwenden Sie nur intakte Gehirne für weitere Schritte. Verwerfen Sie Gehirne, die während der Dissektion beschädigt werden.</li>
</ol>3. Fixierung und Immunfärbung
<ol><li>4%ige Paraformaldehyd (PFA)-Lösung in einem Abzug herstellen.<ol>
<li>4 g Paraformaldehydpulver zu 80 ml 1x PBS in einem auf einem Magnetrührer platzierten Becher hinzufügen und auf 60 °C erhitzen. Um PFA aufzulösen, fügen Sie einige Tropfen von 1 N NaOH hinzu. Überprüfen Sie den pH-Wert und stellen Sie bei Bedarf mit einigen Tropfen von 1 M HCl auf 7,0 ein.</li>
		<li>Stellen Sie die Lautstärke mit 1x PBS auf 100 ml ein. Die PFA-Lösung aliquotieren und bei 2-6 °C bis zu 1 Monat lagern. Fügen Sie der PFA-Lösung 0,3% nichtionisches Reinigungsmittel (siehe Materialtabelle)hinzu, um große Gewebe wie das Larvengehirn effizient zu fixieren.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Nach dem Einbau von EdU werden die Gehirne auf 0,6 ml Mikrozentrifugenröhrchen mit 4% PFA übertragen. Bei Raumtemperatur auf einem Nutator 15 min inkubieren. Tippen Sie auf die Röhre auf der Laborbank, so dass sich das Gehirn am Boden der Röhre absetzt.</li>
	<li>Entfernen Sie die PFA und waschen Sie 3 mal mit PBS + 0,3% nichtionisches Reinigungsmittel (PBST) bei Raumtemperatur. Stellen Sie sicher, dass jede Wäsche mindestens 10 Minuten auf einem Nutator dauert. Nach der letzten Wäsche PBST entfernen, Blocklösung (PBST + 5% Rinderserumalbumin) hinzufügen und 30 Minuten bei Raumtemperatur inkubieren.</li>
	<li>Verdünnter Anti-Miranda-Antikörper (1:250) und Anti-pH3-Antikörper (1:200) in PBST (beide Antikörper im selben Röhrchen). Entfernen Sie den blockierenden Puffer und fügen Sie die primäre Antikörperlösung hinzu. Über Nacht bei 2-6 °C auf einem Nutator inkubieren. HINWEIS: Miranda ist ein Membranprotein, das auf CB-NBs vorhanden ist. Es dient dazu, diese großen runden Zellen im CB-Bereich zu identifizieren13.</li>
	<li>Entfernen Sie die primäre Antikörperlösung und waschen Sie sie 3 Mal mit PBST. Stellen Sie sicher, dass jede Wäsche 10 Minuten auf einem Nutator bei Raumtemperatur dauert.</li>
	<li>Bereiten Sie die sekundäre Antikörperlösung vor, indem Sie 1:500 verdünntes Alexa Fluor 488 Anti-Kaninchen und Alexa Fluor 568 Anti-Ratte in PBST hinzufügen. Entfernen Sie das PBST und fügen Sie die sekundäre Antikörperlösung zu den sezierten Gehirnen hinzu. Über Nacht bei 2-6 °C im Dunkeln auf einem Nutator inkubieren und 3 Mal mit PBST waschen (Schritt 3.5).</li>
</ol>4. EdU-Erkennung, DNA-Färbung und Montage
<ol><li>Um den EdU-Detektionscocktail vorzubereiten, mischen Sie die Komponenten (siehe Tabelle 2) in einem 1,5-ml-Röhrchen.</li>
	<li>Entfernen Sie nach der letzten Wäsche (Schritt 3.6) PBST und fügen Sie den EdU-Erkennungscocktail zu den sezierten Gehirnen hinzu. Bei Raumtemperatur im Dunkeln 30 min auf einem Nutator inkubieren. 2 mal mit PBST für jeweils 10 min im Dunkeln waschen.</li>
	<li>Für die DNA-Färbung verdünnen Sie Hoechst 33342 (Komponente G) 1:2.000 in PBST, um eine 5 μg/ml-Lösung herzustellen.</li>
	<li>Entfernen Sie PBST nach der zweiten Wäsche (Schritt 4.2) und geben Sie 500 μL 5 μg/ml Hoechst-Lösung in die sezierten Gehirne. 10 Minuten im Dunkeln inkubieren. Hoechst entfernen und einmalig mit PBST für 10 Minuten waschen.</li>
	<li>Tippen Sie die Röhre auf die Laborbank und lassen Sie die Gehirne sich beruhigen. Entfernen Sie das PBST aus dem Röhrchen, aber lassen Sie nur 50-100 μL zurück.</li>
	<li>Schneiden Sie das Ende einer 200-μL-Mikropipettenspitze ab und übertragen Sie das Gehirn vorsichtig auf einen sauberen Glasobjektträger. Entfernen Sie überschüssiges PBST vom Objektträger, indem Sie es mit Filterpapierstreifen abtupfen. Achten Sie darauf, dass das Filterpapier nicht das Gehirn berührt.</li>
	<li>Geben Sie einen Tropfen wasserlösliches, nicht fluoreszierendes Montagemedium auf das Gehirn und richten Sie das Gehirn so aus, dass der ventrale Nervenstrang dem Objektträger zugewandt ist und die Lappen nach oben zeigen. Ordnen Sie die Gehirne in einer einzigen Datei an, so dass es einfacher ist, die Gehirne seriell abzubilden.</li>
	<li>Legen Sie vorsichtig einen Deckglas auf das Gehirn. Stellen Sie die Rutsche über Nacht bei 2-6 °C auf. HINWEIS: Das Montagemedium härtet bei der Lagerung über Nacht aus, so dass der Deckglas nicht mit Nagellack versiegelt werden muss.</li>
</ol>5. Bildgebung
HINWEIS: Einzelheiten zum Laser-Scanning-Mikroskop und zum Ölimmersionsobjektiv, die in diesem Protokoll verwendet werden, finden Sie in der Materialtabelle.
<ol><li>Wählen Sie in der Akquisitionssoftware das 63-fache Ziel aus.</li>
	<li>Geben Sie einen Tropfen Tauchöl auf den Deckglas direkt über den montierten Gehirnen, um das Gewebe durch das Okular leichter zu lokalisieren.</li>
	<li>Mit dem DAPI/Hoechst 33342-Kanal finden Sie das Gehirn durch das Okular und wechseln dann in den Erfassungsmodus in der Software.</li>
	<li>Richten Sie 4 Kanäle ein, um Hoechst 33342 (DNA), Alexa Fluor 488 (pH3), Alexa Fluor 568 (Miranda) und Alexa Fluor 647 (EdU) abzubilden. Verwenden Sie das Dye-Assistant-Tool, das die Anregungslaser und Emissionsfilter für die ausgewählten Farbstoffe automatisch einrichtet.</li>
	<li>Stellen Sie das Sichtfeld so ein, dass es den gesamten Gehirnlappen umfasst. Stellen Sie sich das gesamte Volumen des Gehirnlappens vor, indem Sie Z-Stacks im Abstand von 0,8 μm erfassen. Speichern Sie alle Bilder aus einer Imaging-Sitzung in einem *.lif-Bibliotheksformat.</li>
</ol>6. Bildanalyse
HINWEIS: Die folgenden Schritte beschreiben die Analyse der aufgenommenen Bilder und die Sortierung der Zellen in G0/G1-Phase, S>G2/M (Progression von S nach G2/M) und M-Phase mit der ImageJ-Software.
<ol><li>Laden Sie Fidschi (Fidschi ist ImageJ) von der folgenden URL herunter: https://fiji.sc/. Öffnen Sie Fidschi, ziehen Sie die LIF-Dateien per Drag & Drop in Fidschi. HINWEIS: Fiji ist eine Version von ImageJ, die mit mehreren Plugins vorinstalliertist 14. Wenn Sie .lif-Dateien nach Fidschi übertragen, wird das Bio-Formats-Plugin geöffnet, das zum Verarbeiten der .lif-Dateien benötigt wird. Das Bioformat-Plugin ist auch erforderlich, um Bilddateien zu öffnen, die von einigen anderen Mikroskopmarken generiert wurden, z. B. nd2-Dateien, die von einem Nikon-Mikroskop generiert wurden. Dieses Plugin ist mit Fidschi vorinstalliert.</li>
	<li>Wählen Sie Datenbrowser auf der Registerkarte Stack-Anzeige und verwenden Sie den virtuellen Stack von der Registerkarte Speicherverwaltung im Bioformat-Plugin. HINWEIS: Lif-Dateien mit Z-Stacks von 8-10 Gehirnen sind oft 300-400 Megabyte groß. Auf Computern mit wenig RAM kann das Öffnen einiger solcher Dateien den verfügbaren RAM auf ImageJ schnell erschöpfen und eine weitere Bildverarbeitung verhindern. Der virtuelle Stack ist "schreibgeschützt", benötigt keinen hohen RAM für die Verarbeitung und ist eine ideale Option, um große Datensätze auf Fidschi zu laden.</li>
	<li>Beobachten Sie das mehrkanalige Bild, das in BildJ angezeigt wird. Ändern Sie die Farbe der Kanäle in der Menüleiste mit dem Bild- | Farb- | Kanälen. Beobachten Sie die Miranda-markierten NBs als große runde Zellen in der CB-Region.</li>
	<li>Zeichnen Sie eine Region of Interest (ROI) mit dem Ellipsenwerkzeug über jede NB, um zu vermeiden, dass die NB zweimal gezählt wird.<ol>
<li>Wählen Sie in der Menüleiste ImageJdie Option |-Tools analysieren | ROI-Manager. Markieren Sie alle NBs im aktuellen Z-Abschnitt, und drücken Sie t, nachdem Sie jede Zelle markiert haben.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Sobald alle NBs im aktuellen Z-Abschnitt markiert sind, ändern Sie die Kanäle in pH3 und EdU und zählen Sie manuell die Anzahl der EdU-positiven NBs, pH3-positiven NBs, NBs, die sowohl für EdU als auch für pH3 positiv färben, und NBs, die für beide Marker nicht färben.</li>
	<li>Suchen Sie in nachfolgenden Z-Abschnitten nach NBs, löschen Sie alte ROIs und fügen Sie neue ROIs hinzu, um NBs in verschiedenen Stacks zu zählen.</li>
	<li>Erstellen Sie eine Tabelle mit den folgenden Spalten: 1. EdU- pH3-: Dieser Abschnitt stellt die doppelt negativen Zellen dar, die sich in der G0/G1-Phase des Zellzyklus befinden; 2. EdU+: Die Zellen dieser Kategorie haben EdU eingebaut und durchlaufen eine DNA-Replikation (S-Phase); 3. EdU+ pH3+: Diese dual-positiven Zellen haben die S-Phase abgeschlossen und sind zur G2- oder M-Phase übergegangen; 4. pH3+: Diese NBs werden einer Mitose unterzogen.</li>
	<li>Berechnen Sie den Prozentsatz der NBs, die in allen der oben genannten 4 Kategorien für jeden Lappen vorhanden sind. Bereiten Sie ein Balkendiagramm mit der Tabellenkalkulationssoftware vor, die die gepoolten Daten für Prozentsätze von NBs in jeder Kategorie anzeigt.</li>
</ol>

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</ol>

Die Autoren haben erklärt, dass keine konkurrierenden Interessen bestehen.

Der EdU-Einbau und seine anschließende "Klick"-Reaktion mit zellpermeablem Azid stellen praktische Vorteile dieser Technik gegenüber der zuvor verwendeten BrdU-Methode dar7. Diese Reaktion wird jedoch durch Cu(I)-Ionen katalysiert, und mehrere Farbstoffe können in Gegenwart dieses Kupferkatalysators instabil sein, wie es vom Hersteller des Click-it EdU-Kits eindeutig empfohlen wird. Wenn nach der Ausführung des EdU-Nachweisschritts Immunfärbungsexperimente durchgeführt wurden, wurde die erwartete ...

Der Zellteilungszyklus umfasst eine G1-Phase (erste Gap-Phase), eine replikative/S-Phase, eine G2-Phase (zweite Gap-Phase) und eine M-Phase (mitotic). Durch diese Phasen durchläuft die Zelle dramatische Veränderungen in der zellulären Transkription, Translation und Reorganisation der Zytoskelettmaschinerie1,2. Als Reaktion auf Entwicklungs- und Umwelteinflüsse können Zellen vorübergehend aufhören, sich zu teilen und ruhen (G0) oder sich differenzieren und dauerhaft aufhören, sich zu teilen3. Andere Szenarien, wie DNA-Schäden, können eine vorzeitige Differenzierung oder Apoptose verursachen3,4. Die Reaktion auf solche Hinweise wird durch Zellzyklus-Checkpoints vermittelt, die als Überwachungssystem fungieren, um die Integrität wesentlicher zellulärer Prozesse sicherzustellen, bevor sich die Zelle zur nächsten Phase des Teilungszyklusverpflichtet 5. Daher müssen Studien zu Genen, die die DNA-Replikation, Checkpoints und mitotische Maschinerie regulieren, mögliche Zellzyklus-Progressionsfehler analysieren, die in mutierten Zellen oder beim siRNA-Knockdown dieser Gene auftreten können. Darüber hinaus können solche Analysen verwendet werden, um die allgemeine Zellgesundheit sowie zelluläre Reaktionen auf eine medikamentöse Behandlung zu testen.
5-Brom-2'-desoxyuridin (BrdU) ist ein Thymidin-Analogon, das während der Replikation in die DNA eingebaut wird6. Diese Methode wurde ausgiebig verwendet, um Zellen in der S-Phase zu identifizieren. Die Zellen werden dann jedoch harten DNA-Denaturierungsverfahren unterzogen, um den Nachweis von BrdU durch die Verwendung von Anti-BrdU-Antikörpern zu ermöglichen6. Diese harte Behandlung kann zelluläre Epitope schädigen und eine weitere Charakterisierung der Probe durch Immunfärbung verhindern. Der Einbau von EdU und der anschließende Nachweis durch eine kupferkatalysierte "Klickreaktion" mit kleinen, zelldurchlässigen, fluoreszierend markierten Azidfarbstoffen macht harte Denaturierungsverfahrenüberflüssig 7. Diese Methode erwies sich daher als praktischere Alternative zur BrdU-Gründung.
Darüber hinaus wurde pH3 als zuverlässiger Marker für Mitotik/M-Phasenzellen beschrieben8. Histon H3 ist ein DNA-assoziiertes Kern-Histonprotein, das in der späten G2-Phase bis zur frühen M-Phase phosphoryliert und gegen Ende der Anaphase8dephosphoryliert wird. Mehrere kommerzielle Antikörper können verwendet werden, um pH3 mit Standard-Immunfärbungsprotokollen nachzuweisen. Eine Doppelfärbung von EdU und pH3 würde daher den Nachweis von Zellen sowohl in der S-Phase als auch in der M-Phase ermöglichen. Darüber hinaus würden Zellen in der G1- und frühen G2-Phase für keinen der Marker positiv färben.
Drosophila neurale Stammzellen oder Neuroblasten (NBs) bieten ein gut charakterisiertes Stammzellmodell, bei dem sich Zellen asymmetrisch teilen, um eine identische selbsterneuernde NB und eine Ganglien-Mutterzelle (GMC) zu produzieren, die zur Differenzierung bestimmt ist9. Darüber hinaus machen mehrere genetische Werkzeuge und NB-spezifische Antikörper dieses System für die genetische Manipulation und Lebendzellbildgebung geeignet. Folglich haben mehrere Studien NBs verwendet, um Gene zu untersuchen, die asymmetrische Divisionen und die Bestimmung des Zellschicksals regulieren9. Verschiedene Populationen von NBs existieren im zentralen Gehirn (CB) und im Optikuslappen (OL) des Larvengehirns9; Für die aktuelle Studie wurden CB-NBs verwendet. Diese CB-NBs der Larven im dritten Stadium sind große Zellen, die sich auch für die Untersuchung von Faktoren eignen, die die mitotische Spindelmontage regulieren. Ein Protokoll zur Analyse von Zellzyklus-Progressionsfehlern wäre ein wichtiges Werkzeug in solchen Studien.
In früher veröffentlichten Protokollen wurden kommerzielle Kits wie das Click-iT EdU Alexa Fluor Cell Proliferation Kit verwendet, das mehrere Reaktionskomponenten und Azidfarbstoffe enthält, die mit einer Vielzahl von Alexa Fluor-Farbstoffen für die EdU-Einarbeitung und -Detektion gekennzeichnet sind10. Die mit solchen Kits gelieferten Reagenzien sind jedoch nicht mit einigen fluoreszierenden Tags kompatibel, die häufig mit sekundären Antikörpern verwendet werden. Dieses EdU-Nachweiskit (Click-iT EdU Alexa Fluor Cell Proliferation Kit im Lieferumfang von Alexa Fluor 647-konjugiertem Azidfarbstoff) wurde in Drosophila Larven-NPBs im dritten Stadium getestet, und die Co-Färbung wurde mit Antikörpern gegen pH3 und Miranda, einem Marker für NBs, versucht. Darüber hinaus wurden Alexa Fluor 568- oder Cy3-markierte sekundäre Antikörper zum Nachweis der Miranda-Markierung auf der Plasmamembran von NBs11verwendet. Die erwartete Signalintensität und das Färbemuster (unveröffentlichte Ergebnisse) wurden jedoch nicht mit diesen sekundären Antikörpern beobachtet, wenn nach dem EdU-Nachweis eine Immunfärbung durchgeführt wurde.
Für die EdU-Einarbeitung erforderte das von Daul und Kollegen beschriebene Protokoll die Fütterung der Larven mit Kankel-White-Medium gemischt mit EdU und Bromphenolblau (BPB)10. Die Larven ernährten sich von der EdU- und BPB-stacheligen Nahrung, die bei der Einnahme im Larvendarm an ihrer blauen Farbe zu erkennen war. Obwohl diese Methode für den EdU-Einbau in Mms19 Loss-of-Function (Mms19P) Larven im dritten Stadium verwendet wurde, haben sich die Mms19P-Larven offenbar nicht verfüttert, da im Larvendarm kaum eine blaue Farbe nachgewiesen wurde (unveröffentlichte Ergebnisse). Die Mms19P-Larven zeigen drastische Entwicklungsdeformitäten und verhaften schließlich im dritten Stadium des Stadiums. Dies kann das Fressverhalten der Larven im dritten Stadium irgendwie beeinflussen und das EdU-Fütterungsprotokoll für solche Fälle ungeeignet machen.
Nach dem Studium der verfügbaren Literatur und der umfangreichen Arbeit an der Standardisierung wesentlicher Schritte wurde ein alternativer Ansatz für die EdU/pH3-Doppelmarkierung in Drosophila-NBs vorgeschlagen, die keine Fütterung von EdU an Larven erfordert. Eine frühere Studie verwendete eine duale EdU / pH3-Färbung, um den Zellzyklus in NBs zu analysieren, präsentierte jedoch kein detailliertes Protokoll4. Dies stellt eine unnötige Hürde für Labore dar, die versuchen, diese Methode zu implementieren. Darüber hinaus kann die Bewertung der Kompatibilität verschiedener Reagenzien mit dem EdU-Kit und die Durchführung weiterer Optimierungen ein zeitaufwändiger Prozess sein. Dieses Papier stellt ein Schritt-für-Schritt-Protokoll vor, das den Einbau von EdU in sezierte Larvengehirne und die Immunfärbung mit Anti-pH3-Antikörpern abdeckt, gefolgt von konfokaler Mikroskopie und Bildanalyse, um NBs vier verschiedenen Kategorien zuzuordnen: G0 / G1-Phase, S-Phase, S>G2 / M (Progression von S zu G2 / M) und M-Phase. Die zu optimierenden Schritte werden beschrieben und Tipps für die Bildanalyse großer Datensätze gegeben. Zusätzlich wird die EdU/pH3-Anzeige in Wildtyp-NBs analysiert und mit Mms19 P-NBs verglichen, von denen kürzlich berichtet wurde, dass sie eine Zellzyklusverzögerung zeigen11.

<table><tbody><tr><td>fly stocks</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>P{EPgy2}Mms19EY00797/TM3, Sb1 Ser1 (Mms19p)</td><td>Bloomington stock center</td><td>#15477</td><td>P-Element-Insertion im dritten Exon von Mms19</td></tr><tr><td>&nbsp;+; Mms19::eGFP, Mms19p</td><td>Erzeugt im eigenen Haus</td><td></td><td>eGFP-markiertes Mms19-Protein, exprimiert in Mms19p Hintergrund</td></tr><tr><td>w1118</td><td>Bloomington stock center</td><td>#3605</td><td>Wildtyp-Stamm (w;+;+)</td></tr><tr><td>Primärantikörper</td><td></td><td></td><td>Verdünnung</td></tr><tr><td>Ratte anti-Miranda</td><td>Abcam</td><td>Ab197788</td><td>1/250</td></tr><tr><td>Kaninchen anti-pH3</td><td>Zellsignalisierung</td><td>9701</td><td>1/200</td></tr><tr><td>Sekundäre Antikörper</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Ziege Anti-Ratte Cy3</td><td>Jackson Immuno</td><td>112-165-167</td><td>1/150</td></tr><tr><td>Ziege Anti-Ratte Alexa Fluor 568</td><td>Invitrogen</td><td>A11077</td><td>1/500</td></tr><tr><td>Ziege Anti-Kaninchen Alexa Fluor 488</td><td>Invitrogen</td><td>A27034</td><td>1/500</td></tr><tr><td>Reagenz/Kit</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Aqua Poly/Mount Montagemedium</td><td>Polysciences Inc</td><td>18606-20</td><td></td></tr><tr><td>Click-it EdU Einbausatz, Alexa Flour 647</td><td>Thermo Fischer Scientific</td><td>C10340</td><td></td></tr><tr><td>Schneider' s Drosophila medium</td><td>Thermo Fischer Scientific</td><td>21720-024</td><td></td></tr><tr><td>Rinderserumalbumin (BSA)-Fraktion V</td><td>Merck</td><td>10735078001</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Fischer Scientific</td><td>9002-93-1</td><td>nichtionisches Detergens</td></tr><tr><td>Software</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Fiji (Imagej)</td><td>https://imagej.net/Fiji</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Leica Application Suite (LAS X)</td><td>Leica microsystems</td><td></td><td></td></tr><tr><td>PRISM</td><td>Graph Pad Software</td><td>Version 5</td><td></td></tr><tr><td>Microsoft Excel</td><td>Microsoft Office</td><td>2016</td><td></td></tr><tr><td>Equipment</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Leica TCS SP8 konfokales Laser-Scanning-Mikroskop mit 63-facher Ölimmersion, 1,4 NA Plan-Apochromat-Objektiv</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Materials</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Aqua Poly/Mount Eindeckmedium</td><td></td><td></td><td>wasserlösliches, nicht fluoreszierendes Eindeckmedium</td></tr><tr><td>Pyrex 3 oder 9 Unterdruck Glasspotplatte Whatman Filterpapier</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

5-ethynyl-2'-desoxyuridin/phospho-histon h3 dual-labeling protocol for cell cycle progression analysis in drosophila neural stem cells

5-Ethynyl-2'-Deoxyuridine/Phospho-Histone H3 Dual-Labeling Protocol for Cell Cycle Progression Analysis in Drosophila Neural Stem Cells

Die In-vivo-Analyse der Zellzyklusprogression wird routinemäßig in Studien an Genen durchgeführt, die mitose- und DNA-Replikation regulieren. 5-Ethynyl-2'-desoxyuridin (EdU) wurde verwendet, um die replikative / S-Phasenprogression zu untersuchen, während Antikörper gegen Phospho-Histon H3 verwendet wurden, um mitotische Kerne und Zellen zu markieren. Eine Kombination beider Markierungen würde die Klassifizierung der Phasen G0/G1 (Gap Phase), S (replikativ) und M (mitotisch) ermöglichen und als wichtiges Instrument zur Bewertung der Auswirkungen von mitotischen Gen-Knockdowns oder Nullmutanten auf den Zellzyklusverlauf dienen. Die Reagenzien, die zur Markierung von EdU-markierten Zellen verwendet werden, sind jedoch mit mehreren sekundären Antikörper-Fluoreszenz-Tags nicht kompatibel. Dies erschwert die Immunfärbung, bei der primäre und markierte sekundäre Antikörper verwendet werden, um pH3-positive mitotische Zellen zu markieren. Dieses Papier beschreibt ein Schritt-für-Schritt-Protokoll für die duale Markierung von EdU und pH3 in Drosophila-Larven-Neuralstammzellen, einem System, das umfassend zur Untersuchung mitotischer Faktoren verwendet wird. Zusätzlich wird ein Protokoll für die Bildanalyse und Quantifizierung bereitgestellt, um markierte Zellen in 3 verschiedene Kategorien zuzuordnen, G0 / G1, S, S >G2 / M (Progression von S nach G2 / M) und M-Phasen.

Das zweilappige Drosophila-Larvengehirn im dritten Stadium wurde als Modellsystem zur Untersuchung grundlegender Zellulärer und Entwicklungsprozesse verwendet9. Der Fokus der aktuellen Studie lag auf der Präsentation eines Protokolls zur Analyse der Zellzyklusprogression in EdU- und pH3-markierten NBs der CB-Region (Abbildung 1). Die CB-NBs werden in Typ I und Typ II unterteilt und weisen das charakteristische asymmetrische Teilungsmuster9 a...

Die Zellzyklusanalyse mit 5-Ethynyl-2'-desoxyuridin (EdU) und Phospho-Histon H3 (pH3) Markierung ist ein mehrstufiges Verfahren, das eine umfangreiche Optimierung erfordern kann. Hier stellen wir ein detailliertes Protokoll vor, das alle Schritte für dieses Verfahren einschließlich Bildanalyse und Quantifizierung beschreibt, um Zellen in verschiedenen Zellzyklusphasen zu unterscheiden.

5-Ethynyl-2'-Desoxyuridin/Phospho-Histon H3 Dual-Labeling Protocol for Cell Cycle Progression Analysis in Drosophila Neural Stem Cells

In vivo cell cycle progression analysis is routinely performed in studies on genes regulating mitosis and DNA replication. 5-Ethynyl-2'-deoxyuridine (EdU) ...

In diesem Protokoll geben wir nicht nur eine detaillierte Erklärung zu jedem Schritt der EDU-Integration und Immunfärbung, sondern erklären auch die Bildaufnahme, Bildverarbeitung und geben einige Tipps zur Analyse großer Datensätze. Diese Technik ermöglicht die Zuordnung von Zellen in G1-, S- und M-Phasen. Dies wird besonders nützlich für die Zellzyklusanalyse von Studien über Nicht-Mutationen sein, die mitotische Gene betreffen.Wir würden erwarten, dass Menschen zwei bis drei Monate kämpfen, wenn sie keine Vorkenntnisse oder Erfahrungen mit dieser Technik haben. Fügen Sie zunächst Schneiders Dissektionsmedium oder SM zu zwei aufeinanderfolgenden Vertiefungen einer Glanzfleckplatte hinzu und fügen Sie PBS zur nachfolgenden Vertiefung hinzu. Pflücken Sie mit einer Pinzette wandernde Larven im dritten Stadium und legen Sie sie auf ein mit PBS rattertes Gewebe, um Fliegennahrungsrückstände zu entfernen.Platzieren Sie die Larve in der Depression mit PBS, gefolgt von der aufeinanderfolgenden Depression, die SM enthält. Als nächstes unter einem Dissektionsmikroskop verwenden Sie eine feine Pinzette, um drei Viertel des Unterkörpers der Larve zu entfernen. Greifen Sie dann vorsichtig die Larvenmaulhaken mit einer Pinzette und halten Sie die Nagelhaut des anderen Endes mit der anderen Pinzette. Drehen Sie den Larvenkopf von innen nach außen, indem Sie die Mundhaken nach innen drücken und gleichzeitig das Gewebe am anderen Ende abziehen.Beobachten Sie das Larvengehirn mit angeschlossenen imaginären Bandscheiben. Entfernen Sie andere Gewebe, die am Gehirn befestigt sind, und übertragen Sie das Gehirn auf die nachfolgende aufeinanderfolgende Depression mit SM. Fügen Sie 100 Mikroliter 100 mikromolare EDU SM-Lösung zu einer anderen Vertiefung auf der Pyrexplatte hinzu und inkubieren Sie etwa 5 bis 10 sezierte Gehirne in dieser Lösung für 2 Stunden bei 25 Grad Celsius. Nach der Fixierung und Immunfärbung entfernen Sie PBST und fügen Sie den EDU-Erkennungscocktail zu den sezierten Gehirnen hinzu.Dann inkubieren Sie sie bei Raumtemperatur im Dunkeln auf einem Neutater. Nach 30 Minuten waschen Sie die Proben zweimal mit PBST für 10 Minuten pro Wäsche im Dunkeln. Bereiten Sie für die DNA-Färbung 5 Mikrogramm pro Milliliter Hoechst 33342-Lösung vor.Entfernen Sie PBST nach der zweiten Wäsche und geben Sie 500 Mikroliter der Hoechst-Lösung zu den sezierten Gehirnen, dann inkubieren Sie sie im Dunkeln. Nach 10 Minuten den Hoechst entfernen und die Proben 10 Minuten lang mit PBST waschen. Tippen Sie mit der Röhre auf die Laborbank und lassen Sie das Gehirn zur Ruhe kommen.Entfernen Sie das PBST aus der Röhre und lassen Sie 50 bis 100 Mikroliter zurück. Schneiden Sie das Ende einer 200 Mikroliter-Mikropipet-Spitze ab und übertragen Sie damit das Gehirn auf einen sauberen Glasobjektträger. Entfernen Sie Access PBST von der Folie, indem Sie sie mit Filterpapierstreifen löschen.Lassen Sie das Filterpapier nicht das Gehirn berühren. Geben Sie einen Tropfen eines wasserlöslichen, nicht fluoreszierenden Montagemediums auf das Gehirn und richten Sie das Gehirn so aus, dass der ventrale Nervenstrang dem Objektträger zugewandt ist und die Lappen nach oben zeigen. Ordnen Sie die Gehirne in einer einzigen Datei an, so dass es einfacher ist, die Gehirne seriell abzubilden.Legen Sie vorsichtig einen Deckverschluss auf das Gehirn und inkubieren Sie den Rutsch über Nacht bei 2 bis 6 Grad Celsius. Wählen Sie aus der Erfassungssoftware das 63-fache Ziel aus. Geben Sie einen Tropfen Tauchöl auf den Deckzettel direkt über den montierten Gehirnen, um das Gewebe durch das Okular leichter zu lokalisieren.Mit dem dappy Hoechst 33342 Kanal, finden Sie das Gehirn durch das Okular und wechseln Dann in den Erfassungsmodus in der Software. Richten Sie 4 Kanäle ein, um Hoechst 33342, Alexa Floor 4 8 8, Alexa Floor 5 6, 8 und Alexa Floor 6 4 7 abzubilden. Verwenden Sie das Farbstoffassistent-Tool, um die ausgewählten Farbstoff-Anregungslaser und Emissionsfilter automatisch einzurichten.Stellen Sie das Sichtfeld so ein, dass es den gesamten Gehirnlappen umfasst. Stellen Sie sich das gesamte Volumen des Gehirnlappens vor, indem Sie diese Steuer im Abstand von 0,8 Mikrometern erfassen. Speichern Sie alle Bilder aus einer Imaging-Sitzung in einem dot L I F-Bibliotheksformat.Und überwachen Sie die Miranda-markierten Neuroblasten, die als große runde Zellen in der zentralen Hirnregion erscheinen. Zeichne eine Region von Interesse mit dem Ellipsenwerkzeug über jeden Neuroblasten, um zu vermeiden, dass der Neuroblast zweimal gezählt wird. Wählen Sie in der Menüleiste von Image J die Option Analyze, Tools und ROI Manager aus.Markieren Sie alle Neuroblasten im aktuellen Z-Abschnitt und drücken Sie T, nachdem Sie jede Zelle markiert haben. Sobald alle Neuroblasten im aktuellen Z-Abschnitt markiert sind, ändern Sie die Kanäle auf pH3 und EDU und zählen Sie manuell die Anzahl der EDU-positiven Neuroblasten, pH3-positiven Neuroblasten, EDU- und pH3-positiven Neuroblasten und Neuroblasten, die für keinen Marker färben. Suchen Sie nach Neuroblasten und nachfolgenden Z-Abschnitten, löschen Sie alte ROIs und fügen Sie neue ROIs hinzu, um Neuroblasten in verschiedenen Stacks zu zählen.Bereiten Sie eine Tabelle vor und berechnen Sie den Prozentsatz der Neuroblasten, die in allen vier Kategorien für jeden Lappen vorhanden sind. Bereiten Sie mit der Tabellenkalkulationssoftware ein Balkendiagramm vor, das die Pooldaten für den Prozentsatz der Neuroblasten in jeder Kategorie anzeigt. Zentralhirn-Neuroblasten aus Larvenhirnen des dritten Stadiums, die mit Miranda, EDU und pH3 markiert sind, sind hier dargestellt.Die Zellen wurden den Phasen G1/G0, S, SG2/M und M zugeordnet. In der EDU-pH3-Analyse wurde ein signifikant höherer Anteil von MMS19-Funktionsverlust-Neuroblasten in der M-Phase im Vergleich zu Wildtyp-Neuroblasten gefunden. Die MMS19:eGFP-Expression im MMS19-Funktionsverlusthintergrund rettete den Anteil der Zellen in der M-Phase auf Wildtypniveau.Es ist wichtig, keine beschädigten Gehirne für nachfolgende Schritte zu verwenden. Und ED-Lösung sollte frisch zubereitet werden, bevor mit der Dissektion begonnen wird. Dieses Asset kann als schnelles erstes Screening verwendet werden, um Defekte in bestimmten Zellzyklusphasen zu identifizieren.Darauf könnte dann eine detailliertere Analyse einer bestimmten Phase folgen.

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Research

Forschung

JoVE Journal

Biology

Biologie

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5-Ethynyl-2'-Desoxyuridin/Phospho-Histon H3 Dual-Labeling Protocol for Cell Cycle Progression Analysis in Drosophila Neural Stem Cells

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