In-vitro-Beurteilung der kardialen Reprogrammierung durch Messung des kardialspezifischen Calciumflusses mit einem GCaMP3-Reporter
22. Februar 2022
Wir beschreiben hier die Einrichtung und Anwendung einer Tg(Myh6-cre)1Jmk/J /Gt(ROSA)26Sortm38(CAG-GCaMP3)Hze/J (unten als αMHC-Cre/Rosa26A-Flox-Stop-Flox-GCaMP3 bezeichnet) Maus-Reporterlinie zur Beurteilung der kardialen Reprogrammierung. Neonatale kardiale Fibroblasten (NCFs), die aus dem Mausstamm isoliert wurden, werden in induzierte Kardiomyozyten (iCMs) umgewandelt, was eine bequeme und effiziente Bewertung der Reprogrammierungseffizienz und der funktionellen Reifung von iCMs über den Calcium(Ca2+<
Die in diesem Protokoll beschriebenen Methoden bieten eine wertvolle Plattform, um die funktionelle Reifung von ICMs für kardiale Reprogrammierungsstudien zu bewerten. Der Kalziumfluss wird ausschließlich in ICMs beobachtet und bietet eine Möglichkeit, die funktionelle Reifung des ICM zu bewerten. Dieser Mausstamm vereinfacht die Auswertungsverfahren und erhöht die Reproduzierbarkeit der Ergebnisse.
Dieses Protokoll ist eine neue Methode zur Bewertung der funktionellen Reifung von ICMs im Bereich der kardialen Reprogrammierung. Es kann auch angewendet werden, um die Kardiomyozytendifferenzierung und die Herzfunktion zu bewerten. Beginnen Sie mit der Gewinnung von acht bis 10 Welpen, P0 bis P2 Welpen, um 10 Millionen neonatale Herzfibroblasten oder NCFs zu isolieren.
Betäuben Sie die Welpen tief durch Unterkühlung. Beobachten Sie die Herzen unter dem Fluoreszenzmikroskop, um sicherzustellen, dass das Herz mit dem gewünschten Genotyp einen Kalziumfluss aufweist, der durch GCaMP3 bei schlagendem Herzen angezeigt wird. Die anderen Genotypen zeigen keine Fluoreszenz.
Nach der Isolierung der Herzen schneiden Sie sie in vier Teile, so dass sie lose verbunden sind. Waschen Sie sie mehrmals gründlich in eiskalter Dulbecco-phosphatgepufferter Kochsalzlösung (DPBS) in einer sechs Zentimeter großen Platte, um die Verschmutzung der Blutzellen in den isolierten Zellen zu begrenzen. Verdauen Sie die Herzen mit acht Millilitern warmem 0,25% Trypsin-EDTA in 37 Grad Celsius für 10 Minuten.
Verwerfen Sie den Trypsin-Überstand und fügen Sie fünf Milliliter von 0,5 Milligramm pro Milliliter warmer Typ-Zwei-Kollagenase in Hanks ausgewogene Salzlösung hinzu. Die Mischung gründlich vortreiben und bei 37 Grad Celsius fünf Minuten lang inkubieren. Nach der Inkubation erneut die Mischung gründlich wirbeln und das unverdaute Gewebe durch schwerkraft absetzen lassen.
Sammeln Sie den Überstand in einem konischen 15-Milliliter-Rohr mit fünf Millilitern kaltem Fibroblastenmedium. Verdünnen Sie die Zellen mit Fibroblastenmedium so, dass die Aussaatdichte etwa bei zwei bis 2,5 mal 10 bis zu den vierten Zellen pro Kubikzentimeter liegt. Dann säen Sie die Zellen in Schalen oder Tellern.
Die angeschlossenen Fibroblasten sollten am zweiten Tag nach der Aussaat eine ovale bis runde Form haben. Am Tag Null säen Sie die NCFs auf die Dichte von etwa ein bis zwei mal 10 bis zu den vierten Zellen pro Kubikzentimeter im Fibroblastenmedium. Ersetzen Sie am ersten Tag das Kulturmedium durch ein virushaltiges Medium für jeden Brunnen wie gewünscht.
Ersetzen Sie am Tag 2, 24 Stunden nach der Virusinfektion, das virushaltige Medium durch ein normales ICM-Medium. Beurteilen Sie den Calciumionenfluss mit einem inversen Fluoreszenzmikroskop bei Raumtemperatur. Beobachten Sie die GCaMP3-positiven Zellen unter dem 10X-Objektiv und stellen Sie sicher, dass spontane Zellen im Hellfeldkanal schlagen.
Herzen mit dem richtigen Genotyp zeigten einen Kalziumionenfluss, der mit dem Schlagen synchronisiert war, visualisiert als GCaMP3-Fluoreszenz. Während keine Fluoreszenz in Kontrollherzen beobachtet wurde. Isolierte NCFs befestigten sich innerhalb von zwei Stunden an der Vertiefung und zeigten einen Tag nach der Aussaat eine ovale bis runde Form.
Die Calciumionenoszillation zeigte eine GCaMP3-Fluoreszenzänderung zwischen dem Maximum und dem Minimum und die Calciumionenoszillation solcher Zellen veränderte sich periodisch. Nach der Einführung von IMAP war die Anzahl der schlagenden Cluster signifikant höher als in der kontrollierten Gruppe, da die Anzahl der GCaMP3-positiven Zellen mit Calciumionenfluss für ein hohes Leistungsfeld in der mittelbehandelten IMAP-Gruppe erhöht war. NCFs sollten frisch zubereitet und nach der Isolierung gesund sein.
Ein schnelles Verfahren der Herzisolierung, des Schneidens und der richtigen Verdauungszeit kann dazu beitragen, eine Verringerung der Lebensfähigkeit und des Zustands der Zellen zu vermeiden. Diese Methode bietet eine Möglichkeit, funktionell ausgereifte ICMs für Forscher der kardialen Reprogrammierung zu identifizieren. Mit mehreren weiteren Auswertungsmethoden kann man ein prägnanteres Verständnis über funktional ausgereifte ICMs erlangen.
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Übersicht
Dieser Artikel stellt eine neuartige Maus-Stammzelllinie, αMHC-Cre/Rosa26A-Flox-Stop-Flox-GCaMP3, zur Beurteilung der kardialen Reprogrammierung vor. Das etablierte Protokoll ermöglicht die Bewertung induzierter Kardiomyozyten (iCMs), die aus neonatalen kardialen Fibroblasten (NCFs) stammen, mittels Analyse des Kalziumflusses.
Wesentliche Studienkomponenten
Bereich der Wissenschaft
- Kardiale Reprogrammierung
- Induzierte Kardiomyozyten
- Calcium-Fluss-Analyse
Hintergrund
- Das αMHC-Cre/Rosa26A-Flox-Stop-Flox-GCaMP3-Mausmodell erleichtert die kardiale Forschung.
- Neonatale kardiale Fibroblasten können effizient in iCMs umgewandelt werden.
- Der Kalziumfluss dient als wichtiger Indikator für die funktionelle Reifung von iCMs.
- Diese Methode verbessert die Reproduzierbarkeit von Studien zur kardialen Umprogrammierung.
Zweck der Studie
- Etablierung einer zuverlässigen Plattform zur Beurteilung der funktionellen Reifung von iCMs.
- Vereinfachung der Evaluierungsverfahren in der Forschung zur kardialen Reprogrammierung.
- Gewinnung von Erkenntnissen zur Differenzierung von Kardiomyozyten und zur Herzfunktion.
Verwendete Methoden
- Isolierung neonataler kardialer Fibroblasten aus P0 bis P2 Welpen.
- Umwandlung von NCFs in induzierte Kardiomyozyten.
- Beurteilung der funktionellen Reifung mittels Kalziumflussmessung.
- Bewertung der Reprogrammierungs-Effizienz und kardialer Funktion.
Hauptergebnisse
- Erfolgreiche Umwandlung von NCFs in funktionelle iCMs.
- Kalziumfluss, der ausschließlich in iCMs beobachtet wird, weist auf Reifung hin.
- Verbesserte Reproduzierbarkeit der Ergebnisse in Studien zur kardialen Reprogrammierung.
- Protokoll zur Bewertung der Differenzierung von Kardiomyozyten anwendbar.
Schlussfolgerungen
- Das αMHC-Cre/Rosa26A-Flox-Stop-Flox-GCaMP3-Mausmodell ist ein wertvolles Werkzeug.
- Die Analyse des Kalziumflusses eignet sich zur Beurteilung der Reifung von iCMs.
- Diese Methode kann die Forschung zur Herzzellreprogrammierung und -funktion voranbringen.
Häufig gestellte Fragen
Aussagekräftige Bedeutung für die Industrie
Die Beurteilung der funktionellen Reifung induzierter Kardiomyozyten stellt weiterhin eine entscheidende Engstelle bei der kardialen Umdifferenzierung für regenerative Therapien dar. Dieses Protokoll bietet einen direkten, berichterstattenden Nachweis des Kalziumflusses, der eine objektive Bewertung der funktionellen Reife von iCM ermöglicht und die Validierung von Zielstrukturen sowie die mechanistische Risikominderung in der frühen Entdeckungsphase unterstützt. Durch die Verknüpfung der transkriptionellen Umdifferenzierung mit funktionellen elektrophysiologischen Ausgangssignalen verbessert es die Vorhersagesicherheit in präklinischen Modellen und leitet Portfolioentscheidungen zu Strategien der Herzwiederherstellung ein.
Strategische Anwendungen in der Biopharma-Forschung und -Entwicklung
Frühe Entdeckung und Zielvalidierung
- Wissenschaftlicher Wert: Ermöglicht die Überprüfung therapeutischer Hypothesen, indem die Zuteilung von Transkriptionsfaktoren (MGT) mit funktionellen Calciumtransienten in reprogrammierten Zellen verknüpft wird.
- Operativer Wert: Nutzt die GCaMP3-Fluoreszenz, um erfolgreich reprogrammierte iCMs anzureichern, wodurch die Abhängigkeit von indirekten Markern wie Genexpression verringert wird.
- Prädiktiver Wert: Der Calciumfluss dient als funktioneller Biomarker, der die biologische Entlastung von Risiken und das Vertrauen in Zielstrukturen bei Ansätzen zur Herzmuskelreprogrammierung unterstützt.
Screening und Assay-Entwicklung
- Assay-Bereitschaft: Etabliert eine standardisierte, fluoreszenzbasierte Plattform zur Quantifizierung des Calcium-Flusses als quantitative abhängige Variable in Reifungsassays für induzierte Kardiomyozyten (iCMs).
- Reproduzierbarkeit: Die Reporter-Mauslinie gewährleistet eine konsistente Detektion funktioneller iCMs über verschiedene Experimente hinweg und unterstützt die Standardisierung des Assays.
- Skalierbarkeit: Kompatibel mit Fluoreszenzmikroskopie und an höhere Durchsatzbildgebungssysteme anpassbar, um die Reprogrammier-Effizienz im Hochdurchsatzscreening zu bewerten.
Translationale und präklinische Forschung
- Krankheitsrelevanz: Bietet ein krankheitsrelevantes System, um die funktionelle Reifung von iCMs in vitro zu bewerten, und schlägt eine Brücke von der Entdeckung zur präklinischen Validierung.
- Translationaler Kontinuität: Ermöglicht die longitudinale Beurteilung der Reifung induzierter Herzmuskelzellen von frühen Reprogrammierungsstadien bis hin zur funktionellen elektrophysiologischen Kompetenz.
- Mechanistische Ent风险评估: Kalziumfluss-Messungen helfen, strukturell umprogrammierte Zellen von funktionell reifen iCMs zu unterscheiden und verringern falsch-positive Ergebnisse.
Pipeline- und Workflow-Integration
Die Methode fügt sich in den Entdeckungsprozess von der Target-Validierung über die Lead-Identifizierung bis zur präklinischen Bewertung ein und ermöglicht insbesondere die funktionelle Beurteilung nach transkriptioneller Reprogrammierung, aber vor der Validierung in vivo.
- Entdeckungsbiologie: Unterstützt die Hypothesenprüfung, indem untersucht wird, ob Reprogrammierungsfaktoren nicht nur die Expression von Markern, sondern auch eine funktionelle Kalzium-Regulation induzieren.
- Screening: Bietet bereitgestellte, reproduzierbare biologische Systeme mit quantitativen Messwerten zum Kalziumfluss zur vergleichenden Analyse von Wirkstoffen oder Bedingungen.
- Analytik: Erzeugt fluoreszenzbasierte zeitliche Daten zur Frequenz und Amplitude von Kalziumoszillationen, die einen statistischen Vergleich verschiedener Reprogrammierungsbedingungen ermöglichen.
- Translationale Forschung: Verbindet die Ergebnisse der in-vitro-Reprogrammierung mit funktionellen Kardiomyozyten-Phänotypen, die für präklinische Modelle relevant sind.
- Unternehmensweite Wiederverwendung: Schafft eine wiederverwendbare Reporterplattform, die auf mehrere Zielstrukturen der kardialen Reprogrammierung und Differenzierungsprotokolle anwendbar ist.
Operative und unternehmerische Auswirkungen
- Wissenschaftlicher Wert: Ermöglicht die direkte Messung der funktionellen Reifung und reduziert so mechanistische Unklarheiten bei Reprogrammierungsergebnissen.
- Operationaler Wert: Verbessert Standardisierung und Reproduzierbarkeit durch genetische Reporter-Spezifität und verringert dadurch die Variabilität antennbasierter Methoden.
- Strategischer Wert: Verbessert Entscheidungen über Fortsetzung oder Abbruch, indem molekulare Reprogrammierung mit funktioneller elektrophysiologischer Reife verknüpft wird.
- Portfolio-Wirkung: Ermöglicht eine risikoadjustierte Priorisierung von Reprogrammierungsstrategien basierend auf der funktionalen iCM-Ausbeute und der Qualität der Reifung.
Durchführungsüberlegungen
- Erfordert Fachkenntnisse in der Mauszucht, der Isolierung von Herzmuskelgewebe und der Fluoreszenzmikroskopie.
- Setzt den Zugang zur Mauslinie αMHC-Cre/Rosa26A-Flox-Stop-Flox-GCaMP3 und virale Abgabesysteme für MGT voraus.
- Erfordert standardisierte Kulturbedingungen und zeitliche Abläufe zur konsistenten Induktion von iCMs und Beurteilung des Kalziumflusses.
- Eine Anpassung an alternative Fibroblastquellen oder Spezies könnte eine Validierung der Reporter-Spezifität und der Genauigkeit der Kalziumsignalübertragung erfordern.
- Zu den praktischen Einschränkungen zählen die Abhängigkeit von spontaner Kontraktion zur Visualisierung des Flusses sowie mögliche Variabilität in der Transfektionseffizienz.
Biopharma-FAQs
Chapters in this video
0:04
Introduction
0:53
Isolation and Selection of Neonatal Myh6-Cre/Rosa26A-Flox-Stop-Flox-GCaMP3 Mice Hearts
1:23
Isolation of Neonatal Cardiac Fibroblasts (NCFs)
2:43
Reprogramming NCFs to iCMs with MGT Encoding Retrovirus Infection
3:28
Results: In Vitro Assessment of Cardiac Reprogramming
4:20
Conclusion
